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Bioengineering

उच्च एकाग्रता एकल अणु माइक्रोस्कोपी के लिए शून्य मोड वेवगाइड्स का निर्माण

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां वर्णित शून्य मोड वेवगाइड्स के समानांतर निर्माण के लिए एक नैनोस्फीयर लिथोग्राफी विधि है, जो नैनो-टू माइक्रोमोलर सांद्रता फ्लोरोफोरेस में एकल अणु इमेजिंग के लिए धातु पहने ग्लास माइक्रोस्कोपी कवरलिप में नैनोपेर्चर की सरणी हैं। विधि एक वेवगाइड टेम्पलेट बनाने के लिए कोलाइडियल क्रिस्टल सेल्फ-असेंबली का लाभ उठाती है।

Abstract

एकल अणु फ्लोरेसेंस एंजाइमोलॉजी में, समाधान में लेबल किए गए सब्सट्रेट्स से पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस अक्सर फ्लोरोफोर एकाग्रता को पिको-नैनोमोलर पर्वतमाला तक सीमित करती है, कई शारीरिक लिगामेंट सांद्रता से कम परिमाण के कई आदेश। ऑप्टिकल नैनोस्ट्रक्चर्स को शून्य मोड वेवगाइड्स (जेडएमडब्ल्यू) कहा जाता है, जो एल्यूमीनियम या सोने जैसे पतले संचालन धातु में निर्मित व्यास एपर्चर में 100−200 एनएम हैं, जो दृश्यमान प्रकाश उत्तेजन को ज़ेप्टोलिटर प्रभावी मात्रा तक सीमित करके फ्लोरोफोरस की माइक्रोमोलर सांद्रता पर व्यक्तिगत अणुओं की इमेजिंग की अनुमति देते हैं। हालांकि, महंगे और विशेष नैनोफैब्रिकेशन उपकरणों की आवश्यकता ने जेडएमडब्ल्यू के व्यापक उपयोग को पहले से ही किया है। आमतौर पर, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी का उपयोग करके सीधे लेखन द्वारा जेडएमडब्ल्यू जैसे नैनोस्ट्रक्चर प्राप्त किए जाते हैं, जो अनुक्रमिक और धीमी होती हैं। यहां, कोलाइडियल, या नैनोस्फीयर, लिथोग्राफी का उपयोग वेवगाइड फैब्रिकेशन के लिए नैनोमीटर-स्केल मास्क बनाने के लिए वैकल्पिक रणनीति के रूप में किया जाता है। यह रिपोर्ट प्रत्येक चरण के लिए व्यावहारिक विचारों के साथ दृष्टिकोण का विस्तार से वर्णन करती है । विधि अंतिम तरंगाई व्यास और 100−200 एनएम की गहराई के साथ, समानांतर में हजारों एल्यूमीनियम या सोने के ZMWs बनाने की अनुमति देती है। केवल आम प्रयोगशाला उपकरण और धातु जमा के लिए एक थर्मल वाष्पीकरण की आवश्यकता है। जैव रासायनिक समुदाय के लिए ZMWs को अधिक सुलभ बनाकर, यह विधि सेलुलर सांद्रता और दरों पर आणविक प्रक्रियाओं के अध्ययन को सुविधाजनक बना सकती है।

Introduction

एकल अणु तकनीक जैसे एकल अणु फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एसएमएफआरईटी) या एकल अणु फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) आणविक जैवभौतिकी के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं, जिससे गतिशील आंदोलनों, संरचनाओं और ट्रांसक्रिप्शन1, 2,3,अनुवाद4,5,6,और कई अन्य7जैसी प्रक्रियाओं में व्यक्तिगत जैव अणुओं के अध्ययन की अनुमति मिलती है। SMFRET के लिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी एक आम विधि है क्योंकि समय के साथ कई सीमित अणुओं का पालन किया जा सकता है, और टीआईआर द्वारा उत्पन्न अंधतान तरंग कवरलिप8से सटे 100−200 एनएम क्षेत्र तक सीमित है। हालांकि, यहां तक कि एक्सट्रॉइटेशन वॉल्यूम पर इस प्रतिबंध के साथ, पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंस9के ऊपर एकल अणु संकेतों का पता लगाने के लिए अभी भी पीपीएम या एनएम पर्वतमाला के लिए पतला करने की आवश्यकता है। चूंकि सेलुलर एंजाइमों के माइकलिस-मेंटेन कॉन्स्टेंपंपंटिस आमतौर पर μM से एमएम रेंज10में होते हैं, इसलिए एकल अणु अध्ययनों में जैव रासायनिक प्रतिक्रियाएं आमतौर पर कोशिका की तुलना में बहुत धीमी होती हैं। उदाहरण के लिए, ई. कोलाई11, 12 में प्रोटीन संश्लेषण 15−20 अमीनो एसिड प्रति सेकंड होता है, जबकि एसएमएफईटी प्रयोगों में अधिकांश प्रोकैरियोटिक राइबोसोम 0.1−1 अमीनो एसिड प्रति सेकंड13पर अनुवाद करते हैं। प्रोटीन संश्लेषण में, क्रिस्टल संरचनाओं और रुकी हुई राइबोसोम्स पर smFRET से पता चला है कि ट्रएनए-एमआरएनए ट्रांसलोकेशन चरण14,15से पहले 'हाइब्रिड' और 'शास्त्रीय' राज्यों के बीच स्थानांतरण आरएनए (ट्रानोस) में उतार-चढ़ाव होता है। हालांकि, जब स्थानांतरण GTPase कारक, EF-G, मौजूद था की शारीरिक सांद्रता, एक अलग संरचना, संकर और शास्त्रीय राज्यों के बीच मध्यवर्ती, smFRET 6 मेंमनायागया था । कोशिका में उन लोगों के समान दरों और सांद्रता पर गतिशील आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन महत्वपूर्ण है, लेकिन एक तकनीकी चुनौती बनी हुई है।

फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट एकाग्रता बढ़ाने की रणनीति धातु आधारित, उप-दृश्यमान तरंगदैर्ध्य एपर्चर का उपयोग है, जिसे शून्य मोड वेवगाइड्स (जेडएमडब्ल्यू) कहा जाता है, जो सीमित उत्तेजन क्षेत्रों को उत्पन्न करता है जो अपर्चर16 (चित्रा 1)के भीतर स्थानीय रूप से जैव अणुओं को उत्तेजित करते हैं। एपर्चर आमतौर पर 100−200 एनएम व्यास में और 100−150 एनएम गहराई में17हैं। कुओं के आकार और आकार से संबंधित एक कटऑफ तरंगदैर्ध्य के ऊपर (λसी ≈ 2.3 बार गोलाकार तरंग के लिए व्यास का 2.3 गुना पानी के साथ डाइइलेक्ट्रिक माध्यम18के रूप में), वेवगाइड में किसी भी प्रचार मोड की अनुमति नहीं है, इसलिए शून्य मोड वेवगाइड शब्द। हालांकि, एक दोलन विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र, एक सर्वागीण तरंग कहा जाता है, तीव्रता में तेजी से खस्ताहाल अभी भी तरंग18,19में थोड़ी दूरी पर सुरंगों । यद्यपि टीआईआर एनिवेसेंट तरंगों के समान, जेडएमडब्ल्यू एनिवेसेंट तरंगों में एक छोटा क्षय स्थिर होता है, जिसके परिणामस्वरूप वेवगाइड के भीतर 10−30 एनएम प्रभावी उत्तेजन क्षेत्र होता है। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लिगांड की माइक्रोमोलर सांद्रता में, उत्तेजन क्षेत्र के भीतर केवल एक या कुछ अणु एक साथ मौजूद होते हैं। उत्तेजन की मात्रा और इसके परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस की कमी का यह प्रतिबंध जैविक रूप से प्रासंगिक सांद्रता पर एकल अणुओं के फ्लोरेसेंस इमेजिंग को सक्षम बनाता है। यह कई प्रणालियों20पर लागू किया गया है, जिसमें एकल प्रोटीन प्रसार21के एफसीएस माप, कम आत्मीयता लिगांड-प्रोटीन22 के एकल अणु FRET माप और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन23,और एकल आणविक कारोबार की घटनाओं के स्पेक्ट्रो-इलेक्ट्रोकेमिकल माप24शामिल हैं।

