Tillverkning av zero mode vågledare för hög koncentration enmolekylmikroskopi

Summary

Beskrivs här är en nanosfär litografi metod för parallell tillverkning av nollläge vågledare, som är matriser av nanoapertures i en metallklädd glasmikroskopi coverlip för en molekyl imaging vid nano- till mikromolar koncentrationer av fluororforer. Metoden drar nytta av kolloidal crystal självmontering för att skapa en vågguidemall.

Abstract

I enzymologi med en molekylfluorescens begränsar bakgrundsfluorescens från märkta substrat i lösning ofta fluorforkoncentrationen till pico- till nanomolära intervall, flera storleksordningar mindre än många fysiologiska ligandkoncentrationer. Optiska nanostrukturer som kallas nolllägesvågledare (ZMWs), som är 100−200 nm i diameteröppningar tillverkade i en tunn ledande metall som aluminium eller guld, möjliggör avbildning av enskilda molekyler vid mikromolekylkoncentrationer av fluorforer genom att begränsa synlig ljusutplåda till zeptoliter effektiva volymer. Behovet av dyr och specialiserad nanotillverkningsutrustning har dock förhindrat den utbredda användningen av ZMWs. Vanligtvis erhålls nanostrukturer som ZMWs genom direkt skrivning med hjälp av elektronstrålelitografi, som är sekventiell och långsam. Här, kolloidal eller nanosfär, används litografi som en alternativ strategi för att skapa nanometerskaliga masker för vågledartillverkning. I detta betänkande beskrivs tillvägagångssättet i detalj, med praktiska överväganden för varje fas. Metoden gör det möjligt att göra tusentals ZMW-ämnen i aluminium eller guld parallellt, med slutliga vågledardiametrar och djup på 100−200 nm. Endast vanlig labbutrustning och en termisk förångare för metalldeponering krävs. Genom att göra ZMWs mer tillgängliga för det biokemiska samhället kan denna metod underlätta studier av molekylära processer vid cellulära koncentrationer och frekvenser.

Introduction

Enmolekylstekniker som enmolekyl fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) eller enmolekyl fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är kraftfulla verktyg för molekylär biofysik, vilket möjliggör studier av dynamiska rörelser, konformationer och interaktioner av enskilda biomolekyler i processer som transkription^1,2,3, översättning^4,5,6och många andra⁷. För smFRET är total inre reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi en vanlig metod eftersom många tjudrade molekyler kan följas över tiden, och den evanescentvåg som genereras av TIR är begränsad till en 100−200 nm-region intill täcket⁸. Men även med denna begränsning av excitationsvolymen måste fluorforer av intresse fortfarande spädas ut till pM- eller nM-intervall för att upptäcka enstaka molekylsignaler över bakgrundsfluorescens⁹. Eftersom Michaelis-Menten-konstanterna av cellulära enzymer vanligtvis ligger i intervallet μM till mM¹⁰, är biokemiska reaktioner i enmolekylstudier vanligtvis mycket långsammare än de i cellen. Till exempel uppträder proteinsyntesen vid 15−20 aminosyror per sekund i E. coli^11,12, medan de flesta prokaryota ribosomer i smFRET-experiment översätter vid 0,1−1 aminosyra per^{sekund 13}. I proteinsyntesen visade kristallstrukturer och smFRET på avstannade ribosomer att överföring av RNAs (tRNAs) fluktuerar mellan “hybrid” och “klassiska” tillstånd före tRNA-mRNA-flyttningssteget^14,15. När fysiologiska koncentrationer av flyttningen GTPase faktor, EF-G, var närvarande, observerades dock en annan konformation, mellanliggande mellan hybrid och klassiska tillstånd, i smFRET⁶. Att studera dynamiska molekylära processer i takt och koncentrationer som liknar dem i cellen är viktigt, men är fortfarande en teknisk utmaning.

En strategi för att öka den fluorescerande substratkoncentrationen är användningen av metallbaserade, sub synliga våglängdsöppningar, så kallade nolllägesvågledare (ZMWs), för att generera begränsade excitationsfält som selektivt excite biomolekyler lokaliserade inom öppningarna¹⁶ (Figur 1). Öppningarna är vanligtvis 100−200 nm i diameter och 100−150 nm i djup¹⁷. Ovanför en cutoff våglängd relaterad till brunnens storlek och form (λ_c ≈ 2,3 gånger diametern för cirkulära vågledare med vatten som det dielektriska^{mediet 18}), är inga förökningslägen tillåtna i vågledaren, därav termen nollläge vågledare. Emellertid, ett oscillerande elektromagnetiskt fält, som kallas en evanescent våg, exponentiellt förfaller i intensitet fortfarande tunnlar en kort bit in i vågledaren^18,19. Även om ZMW evanescent vågor liknar TIR evanescent vågor har en kortare förfall konstant, vilket resulterar i 10−30 nm effektiv excitation region inom vågledaren. Vid mikromolära koncentrationer av fluorescerande märkta ligander finns endast en eller ett fåtal molekyler samtidigt inom excitationsregionen. Denna begränsning av excitationsvolymen och den därav följande minskningen av bakgrundsfluorescens möjliggör fluorescensavbildning av enstaka molekyler vid biologiskt relevanta koncentrationer. Detta har tillämpats på många system²⁰, inklusive FCS-mätningar av en proteindiffusion²¹, fret-mätningar med en molekyl av låg affinitet ligand-protein²² och proteinproteininteraktioner²³, och spektroelektrokemiska mätningar av enstaka molekylära omsättningshändelser²⁴.

