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Neuroscience

न्यूरॉन्स में सेलुलर ट्रैफिकिंग स्टडीज के लिए एक ट्यूब में मोनो-बायोटाइनलेट रेकॉम्बिनेंट बीडीएनएफ को शुद्ध और सीधे मोनो-बायोटाइनलेट रेकॉम्बिनेंट बीडीएनएफ के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल

Published: July 11, 2020 doi: 10.3791/61262
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3, 4, 1,3
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

Summary

एक लवी अनुक्रम (BDNFAvi) युक्त Recombinant BDNF एक लागत प्रभावी तरीके से HEK293 कोशिकाओं में उत्पादित किया जाता है और आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी द्वारा शुद्ध है । BDNFavi तो सीधे मोनो-बायोटिनिलेटेड एंजाइम बीरा के साथ एक ट्यूब में है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीडीएनएफ की तुलना में बीडीएनफैवी और मोनो-बायोटिनेलेटेड बीडीएनफावी अपनी जैविक गतिविधि को बनाए रखते हैं।

Abstract

एक लवी अनुक्रम (BDNFAvi) युक्त Recombinant BDNF HEK293 कोशिकाओं में उत्पादित किया जाता है और फिर एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी द्वारा लागत प्रभावी ढंग से शुद्ध । एक ट्यूब में एंजाइम बीरा के साथ सीधे मोनो-बायोटाइनेट बीडीएनएफवी के लिए एक प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। इस प्रतिक्रिया में, मोनो-बायोटिनेलेटेड बीडीएनएफवी अपनी जैविक गतिविधि को बरकरार रखता है।

न्यूरोट्रोफिन न्यूरोनल विकास और रखरखाव में भूमिका निभाने वाले लक्ष्य-व्युत्पन्न विकास कारक हैं। उन्हें विभिन्न न्यूरोनल डिब्बों के बीच लंबी दूरी के संकेत की अनुमति देने के लिए एंडोसाइटिक मार्ग के साथ तेजी से परिवहन तंत्र की आवश्यकता होती है। न्यूरोट्रोफिन की तस्करी का अध्ययन करने के लिए आणविक उपकरणों के विकास ने वीवो रिकॉर्डिंग में उपयोग करके सेल में इन प्रोटीनों की सटीक ट्रैकिंग को सक्षम किया है। इस प्रोटोकॉल में, हमने मोनो-बायोटिनाइलेटेड बीडीएनएफ के उत्पादन के लिए एक अनुकूलित और लागत प्रभावी प्रक्रिया विकसित की है। माइक्रोग्राम रेंज में एचईके293 कोशिकाओं में बायोटिनाइलेबल एवी सीक्वेंस (बीडीएनएफवी) युक्त एक पुनः संयोजन बीडीएनएफ संस्करण का उत्पादन किया जाता है और फिर आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके आसानी से स्केलेबल प्रक्रिया में शुद्ध किया जाता है। शुद्ध बीडीएनएफ को ट्यूब में एंजाइम बीरा के साथ सीधे इन विट्रो प्रतिक्रिया द्वारा सजातीय मोनो-बायोटिनिलेटेड किया जा सकता है। मोनो-बायोटिनेलेटेड बीडीएनएफ (एलबीटीबीडीएनएफ) की जैविक गतिविधि को विभिन्न फ्लोरोफोरस के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-कंजूलेट करने के लिए संयोजित किया जा सकता है। बीडीएनएफवी और एलबीटीबीडीएनएफ ने क्रमशः पश्चिमी दाग और ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर सीआरईबी के सक्रियण का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम फॉस्फोरलेटेड लक्ष्यों का पता लगाने के माध्यम से अपनी जैविक गतिविधि को बनाए रखा। स्ट्रेप्टाविडिन-क्वांटम डॉट्स का उपयोग करके, हम सीआरईबी के सक्रियण के साथ mbtBDNF आंतरिककरण सहवर्ती कल्पना करने में सक्षम थे, जिसे फॉस्फो-सीआरईबी विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पाया गया था। इसके अलावा, स्ट्रेप्टाविडिन-क्वांटम डॉट्स के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-क्वांटम डॉट्स के लिए संयुग्मित mbtBDNF माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में उगाए जाने वाले कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में प्रतिगामी परिवहन विश्लेषण के लिए उपयुक्त था। इस प्रकार, ट्यूब में उत्पादित mbtBDNF शारीरिक संकेत एंडोसोम गतिशीलता और न्यूरॉन्स में तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण है।

Introduction

न्यूरॉन्स तंत्रिका तंत्र की कार्यात्मक इकाइयां हैं जिनमें एक जटिल और विशेष आकृति विज्ञान है जो सिनैप्टिक संचार की अनुमति देता है, और इस प्रकार, विविध उत्तेजनाओं के जवाब में समन्वित और जटिल व्यवहार की पीढ़ी। डेनड्राइट्स और एक्सॉन जैसे न्यूरोनल अनुमान न्यूरोनल संचार में शामिल महत्वपूर्ण संरचनात्मक विशेषताएं हैं, और न्यूरोट्रोफिन उनकी आकृति विज्ञान और फ़ंक्शन1का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं। न्यूरोट्रोफिन स्रावित विकास कारकों का एक परिवार है जिसमें एनजीएफ, एनटी-3, एनटी-4, और मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (बीडीएनएफ)2शामिल हैं। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, बीडीएनएफ न्यूरोट्रांसमिशन, डेंड्रिटिक आर्बोराइजेशन, डेंड्रिटिक कताई की परिपक्वता, दीर्घकालिक शक्तिशाली, अन्य3,,4सहित विविध जैविक प्रक्रियाओं में भाग लेता है। इसलिए, बीडीएनएफ न्यूरोनल फ़ंक्शन को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