जेडएमडब्ल्यू को आयन बीम मिलिंग25, 26 या इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी (ईबीएल) का उपयोग करके धातु की परत को सीधे पैटर्न करके उत्पादित किया गया है और इसके बाद प्लाज्मा-नक़्क़ाशी16,27। ये मास्कलेस लिथोग्राफी विधियां श्रृंखला में वेवगाइड बनाती हैं और आमतौर पर जेडएमडब्ल्यू तकनीक को व्यापक रूप से अपनाने से रोकने के लिए विशेष नैनोफैब्रिकेशन सुविधाओं तक पहुंच की आवश्यकता होती है। एक अन्य विधि, पराबैंगनी नैनोइमप्रिंट लिथोग्राफी लिफ्ट-ऑफ28,एक स्टैंप जैसी विरोध फिल्म पर एक उलटा ZMW टेम्पलेट दबाने के लिए क्वार्ट्ज स्लाइड मोल्ड का उपयोग करता है। हालांकि इस विधि को अधिक सुव्यवस्थित किया गया है, फिर भी क्वार्ट्ज मोल्ड के निर्माण के लिए ईबीएल की आवश्यकता होती है। यह लेख एक सरल और सस्ती टेम्पलेटेड निर्माण विधि के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसमें ईबीएल या आयन-बीम मिलिंग की आवश्यकता नहीं होती है और यह एक लिथोग्राफिक मास्क बनाने के लिए नैनोस्फीयर की क्लोज-पैकिंग पर आधारित है।

नैनोस्फीयर या "प्राकृतिक" लिथोग्राफी, जिसे पहली बार 1 9 82 में डेकमैन और डनस्मुइर29,30द्वारा प्रस्तावित किया गया था, मोनोडिस्पर्स कॉलोइडल कणों की आत्म-असेंबली का उपयोग करता है, जिसमें दसियों नैनोमीटर से लेकर माइक्रोमीटर31के दसियों तक, नक़्क़ाशी और/या सामग्रियों के जमाव के माध्यम से सतह पैटर्न के लिए टेम्पलेट्स बनाने के लिए। दो आयामी (2डी) या त्रि-आयामी (3 डी) कोलाइडियल कणों की अवधिगत सरणी, जिसे कोलॉयडल क्रिस्टल के रूप में जाना जाता है, को बिखरने और विवर्तन32से उज्ज्वल इंद्रधनुष की विशेषता है। हालांकि इलेक्ट्रॉन-बीम या फोटोलिथोग्राफी की तुलना में कम व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, यह मास्किंग पद्धति सरल, कम लागत है, और आसानी से 100 एनएम से नीचे सुविधा आकार बनाने के लिए नीचे पहुंचा जाता है।

कोलाइडियल कणों की आत्म-असेंबली का निर्देशन सतह पैटर्निंग के लिए मास्क के रूप में कोलाइडियल क्रिस्टल का उपयोग करने की सफलता निर्धारित करता है। यदि कणों का आकार और आकार सजातीय है, तो कोलॉयडल कणों को षट्कोणीय पैकिंग के साथ आसानी से स्वयं इकट्ठा किया जा सकता है, जो एंट्रोपिक कमी33से प्रेरित है। ड्रॉप-कोटिंग के बाद पानी वाष्पीकरण कोलाइडियल कणों को तलछट करने के लिए एक प्रभावी मार्ग है, हालांकि अन्य तरीकों में डिप-कोटिंग34,स्पिन कोटिंग35,इलेक्ट्रोफोरेटिक जमाव36और एयर-वॉटर इंटरफेस37पर समेकन शामिल है। नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल वाष्पीकरण तलछट विधि पर आधारित है, जिसे लागू करने के लिए सबसे सरल था। क्लोज-पैक पॉलीस्टीरिन मोतियों के बीच त्रिकोणीय इंटरस्टिस एक बलि धातु को प्लेट करने के लिए उद्घाटन करते हैं, पोस्ट बनातेहैं (चित्रा 2 और पूरक चित्रा 1)। इस कदम से पहले मोतियों की संक्षिप्त एनीलिंग इन पदों के आकार और व्यास को समायोजित कर देती है। मोतियों को हटा दिया जाता है, पदों के चारों ओर एक अंतिम धातु परत जमा की जाती है, और फिर पदों को हटा दिया जाता है। कोलाइडियल नैनोमास्क पर दो धातु जमाव कदम के बाद, मध्यवर्ती पदों को हटाने, और पासिवेशन और टेदरिंग के लिए सतह रसायन विज्ञान संशोधन, ZMW सरणी एकल अणु इमेजिंग के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं । निर्माण के बाद जेडएमडब्ल्यू ऑप्टिकल गुणों का अधिक व्यापक लक्षण वर्णन एक साथ अनुच्छेद38में पाया जा सकता है। धातुओं के वाष्प जमाव के लिए थर्मल वाष्पीकरण के अलावा, किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है।

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Protocol

नोट: सभी चरणों को सामान्य प्रयोगशाला स्थान में पूरा किया जा सकता है।

1. ग्लास कवरलिप सफाई

  1. कोलाइडियल कणों के वाष्पीकरण के लिए एक साफ सतह प्रदान करने के लिए, सफाई के लिए एक कॉप्लिन ग्लास धुंधला जार के ग्रूव आवेषण के भीतर 24 x 30 मिमी ऑप्टिकल बोरोसिलिटेट ग्लास कवरस्लिप (0.16−0.19 मिमी मोटाई) रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कवर्लिप सीधे खड़े होते हैं और अच्छी तरह से अलग हो जाते हैं ताकि सफाई प्रक्रिया के दौरान सभी सतहों को स्पष्ट रूप से उजागर किया जा सके।
  2. कवरस्लिप को कवर करने के लिए धुंधला जार में पर्याप्त एसीटोन डालें, कवर को रखें, और 40 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
  3. एसीटोन डालें और आसुत एच2ओ के साथ धुंधला जार भरकर कवरस्लिप को कुल्ला करें और पानी डाल दें। 2 बार और दोहराएं।
  4. एसीटोन सोनीशन (चरण 1.2 और 1.3) को एक बार फिर दोहराएं।
  5. 40 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कवरस्लिप और सोनिकेट, कवर को कवर करने के लिए जार में पर्याप्त 200 एमएम कोह डालो।
    नोट: कोह थोड़ा गिलास etches ।
  6. आसुत एच 2 O6बार के साथ कवरस्लिप कुल्ला।
  7. कवरस्लिप को कवर करने के लिए इथेनॉल जोड़ें, ढक्कन जोड़ें, और 40 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
  8. आसुत एच 2 O3बार के साथ कवरस्लिप कुल्ला।
  9. कोमल संदंश का उपयोग कर किनारे पर प्रत्येक कवरस्लिप उठाओ और एन2 गैस के साथ कवरस्लिप सूखी । केवल कवरस्लिप के किनारों को स्पर्श करें। एक व्यक्ति साफ पेट्री डिश में सूखे, साफ कवर्लिप्स में से प्रत्येक को रखें।