ZMWs har producerats genom direkt mönstring av ett metallskikt med jonstrålefräsning^25,26 eller elektronstrålelitografi (EBL) följt av plasmaetsning^16,27. Dessa masklösa litografimetoder skapar vågledare i serie och kräver vanligtvis tillgång till specialiserade nanotillverkningsanläggningar, vilket förhindrar utbredd användning av ZMW-teknik. En annan metod, ultraviolett nanoimprint litografi lyft²⁸, använder en kvarts glidform för att trycka en omvänd ZMW-mall på en motståndsfilm som en stämpel. Även om denna metod är mer strömlinjeformad, kräver den fortfarande EBL för tillverkning av kvartsformen. Den här artikeln presenterar protokollet för en enkel och billig mallad tillverkningsmetod som inte kräver EBL- eller jonstrålefräsning och är baserad på nära packning av nanosfärer för att bilda en litografisk mask.

Nanosfär eller “naturlig” litografi, som först föreslogs 1982 av Deckman och Dunsmuir^29,30, använder självmontering av monodisperse kolloidala partiklar, allt från tiotals nanometer till tiotals mikrometer³¹, för att skapa mallar för mönstring via etsning och /eller nedfall av material. De tvådimensionella (2D) eller tredimensionella (3D) förlängda periodiska matriserna av kolloidala partiklar, så kallade kolloidala kristaller, kännetecknas av en ljus iridescence från spridning och diffraktion³². Även om den används mindre än elektronstråle eller fotolitografi är denna maskeringsmetod enkel, låg kostnad och lättskalad för att skapa funktionsstorlekar under 100 nm.

Att styra självmonteringen av kolloidala partiklar avgör framgången med att använda kolloidala kristaller som masker för ytmönster. Om partiklarnas storlek och form är homogena kan kolloidala partiklar lätt självmonteras med sexkantig förpackning, driven av entropisk utarmning³³. Vattenavdunstning efter droppbeläggning är en effektiv väg till sediment de kolloidala partiklarna, även om andra metoder inkluderar doppbeläggning^{34,spinnbeläggning 35}, elektroforesisk nedfall³⁶, och konsolidering vid ett luftvattengränssnitt³⁷. Protokollet som presenteras nedan är baserat på avdunstningssedimenteringsmetoden, som var den enklaste att genomföra. De triangulära intersticesna mellan nära-packade polystyrenpärlor bildar öppningar som för att plätera en offer belägger med metall som bildar postar (Figurera 2 och Kompletterande figurera 1). Kort glödgning av pärlor innan detta steg justerar formen och diametern på dessa stolpar. Pärlorna tas bort, ett slutligt metallskikt deponeras runt stolparna och sedan tas stolparna bort. Efter de två metalldepositionsstegen på den kolloidala nanomasken, avlägsnande av mellanliggande stolpar och ytkemimodifiering för passivering och tjudring är ZMW-matriser redo att användas för avbildning av enstaka molekyler. Mer omfattande karakterisering av ZMW optiska egenskaper efter tillverkning kan hittas i en medföljande artikel³⁸. Förutom en termisk förångare för ångdeposition av metallerna krävs inga specialiserade verktyg.

Protocol

OBS: Alla steg kan slutföras i allmänt labbutrymme. 1. Rengöring av glasöverdrag För att ge en ren yta för avdunstningsdeposition av kolloidala partiklar, placera 24 x 30 mm optiska borosilikatglaskåpor (0,16−0,19 mm tjocklek) i de räfflade skären i en kolinerglasmålningsburk för rengöring.OBS: Se till att täckena står upprätt och är väl åtskilda så att alla ytor är tydligt exponerade under rengöringsprocessen. Häll tillräckligt med aceton i fä…

Representative Results

Självmonteringen av polystyrenkolloidala partiklar via avdunstningssedimentering (steg 2.1−2.13) kan ge en rad resultat eftersom det kräver kontroll av lösningsmedlets avdunstningshastighet. Men eftersom depositionerna är snabba (10−15 min per omgång) kan proceduren snabbt optimeras för olika omgivande labbförhållanden. Figur 3A visar en välformad kolloidal mall efter nedfall och avdunstning. Makroskopiskt är pärlor regionen cirkulär, med gränser som definieras av en ogenoms…

Discussion

För kolloidal självmontering (protokoll avsnitt 2) påskyndar användningen av etanol snarare än vatten eftersom suspensionslösningen påskyndar avdunstningsprocessen så att mallarna är klara på 2−3 min efter nedfall snarare än 1−2 h som i tidigare^{metoder 48,49}. Det avdunstningssedimenteringsprotokoll som presenteras här är också enklare än tidigare sedimenteringsprotokoll som kräver kontroll av ytlutning, temperatur och luftvolym över<sup class…

Materials

1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin glass staining jar	Fisher Scientific	08-817	Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Potassium hydroxide
Petri dishes	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator	Branson	Z245143	Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Desk fan	O2Cool	FD05001A	Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Humidity meter	Fisher Scientific	11-661-19
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Polystyrene microspheres	Polysciences	18602-15	1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate	Fisher Scientific	AA11062RY	Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller	McMaster-Carr	38615K71	Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe	McMaster-Carr	9251T93	Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant	Transene	Type A
Aluminum pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	For electron beam evaporation
Chloroform	Sigma	288306	1 L
Copper etchant	Transene	49-1
Copper pellets	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	For electron beam evaporation
Gold pellets	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	For electron beam evaporation
Lens paper	Thorlabs	MC-5
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Scotch tape	Staples	MMM119
Thin film deposition system	Kurt J. Lesker	PVD-75	Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	For electron beam evaporation
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter	Photometrics, Inc.