विविध सेलुलर प्रक्रियाएं बीडीएनएफ गतिशीलता और कार्य को विनियमित करती हैं। न्यूरोनल सतह पर, बीडीएनएफ ट्रोपोमायोसिन रिसेप्टर किनेज़ बी (TrkB) और/या p75 न्यूरोट्रोफिन रिसेप्टर (p75) को बांधता है । बीडीएनएफ-TrkB और BDNF-p75 परिसरों को एंडोसिटोस किया जाता है और,विभिन्न एंडोसाइटिक ऑर्गेनेल्स5,6,7, 8में क्रमबद्ध कियाजाताहै।,, बीडीएनएफ/ट्राकीएनबी परिसर की सही इंट्रासेलुलर तस्करी विभिन्न न्यूरोनल सर्किट 9 , 10,,11में उचित बीडीएनएफ सिग्नलिंग के लिए आवश्यक है।9 इस कारण से, स्वास्थ्य और रोग में बीडीएनएफ सिग्नलिंग को समझने के लिए बीडीएनएफ तस्करी गतिशीलता और रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं में पाए जाने वाले इसके परिवर्तनों की गहरी समझ आवश्यक है। इस प्रक्रिया की निगरानी के लिए उपन्यास और विशिष्ट आणविक उपकरणों के विकास से इस क्षेत्र को आगे बढ़ाने और शामिल नियामक तंत्र की बेहतर समझ की अनुमति देने में मदद मिलेगी ।

न्यूरॉन्स में बीडीएनएफ तस्करी के अध्ययन के लिए कई उपकरण उपलब्ध हैं। आमतौर पर उपयोग की जाने वाली पद्धति में फ्लोरोसेंट अणुओं जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या जीएफपी एमसीएचरी12, 13,13के मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट लाल-स्थानांतरित संस्करण के साथ टैग किए गए पुनर्संवहन बीडीएनएफ के ट्रांसफेक्शन शामिल हैं। हालांकि, बीडीएनएफ ओवरएक्सप्रेशन की एक बड़ी कमी यह है कि यह इस न्यूरोट्रोफिन की ज्ञात सांद्रता देने की संभावना को समाप्त करता है। इसके अलावा, इसके परिणामस्वरूप सेलुलर विषाक्तता हो सकती है, जो परिणामों की व्याख्या को अस्पष्ट कर सकती है14। एक वैकल्पिक रणनीति एक एपिटोप-टैग किए गए TrkB का ट्रांसफैक्शन है, जैसे फ्लैग-TrkB। यह पद्धति TrkB आंतरिकता गतिशीलता15के अध्ययन की अनुमति देता है, लेकिन इसमें ट्रांसफैक्शन भी शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप TrkB फ़ंक्शन और सेलुलर विषाक्तता बदल सकती है। इन पद्धतिगत बाधाओं को दूर करने के लिए, एवी अनुक्रम (बीडीएनएफवी) वाले एनजीएफ और बीडीएनएफएफ के पुनः संयोजन वेरिएंट, जिसे बायोटिन-लिगासे एंजाइम बीरा द्वारा मोनो-बायोटिनीलेटेड किया जा सकता है,16,,17विकसित किए गए थे। बायोटिनेलेटेड रीकॉम्बिनेंट बीडीएनएफ को विभिन्न स्ट्रेप्टाविडिन-बाउंड टूल्स के साथ मिलाया जा सकता है, जिसमें फ्लोरोफोरस, मोती, पैरामैग्नेटिक नैनोकणों को पता लगाने के लिए अन्य लोगों के बीच शामिल हैं। लाइव-सेल इमेजिंग के संदर्भ में, क्वांटम डॉट्स (क्यूडी) अक्सर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस बन गए हैं, क्योंकि उनके पास एकल-कण ट्रैकिंग के लिए वांछनीय विशेषताएं हैं, जैसे कि छोटे अणु फ्लोरोफोरस18की तुलना में फोटोब्लैचिंग के लिए बढ़ी हुई चमक और प्रतिरोध।

बीडीएनएफवी का उपयोग करके मोनो-बायोटिनेलेटेड बीडीएनएफ (एलबीटीबीडीएनएफ) का उत्पादन बीडीएनएफवी और बीरा की अभिव्यक्ति को चलाने वाले प्लाज्मिड्स के सह-ट्रांसफैक्शन द्वारा प्राप्त किया गया है, जिसके बाद एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी द्वारा रीकॉम्बिनेंट प्रोटीन की शुद्धि के साथ 1-2 μg बीडीएनएफ प्रति 20 मीटर की उपज के साथ HEK293-कंडीशन संस्कृति मीडिया177. यहां, हम इस प्रोटोकॉल के संशोधन का प्रस्ताव करते हैं जो एचईके 293-वातानुकूलित मीडिया के 500 एमएल से BDNFAvi शुद्धि की अनुमति देता है, जो हेरफेर की आसानी के लिए क्रोमेटोग्राफी-कॉलम आधारित प्रोटोकॉल में प्रोटीन वसूली को अधिकतम करना चाहता है। इस्तेमाल किया ट्रांसफैक्शन एजेंट, पॉलीथीलीनीमाइन (पीआई), ट्रांसफेक्शन उपज का त्याग किए बिना लागत प्रभावी विधि सुनिश्चित करता है। मोनो-बायोटिनिलेशन चरण को सह-ट्रांसफेक्शन से जुड़ी जटिलताओं से बचने और बीडीएनएफ की सजातीय लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए इन विट्रो प्रतिक्रिया के लिए अनुकूलित किया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में बीडीएनएफ के प्रतिगामी अक्षीय परिवहन का अध्ययन करने के लिए पीसीआरईबी और लाइव सेल इमेजिंग की सक्रियता सहित पश्चिमी दाग और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रयोगों द्वारा एमटीबीबीडीएनएफ की जैविक गतिविधि का प्रदर्शन किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग समरूप मोनो-बायोटिनिलेटेड और जैविक रूप से सक्रिय बीडीएनएफ के अनुकूलित, उच्च उपज उत्पादन के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