2. पॉलीस्टीरिन मोतियों का वाष्पीकरण जमा

  1. जेडएमडब्ल्यू सरणी के लिए कोलाइडियल क्रिस्टल मास्क बनाने के लिए, 1 माइक्रोन व्यास के सेंट्रलाइज 50 माइक्रोन, गैर-कार्यात्मक पॉलीस्टीरिन मोती (पानी में 2.5% डब्ल्यू/वी) 15,000 x ग्राम,5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: मोतियों को पाइप करने से पहले, शेयर समाधान को बोतल के नीचे तक बस जाने की स्थिति में संक्षेप में भंवर होना चाहिए।
  2. सुपरनैंट को त्यागें, जितना संभव हो उतना कम पानी शेष छोड़ दें।
    नोट: अवशिष्ट पानी इथेनॉल पुनर्पिण39के वाष्पीकरण गुणों को बदल सकता है, इसलिए सभी पानी को हटाने के लिए मोतियों की एक छोटी राशि को हटाना स्वीकार्य है।
  3. 1:400 ट्राइटनएक्स-100: इथेनॉल सॉल्वेंट के 50 माइक्रोन में स्टेप 2.2 से मोतियों को फिर से खर्च करें। सॉल्वेंट के साथ मोतियों को अच्छी तरह से मिलाने के लिए कई बार पिपेट अप और डाउन करें।
    नोट: TritonX-100: इथेनॉल विलायक उपयोग के बाद पैराफिन फिल्म के साथ सील किया जाना चाहिए और एक महीने में एक बार ताजा तैयार किया । मोती एक प्लास्टिक पोत के किनारों का पालन करते हैं, जैसे कि एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी मोतियों को पुनः निलंबित किया जाए।
  4. बयान के लिए एक आर्द्रता कक्ष स्थापित करने के लिए, 6 पेट्री व्यंजन रखें, प्रत्येक एक कवरस्लिप के साथ, ढक्कन के साथ एक लाइन में एक बेंच पर थोड़ा अजर छोड़ दिया। प्रत्येक डिश में, कवर्लिप को खुले क्षेत्र में ले जाएं ताकि अगले चरण में आर्द्रता बढ़ने पर कवर्लिप पर्यावरण के संपर्क में आ जाएं।
  5. पेट्री डिश के पीछे केंद्रित एक हाइग्रोमीटर और एक छोटा सा इलेक्ट्रिक फैन रखें।
  6. प्रयोगशाला में शुरुआती सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) रिकॉर्ड करें। ~75 डिग्री सेल्सियस पानी के 150−200 एमएल के साथ 200 एमएल बीकर भरें और इसे पंखे के पीछे रखें।
  7. पंखे को चालू करें और पेट्री व्यंजन, पंखे, बीकर और हाइग्रोमीटर को एक पलट, पारदर्शी प्लास्टिक भंडारण कंटेनर (66 सेमी x 46 सेमी x 38 सेमी) के साथ कवर करें।
  8. चैंबर में आरएच को 70−75% तक बढ़ने दें, जो आमतौर पर 5−10 मिनट लेता है।
    नोट: यदि परिवेश प्रयोगशाला आरएच कम है (~ 50% से नीचे), चैंबर एक उच्च आरएच तक पहुंचने दें, लेकिन 80% से अधिक नहीं, जमाव के दौरान आर्द्रता के नुकसान की भरपाई के लिए (नीचे देखें)।
  9. जब आरएच 70−75% तक पहुंचता है, तो आरएच रिकॉर्ड करें और पेट्री व्यंजनों पर कवर को जल्दी से रखने के लिए प्लास्टिक स्टोरेज कंटेनर को थोड़ा ऊपर उठाएं, जो कवरस्लिप के अधिक गीला होने से रोकता है।
    नोट: आर्द्रीकरण के परिणामस्वरूप कक्ष में तापमान कमरे के तापमान की तुलना में थोड़ा गर्म होगा, आमतौर पर 25−26 डिग्री सेल्सियस। यदि कवरस्लिप पर नमी दिखाई देती है, तो कांच की सतहें बहुत गीली होती हैं। एक वाणिज्यिक दस्ताने बॉक्स प्रोटोकॉल के इस हिस्से को सरल बना सकता है।
  10. बता दें कि चैंबर में आरएच 85% तक बढ़ती रहती है। उस बिंदु पर, आर्द्रता कक्ष में आरएच रिकॉर्ड करें और प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र पर मनका निलंबन के 5 माइक्रोन को पिपेट करें।
  11. आर्द्रता की हानि को कम करने के लिए प्रत्येक बयान के बाद कक्ष और पेट्री व्यंजन बंद करें। 2 मिनट के भीतर सभी 6 बयानों को खत्म करने का लक्ष्य रखें।
  12. बयान के बाद चैंबर में आरएच रिकॉर्ड करें।
    नोट: बयान के बाद आरएच यह गेज करने में मदद करेगा कि बयान के दौरान कितनी तेजी से आर्द्रता खो गई थी, जो परिवेश प्रयोगशाला की स्थितियों पर निर्भर करती है। एक ठेठ सफल रन के लिए, कक्ष बयान से पहले 85% आरएच पर शुरू होगा और बयान के बाद 70−75% आरएच पर समाप्त होगा।
  13. मनका की बूंदों को 5 मिनट तक फैलने और सूखने दें।
    नोट: यदि कोलॉयडल क्रिस्टल में कई छेद या बहुस्तरीय क्षेत्र होते हैं, तो कक्ष क्रमशः बहुत आर्द्र या शुष्क था। पेट्री व्यंजनों को बंद करने और जमाव शुरू करने के लिए सापेक्ष आर्द्रता को समायोजित करें (अनुकूलन की आगे की चर्चा के लिए परिणाम अनुभाग देखें)।

3. कोलाइडियल क्रिस्टल टेम्पलेट में ताकना आकार को कम करने के लिए मनका एनीलिंग

  1. पॉलीस्टीरिन मोतियों की एनीलिंग के लिए एक समान तापमान सतह प्रदान करने के लिए, जो अंतर-मनका इंटरस्टिस को संकुचित करता है और इंटरस्टिस के कोनों को राउंड करता है, एक मानक सिरेमिक गर्म प्लेट के शीर्ष पर एक फ्लैट, मिल्ड एल्यूमीनियम प्लेट रखें।
  2. गर्म प्लेट का तापमान 107 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें, पॉलीस्टीरिन40का ग्लास संक्रमण तापमान।
    नोट: स्थिर और सटीक तापमान प्राप्त करने के लिए, एल्यूमीनियम प्लेट में 2−3 मिमी चौड़े और 4−5 मिमी गहरे छेद में थर्मोकपल जांच आयोजित की गई थी।
  3. 20 एस के लिए गर्म एल्यूमीनियम प्लेट और एनील पर मनका टेम्पलेट युक्त एक कवरस्लिप रखें (पिघलने के समय के स्पष्टीकरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें)।
  4. हीटिंग के बाद, एल्यूमीनियम प्लेट से कवरस्लिप को हटा दें और इसे ठंडा करने के लिए तुरंत इसे दूसरे कमरे के तापमान एल्यूमीनियम सतह पर रखें।
    नोट: यह या तो कवरस्लिप प्लेट या मिल उथले चैनलों के किनारे पर थोड़ा लटका है (साथ वीडियो देखें) थाली में कवरस्लिप की पिकअप की सुविधा के लिए उपयोगी है ।

4. कोलॉयडल क्रिस्टल टेम्पलेट का उपयोग करके एल्यूमीनियम शून्य मोड वेवगाइड का नैनोफैब्रिकेशन

  1. थर्मल या इलेक्ट्रॉन-बीम वाष्पीकरण जमा का उपयोग करके, मोतियों के बीच इंटरस्टिस में पोस्ट उत्पन्न करने के लिए कोलॉयडल क्रिस्टल टेम्पलेट पर 2 Å/s पर तांबे के 300 एनएम जमा करें।
  2. टेप के साथ सतह को धीरे-धीरे दबाकर मोतियों के शीर्ष पर अतिरिक्त धातु निकालें। धीरे-धीरे धातु को खींचने के लिए टेप छील लें।
    नोट: चिंतनशील अतिरिक्त धातु के कुछ छोटे पैच टेप खींचने के बाद रह सकते हैं, और इन अक्सर एन2 गैस की एक धारा से हटाया जा सकता है । यदि प्रतिबिंबित अतिरिक्त धातु के पर्याप्त पैच टेप खींचने के बाद रहते हैं, तो 2 घंटे के लिए टोल्यूईन में टेम्पलेट्स को भिगोने की कोशिश करें ताकि पॉलीस्टीरिन मोतियों को आंशिक रूप से भंग किया जा सके। आसुत पानी के साथ कवरस्लिप धोएं, एन2के साथ सूखें, और टेप पुल दोहराएं। अतिरिक्त भिगोने को मोतियों को पूरी तरह से भंग नहीं करना चाहिए, क्योंकि मोती टेप पुल के दौरान पदों को नुकसान से बचाने में मदद करते हैं।
  3. पॉलीस्टीरिन मोतियों को भंग करने के लिए, मनका टेम्पलेट्स को टोल्यून में रखें और रात भर भिगोएं।
    सावधानी: टोल्यून धुएं विषाक्त हो सकता है। एक अच्छी तरह से हवादार हुड के नीचे टोल्यूईन के साथ काम करें और दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और एक प्रयोगशाला कोट सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। टोल्यून को ज्वलनशील तरल पदार्थ के लिए नामित हवादार अलमारियाँ में संग्रहित किया जाना चाहिए।
  4. टोल्यून इनक्यूबेशन के बाद, क्लोरोफॉर्म के साथ एक बार और इथेनॉल के साथ दो बार टेम्पलेट्स कुल्ला। इस बिंदु पर सावधानी से कवर्लिप को संभालें क्योंकि नाजुक 200−300 एनएम लंबा धातु पोस्ट अब उजागर हो रहे हैं। एन2 के साथ टेम्पलेट्स को सुखाएं और 30 मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा क्लीनर में अवशिष्ट बहुलक और संदूषकों को हटा दें।
    सावधानी: क्लोरोफॉर्म धुएं विषाक्त हो सकते हैं। एक अच्छी तरह से हवादार हुड के नीचे क्लोरोफॉर्म के साथ काम करें और दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और एक प्रयोगशाला कोट सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। क्लोरोफॉर्म को अन्य ज्वलनशील सॉल्वैंट्स से दूर हवादार अलमारियों में संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  5. थर्मल या इलेक्ट्रॉन-बीम वाष्पीकरण जमा का उपयोग करना, 1 Å/s पर एक टाइटेनियम आसंजन परत के 3 एनएम जमा 4 Å/s के आसपास और तांबे के पदों के शीर्ष पर एल्यूमीनियम के 100−150 एनएम के बाद ।
    नोट: कोई भी गहरे गाइड और पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के बेहतर क्षीणन को प्राप्त करने के लिए मोटा क्लैडिंग का उपयोग कर सकता है, लेकिन यह अगले चरण में पदों को उजागर करने और भंग करने के बाद उपज को भी कम कर देता है (चर्चा अनुभाग देखें)।
  6. धातु की चौकियों को भंग करने के लिए, कवरस्लिप को कॉपर एवेंट (साइट्रिक एसिड-आधारित) में भिगोएं; सामग्री की तालिका) 2 घंटे के लिए।
    सावधानी: धातु etchant त्वचा जलता पैदा कर सकता है। एक अच्छी तरह से हवादार हुड के नीचे etchants के साथ काम करते हैं और सुरक्षात्मक उपकरण पहनते हैं। हैंडलिंग के बाद हाथ अच्छी तरह धोएं। धातु के ओढ़े को संक्षारक तरल पदार्थ के लिए नामित हवादार अलमारियों में संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  7. आसुत पानी के साथ कवरस्लिप कुल्ला, एन2के साथ सूखी, और धीरे लेंस कागज के साथ धातु क्लैडिंग की सतह के शौकीन किसी भी पोस्ट है कि अभी भी क्लैडिंग में कवर कर रहे है बेनकाब । कवरस्लिप को एक और 2 घंटे के लिए तांबे के नक़्क़ाशी में वापस रखें, फिर आसुत पानी के साथ फिर से कुल्ला करें और एन2के साथ सूखे।
    नोट: ZMW स्लाइड कवर, साफ पेट्री व्यंजन में संग्रहीत किया जाना चाहिए उन्हें संदूषकों से मुक्त रखने के लिए।