सभी प्रयोग CONICYT (चिली नेशनल कमीशन फॉर साइंटिफिक एंड टेक्नोलॉजिकल रिसर्च) के अनुमोदित दिशा-निर्देशों के अनुसार किए गए थे । इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल को पोंटिफिरिया यूनीवर्सिड कैटोलिका डी चिली की जैव सुरक्षा और जैवैतिक और पशु कल्याण समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। कशेरुकी से जुड़े प्रयोगों को पोंटिफिरिया यूनीवर्सिड कैटोलिका डी चिली की बायोएथिकल एंड एनिमल वेलफेयर कमेटी ने मंजूरी दी थी ।

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल HEK293 कोशिकाओं में उत्पादित वातानुकूलित माध्यम के 500 मिलीएल की कुल मात्रा से BDNFAvi शुद्ध करने के लिए डिजाइन किया गया था। बीडीएनएफवी को शुद्ध करने के लिए उत्पादित और संसाधित किए जाने वाले वातानुकूलित माध्यम की मात्रा आवश्यकतानुसार ऊपर या डाउनस्केल की जा सकती है। हालांकि, इन परिस्थितियों में आगे अनुकूलन आवश्यक हो सकता है। पूरे प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले संस्कृति मीडिया और बफ़र्स की संरचना पूरक सामग्रियों में पाई जा सकती है।

1. HEK293-वातानुकूलित मीडिया से BDNFAvi का उत्पादन और शुद्धिकरण

  1. HEK293 कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेमी संस्कृति व्यंजनों में पूरक डीएमईएम माध्यम (10% गोजातीय भ्रूण सीरम, 1x ग्लूटामेट पूरक, 1x एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक) में 70% संगम के लिए HEK293 कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    2. मध्यम को ट्रांसफेक्शन बफर में बदलें।
    3. ट्रांसफेक्शन के लिए पी-डीएनए मिश्रण तैयार करें। डीएनए और पी 25 के को पतला करने के लिए क्रमशः दो अलग-अलग 15 एमएल शंकु नलियों का उपयोग करें। एक ट्यूब में 500 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में प्लाज्मिड डीएनए के 20 माइक्रोन को पतला करें। अन्य ट्यूब में 500 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में रैखिक पीई 25K के 60 माइक्रोन पतला करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    4. ध्यान से पी ट्यूब में डीएनए समाधान पिपेट, अप-डाउन गति से एक बार मिश्रण । 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    5. प्रत्येक 15 सेमी डिश में पी-डीएनए मिश्रण की 1 एमसीएल ड्रिप करें। 37 डिग्री पर 3 घंटे के लिए पी-डीएनए मिश्रण के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    6. मध्यम को ताजा इनक्यूबेशन बफर में बदलें।
  2. मीडिया संग्रह और भंडारण
    1. HEK293 कोशिकाओं के ट्रांसफैक्शन के बाद सभी व्यंजन 48 घंटे से माध्यम ले लीजिए। पूरक फ़ाइल 1 के "सुपरनैंट संशोधन बफर" अनुभाग में वर्णित समाधानों के केंद्रित स्टॉक तैयार करें और सूचीबद्ध अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए उन्हें HEK293 सुपरनेटेंट में जोड़ें।
      नोट: कोशिकाओं को छोड़ दिया जा सकता है या आगे के विश्लेषण के लिए बरामद किया जा सकता है ।
    2. 15 मिनट के लिए बर्फ में माध्यम इनक्यूबेट।
    3. मध्यम को अपकेंद्रित्र ट्यूबों में अलीकोट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस सेंट्रलाइज में 45 मिनट के लिए 10,000 एक्स ग्राम पर मध्यम पर सेंट्रलाइज करें। यह कदम मीडिया में निलंबित सेल मलबे और मृत कोशिकाओं के उन्मूलन की अनुमति देता है।
    5. सुपरनेटेंट्स को इकट्ठा करें, 0.1% की अंतिम एकाग्रता पर बीएसए जोड़ें। और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। शुद्धिकरण कदम के दौरान तेजी से विगलन के लिए ठंड से पहले मीडिया को अलीकोट किया जा सकता है ।
      नोट: 2 महीने तक के जमे हुए वातानुकूलित मीडिया के भंडारण समय सकारात्मक परिणाम मिले हैं, अब भंडारण समय का मूल्यांकन नहीं किया गया है ।
  3. मीडिया एकाग्रता और शुद्धि
    1. 37 डिग्री सेल्सियस थर्मोरेगुए बाथ में मीडिया को गल गलें।
    2. मीडिया को अपकेंद्रित्र ट्यूबों में उद्धृत करें ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस कूल्ड सेंट्रलाइज में 3,500 एक्स ग्राम पर 1 घंटे के लिए मध्यम मध्य तक करें। यह कदम क्रोमेटोग्राफी कॉलम के माध्यम से पर्याप्त प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए शेष सेल मलबे को समाप्त करने की अनुमति देता है।
    4. मीडिया को 500 एमएल से घटाकर 100 एमएल करने के लिए 10 केडीए कटऑफ के साथ प्रोटीन कंसंट्रेटर का इस्तेमाल करें। इष्टतम एकाग्रता के लिए निर्माता के अनुशंसित अपकेंद्रित्र मापदंडों का पालन करें।
    5. केंद्रित मीडिया में नी-एनटीए एगर उठे मोतियों के 500 μL जोड़ें और एक घुमाव में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    6. क्रोमेटोग्राफी उपकरण को इकट्ठा करें और मीडिया को इसमें डालें। इसे 5 मिनट के लिए आराम करने दें और फिर मध्यम प्रवाह को जाने के लिए 2-तरह के स्टॉपकॉक को खोलें।
    7. मोतियों को 5 मिनट के लिए वॉश बफर के 5 एमएल से धोएं। कॉलम में मोतियों को फिर से रखना सुनिश्चित करें। 2-तरह के स्टॉपकॉक को खोलकर वॉश बफर को छान लें। 3 बार दोहराएं।
    8. कॉलम में 1 एमएल एल्यूशन बफर जोड़ें। कॉलम में मोतियों को फिर से रखना सुनिश्चित करें। 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट, और फिर एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में एलुएट इकट्ठा। BDNFAvi के पूर्ण उन्मूलन के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएं।
    9. 15% पॉलीएक्रेलैमाइड जेल में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीडीएनएफ (40-160 एनजी) के प्रत्येक एल्यूएट और विभिन्न सांद्रता के 5 माइक्रोन लोड करें। एंटी-बीडीएनएफ एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा शुद्ध प्रोटीन का पता लगाएं।
    10. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीडीएनएफ के साथ तैयार एकाग्रता वक्र का उपयोग करके प्रत्येक एल्यूएट में शुद्ध बीडीएनएफवी की एकाग्रता निर्धारित करें।
    11. Aliquot और शुद्ध BDNFAvi -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. बीईए एंजाइम का उपयोग करके बीडीएनएफवी के इन विट्रो मोनो-बायोटिनिलेशन

  1. इन विट्रो मोनो-बायोटिनाइलेशन रिएक्शन
    1. बायोटिनाइलेशन बफर रिएजेंट्स के केंद्रित स्टॉक समाधान तैयार करें। केंद्रित स्टॉक के उपयोग से रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन के कमजोर पड़ने को कम किया जा सकेगा।
    2. BDNFAvi के 800 एनजी का एक एलिकोट लें और बीडएनएफ के 1:1 मोलर रिलेशन में बायोटिनाइलेशन बफर रिएजेंट्स और एंजाइम बीरा जोड़ें। उदाहरण के लिए, 200 μL अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा जोड़ने के लिए; 100 μL जिसमें 800 एनजी बीडीएनएफवी, 20 माइक्रोन बिसिन 0.5 एम पीएच 8.3, 20 माइक्रोन एटीपी 100 mM, 20 माइक्रोन एमजीओएसी 100 mM, 20 माइक्रोन डी-बायोटिन 500 माइक्रोन, 0.8-1 माइक्रोन से 1 माइक्रोन बीरा-जीएसटी, और अल्ट्रापुरे पानी के साथ 200 माइक्रोन तक पूरा करें।
      नोट: सफल बायोटिनाइलेशन प्रतिक्रियाओं को 400 माइक्रोन के एलिकोट्स के साथ किया गया है जिसमें लगभग 30 एनजी/μL BDNFAvi की एकाग्रता होती है, जिसके परिणामस्वरूप अंतिम प्रतिक्रिया में ~ 20 एनजी/μL की अंतिम एकाग्रता के लिए एक सजातीय बायोटिनेलेटेड BDNFAvi होता है।
    3. 1 घंटे के लिए एक संकरण ओवन में 30 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण इनक्यूबेट । हर 15 मिनट में ट्यूब उलटा द्वारा सामग्री मिलाएं ।
    4. स्टेप 2.1.2 और रिपीट स्टेप 2.1.3 के रूप में एटीपी और बीरा की एक ही मात्रा जोड़ें।
    5. भविष्य के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर रखें (उदाहरण के लिए, बायोटिनाइलेशन गुणवत्ता नियंत्रण)।
  2. बायोटिनिलेशन विश्लेषण
    1. ब्लॉकिंग बफर के 1 एमएल में स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों के 1 एमएल में स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों का ब्लॉक। एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रोटेटर में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    2. चुंबकीय मोतियों को 3 से 5 मिनट के लिए चुंबकीय पृथक्करण रैक का उपयोग करके या जब तक बफर मोतियों से पूरी तरह से साफ नहीं हो जाता है और अवरुद्ध बफर को त्याग देता है।
    3. मोतियों में ताजा ब्लॉकिंग बफर के 50 माइक्रोन और मोनो-बायोटिनाइलेटेड बीडीएनएफवी (एलबीटीबीडीएनएफ) नमूने जोड़ें, जिससे उन्हें पाइप्पेटिंग द्वारा पूरी तरह से पुनर्व्यवस्तु देना सुनिश्चित किया जा सके।
    4. लगभग 20 आरपीएम पर घूमते हुए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रोटेटर में 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    5. 3 से 5 मिनट के लिए चुंबकीय जुदाई रैक का उपयोग कर मोती ले लीजिए, और विश्लेषण के लिए एक 30 μL aliquot रखते हुए, सुपरनैंट इकट्ठा।
    6. पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ एक बार मोतियों को धोएं, और फिर उन्हें 3 से 5 मिनट के लिए चुंबकीय जुदाई रैक का उपयोग करके इकट्ठा करें। सुपरनेट को ठीक करें और विश्लेषण के लिए 30 माइक्रोन एलिकोट रखें।
    7. मोतियों में 4x लोडिंग बफर के 10 माइक्रोल जोड़ें।
    8. एलबीटीबीडीएनएफ को एल्यूट करने के लिए नमूनों को 7 मिनट के लिए 97 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    9. एक एंटी-बीडीएनएफ विशिष्ट एंटीबॉडी19का उपयोग करके mbtBDNF का पता लगाएं ।