5. कोलॉयडल क्रिस्टल टेम्पलेट का उपयोग करके गोल्ड जीरो मोड वेवगाइड का नैनोफैब्रिकेशन

नोट: सोने ZMWs(पूरक चित्रा 1),जो एल्यूमीनियम ZMWs बनाने के लिए प्रोटोकॉल दर्पण बनाने के लिए विधि, इस खंड में प्रदान की जाती है ।

  1. थर्मल या इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पीकरण जमा का उपयोग करना, 1 Å/s पर एक टाइटेनियम आसंजन परत के 3 एनएम जमा 4 Å/s पर एल्यूमीनियम के ३०० एनएम के बाद
  2. टेप के साथ सतह को धीरे-धीरे दबाकर मोतियों के शीर्ष पर अतिरिक्त धातु निकालें। धीरे-धीरे धातु को खींचने के लिए टेप छील लें।
  3. पॉलीस्टीरिन मोतियों को भंग करने के लिए, मनका टेम्पलेट्स को टोल्यून में रखें और रात भर भिगोएं।
  4. टोल्यून इनक्यूबेशन के बाद, क्लोरोफॉर्म के साथ एक बार और इथेनॉल के साथ दो बार टेम्पलेट्स कुल्ला। एन2 के साथ टेम्पलेट्स को सुखाएं और 30 मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा क्लीनर में अवशिष्ट बहुलक संदूषकों को हटा दें।
  5. थर्मल या इलेक्ट्रॉन बीम वाष्पीकरण जमा का उपयोग करना, 5 Å/s के आसपास और एल्यूमीनियम पदों के शीर्ष पर सोने की 100−150 एनएम जमा करें ।
  6. धातु की चौकियों को भंग करने के लिए, एल्यूमीनियम एवेंप्ट (फॉस्फोरिक एसिड-आधारित) में कवरस्लिप को सोख लें; सामग्री की तालिका) 1 घंटे के लिए।
  7. आसुत पानी के साथ कवरस्लिप कुल्ला, एन2के साथ सूखी, और धीरे लेंस कागज के साथ धातु क्लैडिंग की सतह के शौकीन किसी भी पोस्ट है कि अभी भी क्लैडिंग में कवर कर रहे है बेनकाब । 1 घंटे के लिए एल्यूमीनियम etchant में वापस कवर्लिप्स प्लेस, तो आसुत पानी के साथ फिर से कुल्ला और एन2के साथ सूखी ।
    नोट: ZMW स्लाइड कवर, साफ पेट्री व्यंजन में संग्रहीत किया जाना चाहिए ।

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Representative Results

वाष्पीकरण तलछट (चरण 2.1−2.13) के माध्यम से पॉलीस्टीरिन कॉलोइडल कणों की आत्म-असेंबली परिणामों की एक श्रृंखला का उत्पादन कर सकती है क्योंकि इसके लिए सॉल्वेंट वाष्पीकरण दर के नियंत्रण की आवश्यकता होती है। हालांकि, क्योंकि जमाव तेज (10−15 मिनट प्रति राउंड) होते हैं, प्रक्रिया को विभिन्न परिवेश प्रयोगशाला स्थितियों के लिए जल्दी से अनुकूलित किया जा सकता है। चित्रा 3A जमाव और वाष्पीकरण के बाद एक अच्छी तरह से गठित कोलाइडल टेम्पलेट दिखाता है। स्थूल रूप से, मोतियों का क्षेत्र परिपत्र है, जिसमें मोतियों की एक अपारदर्शी, बहुस्तरीय अंगूठी द्वारा परिभाषित सीमाएं हैं। पारदर्शी, लेकिन छवि में सफेद क्षेत्र वांछित मोनोलेयर क्षेत्र नहीं हैं। चित्रा 3B एक कोलाइडल टेम्पलेट दिखाता है जिसे पीढ़ी के आर्द्र वातावरण में पैक किया गया था (पेट्री व्यंजन बंद होने पर 80% आरएच)। इन टेम्पलेट्स में एक साफ परिपत्र सीमा नहीं होती है और इसमें बाहर की ओर बढ़ने वाले बहुस्तरीय टेंड्रल होते हैं। बयान स्वीकार्य है और बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन जाली में छेद एकल अणु इमेजिंग के लिए useable ZMW सरणी क्षेत्रों की संख्या को कम । चित्रा 3C एक कोलाइडल टेम्पलेट दिखाता है जिसे पीढ़ी सूखे वातावरण में पैक किया गया था (पेट्री व्यंजन बंद होने पर 65% आरएच)। ये टेम्पलेट्स आमतौर पर आदर्श, अच्छी तरह से फैल टेम्पलेट्स की तुलना में व्यास में छोटे होते हैं। बयान का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन बहुस्तरीय, सफेद क्षेत्र, जो अंदर की ओर लकीर, इमेजिंग के लिए उपयोग करने योग्य क्षेत्र को कम करते हैं। इस प्रकार, हम एक समय में 6 से अधिक जमाव प्रदर्शन करने की सलाह नहीं देते हैं क्योंकि प्रक्रिया के अंत की ओर जमाएब कम आर्द्रता पर होते हैं क्योंकि कक्ष खोला और बंद हो जाता है। चित्रा 3 डी पॉलीस्टीरिन क्रिस्टल से परावर्तित प्रकाश के विवर्तन द्वारा उत्पादित इंद्रधनुष पैटर्न दिखाता है। इस पैटर्न का उपयोग आंखों द्वारा क्रिस्टल पैकिंग की सफलता और गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 3ई, एफ अच्छी तरह से पैक कोलाइडल टेम्पलेट्स की परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) छवियों से पता चलता है । वाष्पीकरण तलछट41के दौरान जाम से अनाज के बीच दोष उत्पन्न होते हैं, और अलग-अलग अनाज 10x उद्देश्य के साथ देखा जा सकता है। इस प्रकार, कम शक्ति वाले प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ कॉलोइड जमाव की जांच करने का उपयोग पैकिंग का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है।

एनील्ड कोलॉयडल टेम्पलेट्स (चरण 4.1) पर तांबे के जमाव के बाद, इंद्रधनुष विवर्तन पैटर्न अभी भी मोतियों के सबसे ऊपर चिंतनशील धातु कोटिंग(चित्रा 4ए, बी)द्वारा दिखाई और बढ़ाया जाना चाहिए। टेम्पलेट्स स्कॉच टेप पुल (चरण 4.2) के बाद चिंतनशील इंद्रधनुष विवर्तन पैटर्न खो देते हैं जो अतिरिक्त तांबा(चित्रा 4C)को हटा देता है। चित्रा 4डी, ई धातु जमाव के बाद तांबे के पदों के एक ठेठ क्षेत्र के AFM छवियों से पता चलता है । चित्रा 3E में कोलॉयडल क्रिस्टल अनाज के बीच में दोष तांबे के बड़े क्षेत्रों के रूप में तांबे के बाद छवियों में दिखाई दे रहे हैं । एएफएम छवियों के विश्लेषण से पता चलता है कि, 300 एनएम की तांबे की जमाव मोटाई के लिए, अंतिम तांबा पोस्ट औसत 255 एनएम(चित्रा 4F)ऊंचाई में और 121 एनएम व्यास(चित्रा 4G)में।