3. एमटीबीडीएनएफ जैविक गतिविधि का सत्यापन

  1. पश्चिमी दाग द्वारा पीटीआरकेबी और पीईआरके का पता लगाना।
    1. बीज 2 मिलियन चूहा कॉर्टिकल न्यूरॉन्स 60 मिमी संस्कृति व्यंजनों में।
    2. 7 दिनों (DIV7) के लिए न्यूरॉन्स संस्कृति। फिर, प्रयोग शुरू करते समय माध्यम को गैर-पूरक न्यूरोबेसल मेडिन में बदलें।
    3. मध्यम परिवर्तन के एक घंटे बाद, 50 एनजी/एमएल की अंतिम एकाग्रता में mbtBDNF जोड़ें। 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। एक नकारात्मक नियंत्रण पकवान (BDNF के साथ गैर उत्तेजित) और एक सकारात्मक नियंत्रण पकवान (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध BDNF के ५० एनजी/एमएल के साथ इलाज) रखें ।
    4. मध्यम लीजिए और धीरे से 1x PBS के साथ हर पकवान धोने। 1x पीबीएस को इकट्ठा करें और त्यागें।
    5. बर्फ पर व्यंजन रखें और प्रत्येक पकवान के लिए लाइसिस बफर के 50-80 μL जोड़ें। कोशिकाओं को lyse करने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
      नोट: प्रोटीन डेफोस्फोरिलेशन और गिरावट से बचने के लिए लाइसिस चरण को जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। जोरदार स्क्रैपिंग के 1-2 मिनट पश्चिमी दाग द्वारा ब्याज के प्रोटीन की कल्पना करने के लिए पर्याप्त हैं।
    6. लाइसिस बफर को इकट्ठा करें और 5 एस के लिए उच्चतम गति से भंवर मिक्सर में हलचल करें।
    7. 10 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम (4 डिग्री सेल्सियस) पर लाइसिस बफर को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट को इकट्ठा करें।
    8. बीसीए प्रोटीन क्वांटिफिकेशन प्रोटोकॉल20द्वारा सुपरनैंट की प्रोटीन सामग्री की मात्रा निर्धारित करें ।
    9. प्रति स्थिति 30-50 माइक्रोग्राम प्रोटीन युक्त एक एलिकोट में लोडिंग बफर जोड़ें और इसे पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए 12% पॉलीएक्रेलैमाइड जेल में लोड करें। BDNFAvi जैविक गतिविधि को सत्यापित करने के लिए विशिष्ट फॉस्फो-एंटीबॉडी का उपयोग करके PTrkB और pERK का पता लगाएं।
  2. पीआरईबी इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा बीडीएनएफ-क्यूडी जैविक गतिविधि का सत्यापन।
    1. बीज 40,000 चूहा कॉर्टिकल न्यूरॉन्स 10 मिमी कवर्लिप्स में, पहले ऑटोक्लेव और पॉली-एल-लिसिन के साथ इलाज किया गया जैसा कि पहले21वर्णित है।
    2. 37 डिग्री पर न्यूरोनल रखरखाव बफर (पूरक सामग्री देखें) में 7-8 दिनों के लिए न्यूरॉन्स संस्कृति।
    3. प्रयोग शुरू करने के लिए, माध्यम को बिना लागू न्यूरोबेसल माध्यम में बदलें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. 1:1 बीडीएनएफ-क्यूडी मोलर अनुपात प्राप्त करने के लिए क्वांटम डॉट्स स्ट्रेप्टाविडिन कंजूगेट (स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी) की आवश्यक मात्रा, क्वांटम डॉट स्ट्रेप्टाविडिन कंजूगेट (स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी) को जोड़कर क्वांटम डॉट्स (बीडीएनएफ-क्यूडी) को समायोजित करने के लिए mbtBDNF तैयार करें। फिर, न्यूरोबेसल माध्यम के साथ 20 माइक्रोन तक पतला करें। प्रकाश से बचाने के लिए ट्यूब को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें।
      नोट: क्वांटम डॉट स्ट्रेप्टाविडिन संयुग्मण की एक ही मात्रा के साथ एक और ट्यूब तैयार करें और इसे नकारात्मक नियंत्रण के रूप में न्यूरोबेसल माध्यम के साथ 20 माइक्रोन तक पतला करें।
    5. एक घुमाव में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए mbtBDNF/streptavidin-QD मिश्रण इनक्यूबेट ।
    6. न्यूरोबेसल माध्यम में वांछित अंतिम एकाग्रता (200 पीएम और 2 एनएम) के लिए बीडीएनएफ-क्यूडी को पतला करें।
    7. गैर-पूरक न्यूरोबेसल माध्यम के साथ इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, बीडीएनएफ-क्यूडी या स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी (नियंत्रण) के साथ न्यूरॉन्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 200 पीएम और 2 एनएम बीडीएनएफ की अंतिम एकाग्रता के लिए उत्तेजित करें।
    8. 1x पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ 3 बार कवरस्लिप धोएं और फास्फेटे अवरोधकों वाले 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान के साथ कवरस्लिप का इलाज करके कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए ठीक करें।