एल्यूमीनियम क्लैडिंग (चरण 4.5) का जमाव जहां मोती थे और तांबे के पदों के शीर्ष पर थे, और बाद में पदों के विघटन (चरण 4.6 और 4.7) के परिणामस्वरूप चित्रा 5ए −सीमें दिखाए गए एल्यूमीनियम ZMWs में परिणाम। कोलॉयडल क्रिस्टल अनाज के बीच दोष बड़े उद्घाटन(चित्रा 5B)के रूप में दिखाई देते हैं। चित्रा 5C में ZMW केंद्रों के बीच औसत दूरी 559 एनएम है, 1 माइक्रोन मोतियों की षट्कोणीय क्लोज पैकिंग ज्यामिति द्वारा निर्धारित रिक्ति के अनुरूप Equation 1 (पॉलीस्टीरिन टेम्पलेट्स का उपयोग करना जो 20 एस परिणामों के लिए वेवगाइड्स में हैं जो औसतन 118 एनएम व्यास(चित्र 5डी, ई)हैं, जो पोस्ट व्यास के अनुरूप हैं और दृश्यमान प्रकाश के प्रचार को काटने के लिए पर्याप्त रूप से छोटे हैं। चित्रा 5डी से एक तरंग गाइड की ऊंचाई प्रोफ़ाइल भी दर्शाता है कि यह ~ 120 एनएम गहरा है।