    9. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 3 बार धोएं, और फिर 1 एच के लिए अवरुद्ध/पारमेबिलाइजेशन बफर (बीएसए 5%, ट्राइटन एक्स-१०० ०.५%, 1x फॉस्फेट अवरोधक) के साथ इनक्यूबेट करें ।
    10. एंटी-पीक्रीब एंटीबॉडी 1:500 (3% बीएसए, 0.1% ट्राइटन एक्स-100 में) के साथ इनक्यूबेट रात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    11. अगले दिन, 1x पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, और माध्यमिक एंटीबॉडी 1:500 (3% बीएसए, 0.1% ट्राइटन एक्स-100) के साथ 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. 1x पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। 7 मिनट के लिए Hoechst परमाणु दाग समाधान (5 μg/mL) जोड़ें ।
    13. 1x पीबीएस और माउंट के साथ 3 बार धोएं।
  3. लाइव न्यूरॉन्स में बीडीएनएफ-क्यूडी के प्रतिगामी अक्षीय परिवहन का दृश्य
    1. माइक्रोफ्लुइडिक चैम्बर्स और सीड न्यूरॉन्स को पहले बताए गए16के रूप में तैयार करें ।
    2. संस्कृति में 7-8 दिनों के बाद, माध्यम को गैर-पूरक न्यूरोबेसल माध्यम में बदलें।
    3. 1:1 बीडीएनएफ-क्यूडी मोलर अनुपात प्राप्त करने के लिए क्वांटम डॉट्स स्ट्रेप्टाविडिन कंजूगेट (स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी) की आवश्यक मात्रा, क्वांटम डॉट स्ट्रेप्टाविडिन कंजूगेट (स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी) को जोड़कर क्वांटम डॉट्स (बीडीएनएफ-क्यूडी) को समायोजित करने के लिए mbtBDNF तैयार करें। फिर, न्यूरोबेसल माध्यम के साथ 20 माइक्रोन तक पतला करें। प्रकाश से बचाने के लिए ट्यूब को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें।
      नोट: क्वांटम डॉट स्ट्रेप्टाविडिन संयुग्मण की एक ही मात्रा के साथ एक और ट्यूब तैयार करें और इसे नियंत्रण के रूप में न्यूरोबेसल माध्यम के साथ 20 माइक्रोन तक पतला करें।
    4. एक घुमाव में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए mbtBDNF/streptavidin-QD मिश्रण इनक्यूबेट ।
    5. बीडीएनएफ-क्यूडी को वांछित अंतिम एकाग्रता (2 एनएम) में पतला करें।
    6. गैर-पूरक न्यूरोबेसल माध्यम के साथ इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर के अक्षीय डिब्बों में बीडीएनएफ-क्यूडी या नियंत्रण मिश्रण जोड़ें। बीडीएनएफ-क्यूडी के शुद्ध प्रतिगामी परिवहन को सुनिश्चित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 210 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    7. लाइव-सेल इमेजिंग के लिए, माइक्रोग्रूव्स के सेगमेंट में एक्सोनल रेट्रोग्रेड परिवहन की कल्पना करें जो इन उद्देश्यों (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) के लिए उपयुक्त माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 100x उद्देश्य का उपयोग करके सेल बॉडी कंपार्टमेंट के समीपस्थ है। 1 फ्रेम/एस पर छवियों का अधिग्रहण करें ।

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Representative Results

क्रोमेटोग्राफिक कॉलम-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग HEK293 वातानुकूलित मीडिया की महत्वपूर्ण मात्रा के प्रसंस्करण की अनुमति देता है। चित्रा 1में, वातानुकूलित मीडिया के 500 एमएल से बीडीएनएफवी के शुद्धिकरण के परिणाम दिखाए गए हैं। नी-एनटीए एगर उठे मोतियों से BDNFAvi के लगातार elutions BDNFAvi(चित्रा 1A)की सांद्रता कम उपज । लगातार चार एल्यूशन (प्रत्येक स्थायी 15 मिनट) के बाद, मोतियों द्वारा कैप्चर किए गए अधिकांश बीडीएनएफ बरामद किए जाते हैं। एलुएट्स की सांद्रता 6 से 28 एनजी/μL तक है, और कुल उपज बीडीएनएफवी(तालिका 1)के लगभग 60 माइक्रोग्राम की राशि है। उत्पादित बीडीएनएफवी को बीरा-जीएसटी द्वारा मध्यस्थता की गई इन विट्रो प्रतिक्रिया द्वारा कुशलतापूर्वक बायोटिनाइलेटेड किया गया था, जैसा कि सुपरनेट(चित्रा 1 बी)में गैर-बायोटिनिलेटेड बीडीएनएफवी की कमी से प्रदर्शित किया गया था। कृपया ध्यान दें कि चित्रा 1 बी में प्रस्तुत बायोटिनाइलेशन उत्पादित कुल बीडीएनएफ के एक एलिकोट से मेल खाती है, लेकिन प्रतिक्रिया को बड़ी मात्रा के लिए बढ़ाया जा सकता है।