कार्यक्षमता(चित्रा 6A)के लिए परीक्षण करने के लिए जेडएमडब्ल्यूएस में एकल अणु FRET किया गया था। इमेजिंग के लिए ZMWs का एक विशिष्ट क्षेत्र चित्रा 6Bमें दिखाया गया है, जिसमें 40 x 80 माइक्रोन क्षेत्र में >3000 वेवगाइड शामिल हैं। जेडएमडब्ल्यू को पहले42 , 43वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके निष्क्रिय कियागयाथा . संक्षेप में, एल्यूमीनियम ZMWs पॉली (vinylphosphonic एसिड) के साथ passivated थे एल्यूमीनियम क्लैडिंग कोट करने के लिए मेथॉक्सी-समाप्त पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के बाद बायोटिन-टर्मिनेट खूंटी के साथ डॉप्ड को जेडएमडब्ल्यू के ग्लास बॉटम्स को कोट करने के लिए । गोल्ड जेडएमडब्ल्यू को थिओल-व्युत्पन्न खूंटी के साथ पानी के क्लैडिंग को कोट करने के लिए निष्क्रिय किया जा सकता है जिसके बाद ग्लास बॉटम्स के लिए एक समान खूंटी उपचार होता है। फ्लो चैम्बर्स, ~ 20 माइक्रोल वॉल्यूम, फिर एकल अणु इमेजिंग44के लिए बनाए गए थे। डीएनए डुप्लेक्स का एकल अणु FRET इमेजिंग पहले38वर्णित के रूप में किया गया था। संक्षेप में, साइनिन-3/साइनिन-5 (Cy3/Cy5), बायोटिनाइलेटेड डीएनए डुप्लेक्स (३३ बेस जोड़ी लंबाई) के १०० एनएम−1 एनएम को स्ट्रेप्टाविडिन (5 मिनट इनक्यूबेशन, ०.५ मिलीग्राम/एमएमएल समाधान) के साथ कार्यात्मक प्रवाह चैनलों में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटेड किया गया । लेबल किए गए मैक्रोमॉलिक्यूल्स की सांद्रता को एक अणु के साथ तरंगगुइड्स की ~ 20% लोडिंग प्राप्त करने के लिए टिटब्रेटेड किया जा सकता है, जिससे एक से अधिक अणुओं से भरे <5% तरंगगाइड्स, पॉइसन वितरित लोडिंग (अधिकांश वेंगगाइड्स, ~ 75%, कोई अणु नहीं होगा)45। अनबाउंड डीएनए नाभिक मुक्त डुप्लेक्स बफर के साथ बह गया था जिसके बाद रोशनी बफर (0.3% [w/v] ग्लूकोज, 300 μg/mL ग्लूकोज ऑक्सीडेस, 120 μg/mL कैटालेस, और 1.5 m M Trolox [6-हाइड्रोक्सी-2,5,7,8-टेट्रामेथिल-क्रोमेन-2-कार्बोक्सिलिक एसिड]) । गैर-बायोटिनाइलेटेड Cy5-लेबल डीएनए डुप्लेक्स (33 बेस पेयर लंबाई) रोशनी बफर में 0, 50, 100 और 500 एनएम पर पृष्ठभूमि फ्लोरोफोरस के रूप में मौजूद थे। स्थिर Cy3/Cy5 डुप्लेक्स डीएनए अणुओं से एकल अणु FRET निशान एक कस्टम निर्मित TIRF माइक्रोस्कोप के साथ दर्ज की गई epi-फ्लोरेसेंस शर्तों को समायोजित । फिल्मों को 1.48 संख्यात्मक अपर्चर (एनए) 100x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ रिकॉर्ड किया गया था जिसमें बारी-बारी से 532 एनएम और 640 एनएम एक्सेक्टेशन (100 एमएस एक्सपोजर) और एक ड्यूल व्यू स्पेक्ट्रल स्प्लिटर एक साथ इलेक्ट्रोन-गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरे पर रिकॉर्ड करने के लिए किया गया था। Cy5 चैनल में एकल चरण ब्लीच के साथ एकल अणु FRET निशान परिवेश Cy5 परीक्षण(चित्रा 6सी−एफ)की सभी सांद्रता पर पता लगाने योग्य थे । इसकी तुलना में, एकल अणु केवल टीआईआरएफ रोशनी में कम एनएम समाधान फ्लोरोफोर सांद्रता46से कम एनएम के साथ पता लगाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: शून्य मोड वेवगाइड्स की योजनाबद्ध। दाईं ओर एक जेडएमडब्ल्यू के विस्तारित क्रॉस-सेक्शनल आरेख के साथ जेडएमडब्ल्यू सरणी का आरेख। एकल फ्लोरोसेंट रूप से ब्याज के एंजाइमों को टैग किया गया (फ्लोरोसेंट डाई का प्रतिनिधित्व करने के लिए लाल सर्कल के साथ ब्राउन राइबोसोम) रासायनिक रूप से स्थिर (इस उदाहरण में एमआरएनए के माध्यम से) ZMWs के ग्लास नीचे (आमतौर पर बायोटिनेलेटेड-खूंटी के साथ कार्यात्मक) को एक विशिष्ट लेजर-आधारित एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ चित्रित किया जा सकता है। 532 एनएम एक्सेक्टिटेशन लाइट (हरे तीर) एपर्चर (100−200 एनएम व्यास) के छोटे आकार के कारण कांच-धातु की सीमा पर परिलक्षित होता है, लेकिन एक गैर-प्रचारित लुप्त होती है जो तीव्रता में तेजी से क्षय होती है ZMW के भीतर मौजूद है। इसके परिणामस्वरूप 10−30 एनएम प्रभावी रोशनी गहराई (अपर्चर में हरी छायांकन) होती है। एनएम से μM सांद्रता में व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट लिगांड (फ्लोरोसेंट टैग के रूप में हरे घेरे के साथ नीले टीआरएनए) जोड़े जाते हैं। एक व्यक्तिगत लिगामेंट जो एपर्चर में फैलता है और एंजाइम के साथ बातचीत करता है, निषेधात्मक पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के बिना इमेज किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एल्यूमीनियम ZMW सरणी बनाने के लिए विकसित कोलाइडियल टेम्पलैटिंग विधि की योजनाबद्ध। पॉलीस्टीरिन मोती, व्यास में 1 माइक्रोन, जमा किए जाते हैं और प्रोटोकॉल की धारा 2 में वर्णित एक साफ ग्लास कवरलिप पर स्वयं इकट्ठे होते हैं। मोती तो ताकना आकार (धारा 3) को कम करने के लिए annealed हैं, तांबे जमाव और टोल्यूईन में मनका विघटन के बाद । एल्यूमीनियम के आसपास और तांबे के पदों के शीर्ष पर जमा है, जो तो चुनिंदा दूर नक़्क़ाशीदार नैनोपर्चर (धारा 4) की एक षट्कोणीय सरणी के पीछे छोड़ रहे हैं । पिछले तीन चरणों के लिए, तांबे के पदों और एल्यूमीनियम ZMWs की चौड़ाई और ऊंचाइयों को दिखाने के लिए योजना विचारों के अधिकार के लिए क्रॉस-सेक्शनल दृश्य प्रदान किए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: कोलॉइड के वाष्पीकरण जमाव से प्रतिनिधि परिणाम। (क) इष्टतम कोलॉयड जमाव का उदाहरण। (ख) एक स्वीकार्य कोलॉयड जमाव का उदाहरण जिसमें स्थितियां आदर्श की तुलना में अधिक आर्द्र (८०% आरएच) थीं । क्रिस्टल मोनोलेयर में छेद स्पष्ट हैं। (ग) एक स्वीकार्य कोलॉयड जमाव का उदाहरण जिसमें स्थितियां इष्टतम की तुलना में शुष्कक (६५% आरएच) थीं । मोनोलेयर क्षेत्र थोड़ा पारदर्शी होते हैं जबकि बहुस्तरीय क्षेत्र सफेद और अपारदर्शी (परिधि और धारियाँ अंदर की ओर) होते हैं। (घ) क्रिस्टल से इंद्रधनुष विवर्तन को उजागर करने के लिए सफेद प्रकाश से प्रकाशित एक कोलाइडल क्रिस्टल । (ई) एएफएम इमेज (हवा में जांच AFM दोहन) एक सफल कोलॉयड जमाव (स्केल बार = 10 माइक्रोन) से हेक्सागोनली पैक पॉलीस्टीरिन मोतियों के एक मोनोलेयर की । (एफ) पैक्ड मोतियों की विस्तारित एएफएम छवि (स्केल बार = 2 माइक्रोन) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: तांबे के बयान के बाद ZMW टेम्पलेट्स के स्थूल और सूक्ष्म छवियां। (क) मनका टेम्पलेट्स के शीर्ष पर तांबे के भौतिक वाष्पीकरण के बाद स्लाइडों की तस्वीर । (ख) तांबे के बयान के बाद मनका टेम्पलेट्स से इंद्रधनुष विवर्तन पैटर्न । (ग) अतिरिक्त तांबा और टेप (बाएं) को हटाने के लिए टेप खींचने के बाद एक टेम्पलेट (दाएं) की तस्वीर । (घ) टेप पुल और पॉलीस्टीरिन मोती के पूर्ण विघटन के बाद तांबे के पदों की AFM छवि (स्केल बार = 5 μm) । (ङ) पैनल डी की उच्च आवर्धन एएफएम छवि (स्केल बार = 2 माइक्रोन) । (एफ) कॉपर पोस्ट हाइट्स का हिस्टोग्राम (प्रत्येक पोस्ट के भीतर अधिकतम ऊंचाई माप के रूप में परिभाषित), एन = 534। (जी) कॉपर पोस्ट फेरेट व्यास का हिस्टोग्राम, एन = 201। फेरेट व्यास दो समानांतर रेखाओं के बीच की अधिकतम दूरी है जो पोस्ट सीमा (इमेजजे47में मात्रा निर्धारित) के लिए स्पर्शरेखा है। विश्लेषण के लिए कणों की पहचान करने के लिए, क्लैडिंग के शीर्ष और नीचे कांच की सतह के बीच आधी दहलीज का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एल्यूमीनियम ZMWs के स्थूल और सूक्ष्म छवियां। (क) तांबे की चौकियों के आसपास और उसके ऊपर 150 एनएम एल्यूमीनियम के भौतिक वाष्पीकरण के बाद स्लाइडों की तस्वीर। (ख) पोस्ट विघटन के बाद एल्यूमीनियम ZMWs की AFM छवि (स्केल बार = 5 μm) । (ग) पैनल बी की उच्च आवर्धन छवि (स्केल बार = 0.2 माइक्रोन) । (घ) पैनल सी प्रोफाइल से किसी व्यक्ति जेडएमडब्ल्यू की विशिष्ट गहराई प्रोफाइल पैनल सी (ई) जेडएमडब्ल्यू फेरेट व्यास के हिस्टोग्राम में खींची गई हरी रेखा से लिया गया, एन = 240। फेरेट व्यास को चित्र 4के रूप में मापा गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: ZMWs में एकल अणु FRET इमेजिंग । (क) Cy3 के एकल अणु FRET इमेजिंग के योजनाबद्ध (पैमाने पर नहीं), Cy5-लेबल डीएनए डुप्लेक्स जेडएमडब्ल्यूएस में Cy5 लेबल वाले डुप्लेक्स पृष्ठभूमि में डुप्लेक्स लेबल के साथ । (ख) सफेद प्रकाश रोशनी के तहत ZMWs के उदाहरण क्षेत्र (स्केल बार = 10 μm) । (C−F) डीएनए डुप्लेक्स की एकल अणु FRET रिकॉर्डिंग 0 (सी),50 (डी),100 (ई)और 500 एनएम (एफ) Cy5-लेबल डुप्लेक्स की उपस्थिति में जेडएमडब्ल्यू में स्थिर होती है। प्रत्येक एकाग्रता के लिए, शीर्ष पैनल Cy3 (ग्रीन) और Cy5 (लाल) फ्लोरेसेंस तीव्रता के तहत ५३२ एनएम लेजर रोशनी (FRET इमेजिंग) से पता चलता है, मध्य पैनल ६४० एनएम लेजर रोशनी (प्रत्यक्ष स्वीकारकर्ता उत्तेजना) के तहत Cy5 फ्लोरेसेंस तीव्रता से पता चलता है, और सबसे कम पैनल FRET दक्षता से पता चलता Equation 2 है () कच्चे Cy3(मैंडी)और Cy5(मैं)फ्लोरेसेंस से गणना की । इमेजिंग के दौरान, उत्तेजन तरंगदैर्ध्य ५३२ और ६४० एनएम के बीच हर १०० एमएस वैकल्पिक । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: गोल्ड जेडएमडब्ल्यू सरणी बनाने के लिए विकसित कोलाइडल टेम्पलैटिंग विधि की योजनाबद्ध। गोल्ड जेडएमडब्ल्यू सरणी बनाने के लिए प्रोटोकॉल एल्यूमीनियम ZMW सरणी(चित्रा 2)बनाने के लिए प्रोटोकॉल के अनुरूप है। पॉलीस्टीरिन मोतियों के ऊपर तांबा जमा करने के बजाय एल्यूमीनियम जमा किया जाता है। टोल्यून में मोतियों को भंग करने के बाद पदों के शीर्ष पर एल्यूमीनियम के बजाय सोना जमा किया जाता है। एल्यूमीनियम पदों तो चुनिंदा सोने ZMW सरणी के पीछे छोड़ने के लिए नक़्क़ाशीदार हैं । पिछले तीन चरणों के लिए, एल्यूमीनियम पदों और सोने के ZMWs की चौड़ाई और ऊंचाइयों को दिखाने के लिए योजना विचारों के अधिकार के लिए क्रॉस-सेक्शनल दृश्य प्रदान किए जाते हैं । कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 2: ZMWs में विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र प्रचार के परिमित तत्व मॉडलिंग। (A−D) एक अननेल टेम्पलेट (ए, सी) और एक एनेल्ड टेम्पलेट (बी, डी)से बने तरंगगाइड के माध्यम से समय-औसत पोयंटिंग वेक्टर (डब्ल्यू/एम2)के परिमाण के क्रॉस सेक्शन। लिनरली ध्रुवीकृत विद्युत चुम्बकीय विमान तरंगों (1 डब्ल्यू स्लाइड के क्षेत्र में वितरित) आंकड़ा (४०० एनएम या १,००० एनएम) में सूचीबद्ध तरंगदैर्ध्य पर नीचे की सतह पर अनुमानित किया गया था, और सबसे कम (मौलिक) मोड, जिसमें सबसे कम तरंग संख्या है, की गणना मैक्सवेल के समीकरणों और उचित सीमा स्थितियों को हल करने के लिए परिमित तत्व विधि के साथ मॉडलिंग सॉफ्टवेयर(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके की गई थी। तरंगगाइड्स की सीमाओं को सही विद्युत कंडक्टर माना जाता था, जो एल्यूमीनियम या सोने की दीवारों से अच्छी तरह से अनुमानित होता है। अननेल्ड वेवगाइड टेम्पलेट से क्रॉस-सेक्शन 1 माइक्रोन व्यास हलकों की षट्कोणीय पैकिंग द्वारा निर्धारित किया गया था, और परिणामी त्रिकोणीय आकार से तीन-इंगित युक्तियों को यथार्थवादी भौतिक एपर्चर मॉडल करने के लिए ~ 60 एनएम चौड़ाई तक काटा गया था। एनील्ड टेम्पलेट्स से क्रॉस-सेक्शन व्यास में सर्कल 130 एनएम के रूप में अनुमानित था। दोनों वेवगाइड्स में 130 एनएम गहराई थी, जो निर्माण के बाद क्लैडिंग गहराई के समान थी। (ई, एफ) 400 एनएम और 1,000 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के अलावा, मॉडलों को 400 एनएम और 1,000 एनएम के बीच समान रूप से दूरी पर 100 उत्तेजन तरंगदैर्ध्य में हल किया गया था, और प्रभावी मोड इंडेक्स (जैसा कि परिभाषित किया गया Equation 3 है, जहां कश्मीरजेड वेवगाइड में वेवनंबर है, जो ट्रांसवर्स प्लेन में प्रतिबंध के कारण कम हो गया है, और कश्मीर वैक्यूम में एक्सटिटेशन लाइट वेवनेंबर है) त्रिकोणीय (ई) और परिपत्र (एफ) वेवगाइड के लिए उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के खिलाफ साजिश रची गई थी। छोटे तरंगदैर्ध्य के लिए, उच्च मोड उत्साहित हैं, और प्रभावी मोड इंडेक्स बढ़ता है (अधिकतम प्रभावी मोड इंडेक्स 1 है, जो सीमित मामला है जहां विद्युत चुम्बकीय विमान तरंग ट्रांसवर्स आयाम में अनबाउंड यात्रा करती है)। तरंगदैर्ध्य की प्रभावी कटऑफ तरंगदैर्ध्य को तरंगदैर्ध्य के रूप में अनुमानित किया गया था जिस पर प्रभावी मोड इंडेक्स 0 तक गिरता है। ध्यान दें कि सर्कुलर गाइड λकटऑफ = 221 एनएम परिमित तत्व मॉडलिंग (एफ) से एक परिपत्र वेवगाइड की कटऑफ तरंगदैर्ध्य (λकटऑफ, विश्लेषणात्मक = 1.7डी = 221 एनएम,जहां डी वेवगाइड व्यास है) की सैद्धांतिक भविष्यवाणी के अनुरूप है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 3: Au ZMW निर्माण से प्रतिनिधि परिणाम। (क) सोने की जेडएमडब्ल्यू सरणी की स्थूल तस्वीर । (B−D) एक मनका टेम्पलेट से एल्यूमीनियम पदों की एएफएम छवियां जो एनील्ड (बी)नहीं थी, एक टेम्पलेट जिसे 20 एस (सी)के लिए 107 डिग्री सेल्सियस पर एनील्ड किया गया था, और एक टेम्पलेट जिसे 25 एस (डी)के लिए 107 डिग्री सेल्सियस पर एनील्ड किया गया था। (ङ) एल्यूमीनियम पदों को भंग करने के बाद सोने के जेडएमडब्ल्यू की एएफएम छवि। (एफ) पैनल ई(जी) एक सोने ZMW की विशिष्ट गहराई प्रोफ़ाइल की उच्च आवर्धन AFM छवि । पैनल एफ में खींची गई हरी रेखा से ली गई प्रोफाइल (स्केल बार = बीमें 1 माइक्रोन, सी, डी,और एफ; ईमें 5 माइक्रोन)। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कोलॉयडल सेल्फ असेंबली (प्रोटोकॉल सेक्शन 2) के लिए, पानी के बजाय इथेनॉल का उपयोग क्योंकि सस्पेंशन सॉल्वेंट वाष्पीकरण प्रक्रिया को गति देता है ताकि टेम्पलेट्स पिछले तरीकों48, 49के बजाय 1−2 घंटे के बजाय जमाव के बाद 2−3 मिनट में तैयार हो सकें। यहां प्रस्तुत वाष्पीकरण तलछट प्रोटोकॉल पिछले तलछट प्रोटोकॉल की तुलना में भी सरल हैजिसके लिए निलंबन49,50, 51से ऊपर सतहझुकाव,तापमान और हवा की मात्रा कोनियंत्रितकरने की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला कण मात्रा अंश 2.4% है, जो पिछले तलछटविधियोंमें उपयोग किए जाने वाले 0.2−0.5% से अधिक है, जो लंबे समय तक निपटाने के लिए पानी-ग्लाइसेरोल मिश्रण में कोलॉयड को फिर से निलंबित करता है। हालांकि, जमाव की गुणवत्ता कण की मात्रा अंश में परिवर्तन करने के लिए मजबूत है, पिछले अध्ययनों से पता चलता हैकि यह 2−10%49,50,51के बीच भिन्न हो सकता है। इस प्रोटोकॉल से एक सफल जमाव में प्राप्त कोलाइडियल क्रिस्टल के अनाज के आकार 20−30 माइक्रोन भर में हैं, जो पिछले तलछट विधियों (आमतौर पर कई सौ नैनोमीटर भर में)48,49से अनाज से बड़े हैं। स्थूल, कोलाइडल मोनोलेयर के व्यास क्षेत्रों में लगभग 2 सेमी पिछले तरीकों द्वारा उत्पादित 1 सेमी क्षेत्रों के बराबर भी हैं49। इस विधि में उत्पादित कोलाइडियल क्रिस्टल टेम्पलेट्स का बड़ा आकार प्रत्येक जेडएमडब्ल्यू स्लाइड पर 3−5 अलग प्रवाहकक्षों 44,प्रत्येक लगभग 3−4 मिमी चौड़ा होने की अनुमति देता है। इस प्रकार, प्रत्येक स्लाइड पर कई स्वतंत्र एकल अणु प्रयोग किए जा सकते हैं।

सेल्फ असेंबली के बाद कॉलोइडल मनका टेम्पलेट्स (प्रोटोकॉल सेक्शन 3) को एनीलिंग करना जेडएमडब्ल्यूएस के साथ पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को पर्याप्त रूप से कम करने के लिए एक सरल, लेकिन महत्वपूर्ण कदम है। पूरक चित्रा 2 से पता चलता है के रूप में, एक unannealed टेम्पलेट से त्रिकोणीय पार अनुभाग के साथ एक तरंगगाइड के लिए प्रभावी कटऑफ तरंग दैर्ध्य ८९४ एनएम है । इसकी तुलना में, एनील्ड टेम्पलेट से 130 एनएम व्यास परिपत्र तरंगगाइड के लिए प्रभावी कटऑफ तरंगदैर्ध्य 221 एनएम है, जैसा कि विश्लेषणात्मक रूप से निर्धारित किया गया है (गाइड 18 के व्यास का1.7गुना) और संख्यात्मक रूप से। जमाव के लिए छोटे मोतियों का उपयोग करना भी टेम्पलेट छिद्रों के आकार को कम कर सकता है, लेकिन वेवगाइड्स को 200 एनएम से करीब दूरी दी जाएगी, जो दृश्यमान प्रकाश की विवर्तन सीमा के आसपास है। इसके अलावा, तरंग पार अनुभाग में त्रिकोणीय रहेगा, जो तरंग गाइड(पूरक चित्रा 2A−D)के माध्यम से गैर सममित शक्ति प्रचार की ओर जाता है । एनीलिंग चरण की एक खामी यह है कि पिघलने के समय में परिवर्तनशीलता वेवगाइड व्यास में उतार-चढ़ाव पेश कर सकती है, इसलिए सटीक समय बैचों के बीच भिन्नता को कम करने में मदद करता है। इंटरस्टिस 25 एस से अधिक समय तक बंद होना शुरू होता है, और पोस्ट व्यास 20−25 एस(पूरक चित्रा 3B−D)के बीच बहुत कम नहीं होते हैं। इंटरस्टिस बंद करने के लिए एक त्वरित परीक्षण यह जांचना है कि क्या एनील्ड टेम्पलेट्स अभी भी प्रकाश से प्रकाशित होने और कोण पर देखे जाने पर इंद्रधनुष विवर्तन पैटर्न का उत्पादन करते हैं। यदि नहीं, तो अधिकांश इंटरस्टिस की संभावना बंद हो गई है। समय और विशिष्ट ताकना व्यास के बीच संबंध पहले38प्रस्तुत किए गए हैं .