फिर, 2 विभिन्न प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का उपयोग करके एमटीबीडीएनएफ की जैविक गतिविधि का मूल्यांकन किया गया। सबसे पहले, कॉर्टिकल न्यूरॉन्स 60 मिमी प्लेटों (2 मिलियन न्यूरॉन्स, DIV7) में वरीयता प्राप्त 30 मिनट के लिए mbtBDNF के 50 एनजी/एमएल के साथ उत्तेजित किया गया, और फिर प्रोटीन पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए तैयार किए गए थे। पीआरटीकेबी (Y515) और पीईआरके (T202/Y204) का पता लगाकर एमटीबीबीडीएनएफ की जैविक गतिविधि की मात्रा निर्धारित की गई थी। ट्रासेलुलर डोमेन में ऑटोफोस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया के माध्यम से रिसेप्टर की सक्रियता को ट्रिगर करता है, और ईआरके बीडीएनएफ सिग्नलिंग मार्ग22का एक ज्ञात लक्ष्य है। दोनों फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के लिए बैंड में वाणिज्यिक बीडीएनएफ और डीबीबीटीडीएनएफ के साथ इलाज किए गए न्यूरॉन्स में समान तीव्रता थी, और दोनों ने नियंत्रण स्थिति(चित्रा 2 ए)की तुलना में एक मजबूत संकेत दिखाया। फिर, स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी के साथ मिलकर एमटीबीटीबीडीएनएफ की जैविक गतिविधि का मूल्यांकन किया गया ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि उनका उपयोग लाइव इमेजिंग प्रयोगों में किया जा सकता है। कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को 10 मिमी कवर (प्रति कवर 40,000 कोशिकाओं, DIV7) में वरीयता प्राप्त किया गया था और पीसीआरईबी के लिए फिक्सिंग और धुंधला होने से पहले 30 मिनट के लिए 200 पीएम या 2 एनएम बीडीएनएफ-क्यूडी की अंतिम एकाग्रता के साथ इलाज किया गया था। सीआरईबी एक प्रतिलेखन कारक है जिसे कॉर्टिकल न्यूरॉन्स 22,23 में सक्रिय ईआरके1/2 द्वारा लक्षित कियाजाताहै।22 बीडीएनएफ-क्यूडी की बढ़ती सांद्रता के साथ न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने के परिणामस्वरूप सीआरईबी के फॉस्फोरिलेशन की खुराक-निर्भर वृद्धि हुई और नाभिक(चित्रा 2 बी)के आसपास के क्यूडी कणों की उपस्थिति, यह दर्शाता है कि बीडीएनएफ-क्यूडी कणों को एंडोसिटोस किया गया था और बीडीएनएफ-मीडियाटेड TrkB सक्रियण से जुड़े सिग्नलिंग रास्तों की सक्रियता शुरू हो गई थी। बीडीएनएफ-क्यूडी (200 पीएम) की कम एकाग्रता के साथ न्यूरॉन्स को उत्तेजित करते समय पीक्रीब सिग्नल में दो गुना वृद्धि का पता चला, जबकि 2 एनएम के साथ उत्तेजक होने के परिणामस्वरूप पीसीआरईबी सिग्नल(चित्रा 2सी) में 3.5गुना वृद्धि हुई। इन परिणामों से पता चलता है कि बायोटिनाइलेटेड बीडीएनएफवी जैविक रूप से सक्रिय है, और यह स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी के साथ मिलकर अपनी गतिविधि नहीं खोता है, जिससे यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस और लाइव सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त हो जाता है।