एनीलिंग चरण के दौरान वांछित ताकना आकार प्राप्त करने के बाद, मुखौटा की छाया बनाने के लिए टेम्पलेट्स पर तांबा (चरण 4.1) जमा किया जाता है। दृष्टि जमाव की रेखा का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, धातु जितना संभव हो उतना लंबवत रूप से टेम्पलेट के पास पहुंच रहा है। इस प्रकार, नमूना और धातु स्रोत के बीच की दूरी बढ़ाने के साथ-साथ प्लेट होल्डिंग टेम्पलेट्स को घूमते हुए नहीं है, जैसा कि स्वचालित रूप से कुछ वाष्प जमाकरण मशीनों में किया जाता है, पॉलीस्टीरिन सब्सट्रेट पर धातु के पार्श्व जमाव को कम करने में सहायता करेगा। हालांकि, कुछ पार्श्व बयान अपरिहार्य है, जो मध्यवर्ती छेद के आकार को कम करता है और इस प्रकार पोस्ट क्रॉस-सेक्शन के रूप में अधिक धातु52जमा की जाती है। इसके परिणामस्वरूप चश्मे जैसीसंरचनाएं 52के बजाय पिरामिड धातु की चौकियां होती हैं।

क्योंकि तांबे के पदों की संभावना पिरामिड के बजाय चश्मे के आकार के हैं, पदों के शीर्ष पर एल्यूमीनियम बयान (चरण ४.५) भी ढलान पक्षों में से कुछ को शामिल किया गया, पदों में से कुछ के लिए तांबे etchant की पहुंच अवरुद्ध । इस प्रकार, लेंस पेपर बफिंग चरण (चरण 4.7 या 5.7) को पहले सोखने के बाद जोड़ा गया था ताकि एल्यूमीनियम में अभी भी कवर किए गए किसी भी तांबे के पदों को यांत्रिक रूप से बाधित किया जा सके। लम्बे पदों को बनाने के लिए अधिक तांबा जमा करने से भी पदों को लेंस पेपर बफिंग के दौरान यांत्रिक व्यवधान के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है । हालांकि, 500 एनएम से अधिक तांबा जमा नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि जमाव का लक्ष्य 1 माइक्रोम मोतियों के 500 एनएम मिडलाइन पर इंटरस्टिशियल होल को प्रोजेक्ट करना है।

एक और संभावित कठिनाई लेंस पेपर बफिंग (चरण 4.7 या 5.7) के दौरान एल्यूमीनियम क्लैडिंग का अनपेक्षित निष्कासन है। यह पाया गया कि बफिंग के दौरान एल्यूमीनियम क्लैडिंग का नुकसान अधिक बार हो गया क्योंकि एनीलिंग कदम जोड़ा गया था, बढ़ी हुई पॉलीस्टीरिन अवशेषों के कारण होने की संभावना है, जो ग्लास (प्रोटोकॉल धारा 3) के एल्यूमीनियम पालन में हस्तक्षेप कर सकता है। हालांकि, टेप पुल के बाद रात भर टोल्यून सोख (चरण 4.3 या 5.3) इस मुद्दे को हल किया। चित्रा 4Eमें AFM छवि में, पॉलीस्टीरिन के कुछ अवशिष्ट छल्ले पदों के बीच देखा जा सकता है, लेकिन एल्यूमीनियम क्लैडिंग अभी भी कदम ४.७ में कई प्रेमियों का विरोध किया । यदि एल्यूमीनियम क्लैडिंग का नुकसान रात भर टोल्यून सोखने के बाद एक मुद्दा बना हुआ है, तो आरसीए-1 (मानक क्लीन-1) वॉश, पिरान्हा वॉश, या आगे ऑक्सीजन प्लाज्मा सफाई को चरण 4.4 या 5.4 में जोड़ा जा सकता है। इन धोने के चरणों को अंतिम नक़्क़ाशी चरण (चरण 4.7 या 5.7) के बाद और जेडएमडब्ल्यूएस को और साफ करने के लिए पासिेशन से पहले भी जोड़ा जा सकता है।

एकल अणु FRET प्रयोगों में ZMWs का प्रदर्शन ईबीएल के साथ निर्मित ZMWs के समान था । पिछले अध्ययन में53 ने Cy3 पर एकल अणु FRET का प्रदर्शन करते हुए एसआई5 लेबल वाले डीएनए के साथ एकल फंसे डीएनए को समाधान में डीएनए हेलीकेस लोडर प्रोटीन (चित्रा 6 एमें समान दाता-स्वीकार्य व्यवस्था) के रूप में) 100 एनएम Cy5 पृष्ठभूमि में स्पष्ट रूप से प्रत्यक्ष थे, 1 5 मीटर पर कम स्पष्ट (कम स्वीकार्य ट्रेस सिग्नल ऑन शोर) थे, और 10 Mμ पर प्रत्यक्ष नहीं थे। हम ध्यान दें कि वाणिज्यिक ZMWs के साथ एक पिछले अध्ययन पृष्ठभूमि सांद्रता में एकल अणु FRET स्वीकार्य संकेतों की सूचना के रूप में उच्च के रूप में 1 mm54,हम और अन्य पिछले अध्ययनों की तुलना में अधिक42,53 इन-हाउस गढ़े ZMWs के साथ हासिल की है. ZMWs के बीच सिग्नल-टू-बैकग्राउंड प्रदर्शन की आगे की चर्चा जमिलकोवस्की एट अल३८में दी गई है । जेडएमडब्ल्यू सतहों53 के साथ फ्लोरोसेंट नमूने की गैर-विशिष्ट बातचीत एक आम चुनौती है जो उच्च सांद्रता तक पहुंच को सीमित करती है, खासकर यदि समाधान में डिफ्यूजिंग फ्लोरोसेंट प्रजातियां एक बड़ा मैक्रोमॉल्यूल है। अनुवाद जैसी जटिल जैव रासायनिक प्रणालियों पर जेडएमडब्ल्यू के साथ किए गए अध्ययनों में आमतौर पर 100−250 एनएम55,56,57,58तक मुफ्त फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट सांद्रता सीमित होती है। ZMWs के इच्छित आवेदन के बावजूद, उच्च सांद्रता पर शोर करने के लिए स्वीकार्य संकेत बनाए रखने के लिए विभिन्न प्रणालियों के लिए निष्क्रियता विधियों का अनुकूलन आवश्यक होगा।

कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत विधि के लिए कोई विशेष कौशल या उपकरण की आवश्यकता नहीं है, एक बार में कई टेम्पलेट्स के समानांतर निर्माण की अनुमति देता है, और विभिन्न धातुओं में ZMWs बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस काम में, तांबे और एल्यूमीनियम को क्रमशः एल्यूमीनियम और सोने के साथ प्रतिस्थापित किया गया था, ताकि गोल्ड जेडएमडब्ल्यू(पूरक चित्रा 3)तैयार किया जा सके। यह उन प्रयोगशालाओं के लिए लाभप्रद है जो एल्यूमीनियम के बजाय सोने के पोषण विधियों का उपयोग करते हैं। इसके अलावा, फ्लोरोफोरस के लिए उत्सर्जन को बढ़ाने के लिए गोल्ड जेडएमडब्ल्यू दिखाए गए हैं जो दृश्यमान स्पेक्ट्रम के लाल क्षेत्र में अवशोषित करते हैं, जबकि एल्यूमीनियम ZMWs हरित क्षेत्र में अवशोषित होने वाले फ्लोरोफोर के लिए उत्सर्जन को बढ़ाते हैं59। भविष्य में, इस विधि के साथ गढ़े गए जेडएमडब्ल्यू से फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता को एचएफ16, 26, 60का उपयोग करके जेडएमडब्ल्यू धातु क्लैडिंग के नीचे ग्लास में नक़्क़ाशी करके बढ़ाया जा सकता है। यह स्थिर बायोमॉलिक्यूल्स को धातु की दीवारों से दूर लाता है, जो फ्लोरोफोरस61को बुझा सकता है। इसके अलावा, एपर्चर के प्रवेश द्वार के नीचे उत्तेजना रोशनी तीव्रता में अधिकतम है, और एकल अणु उत्सर्जन26, 60को बढ़ाने के लिए इसका पहले शोषण किया गया है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच ग्रांट R01GM080376, R35GM118139, और एनएसएफ सेंटर फॉर इंजीनियरिंग मेकेनोबायोलॉजी सीएमएमआई: 15-48571 से वाईजीजी तक, और एनआईएआईडी प्री-डॉक्टोरल एनआरएसए फैलोशिप F30AI114187 द्वारा आर.M जे को समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

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बायोइंजीनियरिंग अंक 159 शून्य मोड वेवगाइड्स नैनो-अपर्चर एकल अणु फ्लोरेसेंस नैनोस्फीयर लिथोग्राफी कोलाइडल क्रिस्टल आत्म-असेंबली

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

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Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

उच्च एकाग्रता एकल अणु माइक्रोस्कोपी के लिए शून्य मोड वेवगाइड्स का निर्माण
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Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

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