अंत में, माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों का उपयोग करके विभाजित संस्कृतियों में बीडीएनएफ-क्यूडी की इमेजिंग क्षमता का मूल्यांकन किया गया। कॉर्टिकल न्यूरॉन्स माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में वरीयता प्राप्त थे (15 मिमी कवर, एक्सोनल और सोमेटोडेंड्रिकिक डिब्बों को अलग करने के लिए प्रति माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर, DIV7 50,000 न्यूरॉन्स और 3.5 घंटे के लिए 2 एनएम बीडीएनएफ-क्यूडी के साथ उत्तेजित किया गया था लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया था, और परिणामस्वरूप केमोग्राफ का उपयोग बीडीएनएफ-क्यूडी युक्त ऑर्गेनेल्स(चित्रा 3 ए)की गति को निर्धारित करने के लिए किया गया था। 0.91 माइक्रोन/एस की औसत गति का पता चला(चित्रा 3बी),जो साइटोप्लाज्मिक डायनेइन-मध्यस्थता परिवहन7,16के पिछलेविश्लेषणोंके अनुरूप है। 2 एनएम स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी के साथ इलाज किए गए माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों ने माइक्रोग्रूव्स में क्यूडी को आगे नहीं दिखाया, जैसा कि कि किमोग्राफ(चित्रा 3 ए)द्वारा दिखाया गया है। एक ही शर्तों के तहत उगाई जाने वाली कोशिकाओं को २१० मिनट के लिए ५०० पीएम या 2 एनएम बीडीएनएफ-क्यूडी के साथ उत्तेजित किया गया था, और फिर परमाणु धुंधला के साथ तय और लेबल किया गया था । जैसा कि चित्रा 3 सीमें दिखाया गया है, न्यूरॉन्स सभी विश्लेषण किए गए उप-डिब्बों में बीडीएनएफ-क्यूडी का खुराक-निर्भर संचय दिखाते हैं, जिसमें माइक्रोग्रूव और सोमैटोडेंड्रिटिक डिब्बे के समीपस्थ और डिस्टल हिस्से शामिल हैं। इसके विपरीत, नियंत्रण न्यूरॉन्स कक्ष भर में लगभग कोई QD संकेत दिखाया । इसलिए, माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में लाइव और फिक्स्ड कोशिकाओं में बीडीएनएफ-क्यूडी का पता लगाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: HEK293 कोशिकाओं में BDNFAvi का उत्पादन और मोनो-बायोटिनिलेशन। HEK293 कोशिकाओं को पी रिएजेंट और एक BDNFAvi एन्कोडिंग प्लाज्मिड का उपयोग करके संक्रमित किया गया था और वातानुकूलित मीडिया को 48 एच के बाद एकत्र किया गया था। BDNFAvi में 6x हिस्टिडीन टैग होता है जो निकल-नाइट्रोटेक्रिएटिक एसिड (नी-एनटीए) क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके शुद्धि की अनुमति देता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनर्संयोजन मानव बीडीएनएफ का ~ 13 केडीए का अपेक्षित आणविक वजन है, जबकि बीडीएनएफवी ~ 18 केडीए का आणविक वजन प्रदर्शित करता है। बीडीएसीवी राल से बंधे लगातार चार एल्यूशन स्टेप्स के साथ पूरी तरह से इल्यूटेड था । (A)घर में तैयार रिकॉम्बिनेंट बीडीएनएफ और कमर्शियल बीडीएनएफ में पता लगाने के लिए एंटी-बीडीएनएफ एंटीबॉडी का इस्तेमाल करने वाला वेस्टर्न दाग । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव बीडीएनएफ की ज्ञात मात्रा और प्रत्येक एल्यूएट के 5 माइक्रोन वाले एलिकोट को बीडीएनएफ के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके बीडीएनएफवी का पता लगाने के लिए एसडीएस-पेज जेल में लोड किया गया था। तालिका 1 प्रत्येक एलुएट में मौजूद बीडीएनएफवी की सांद्रता को इंगित करता है। प्रत्येक एलुएट में बीडीएनएफ की मात्रा और एकाग्रता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीडीएनएफ के एकाग्रता वक्र से घनत्व विश्लेषण और इंटरपोलेशन द्वारा प्राप्त की गई थी। (ख)बीडीएनएफवी बायोटिनाइलेशन का सत्यापन । बायोटिनेलेटेड बीडीएनएफवी (एलबीटीबीडीएनएफ) के अस्सी नैनोग्राम को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए चुंबकीय मोतियों (20% घोल) के साथ स्ट्रेप्टाविडिन के 30 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। फिर, चुंबकीय मोती एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग कर अलग किया गया । स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को बायोटिनाइलेटेड बीडीएनएफवी (मोतियों वाली लेन) को सुते करने के लिए बफर लोड करने के साथ गर्म किया गया था। सुपरनैंट (एसएन लेन) को भी लोडिंग बफर, गर्म और जेल (एसएन लेन) में लोड करने के साथ इलाज किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एमटीबीडीएनएफ जैविक गतिविधि का सत्यापन। (A)DIV7 कॉर्टिकल न्यूरॉन्स सीरम 1 घंटे के लिए भूखे थे, और फिर 30 मिनट के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीडीएनएफ या mbtBDNF के ५० एनजी/एमएल के साथ उत्तेजित । प्रोटीन निकाले गए और एक SDS-पृष्ठ जेल में TrkB और ERK1/2 फॉस्फोरिलेशन के विश्लेषण के लिए लोड किए गए फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर और कुल TrkB और ERK1/2 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रोटीन के कुल स्तर की तुलना में । (ख)DIV7 कॉर्टिकल न्यूरॉन्स सीरम 1 घंटे के लिए भूखे थे, और फिर 200 पीएम या 2 एनएम mbtBDNF की अंतिम एकाग्रता के साथ 30 मिनट के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी (बीडीएनएफ-क्यूडी) के साथ उत्तेजित हो गए। फिर, कोशिकाओं को तय किया गया और फ्लोरीसेंस माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए pCREB को चिह्नित किया गया । (C)परमाणु पीक्रीब फ्लोरेसेंस तीव्रता का मात्राकरण । परिणाम 3 स्वतंत्र प्रयोगों से एक साथ जमा 90 न्यूरॉन्स के अनुरूप हैं, जो मतलब ± एसईएम के रूप में दिखाए गए हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण तुकी के कई तुलना परीक्षण (****p< 0.0001) के साथ एक तरह से ANOVA से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: लाइव और फिक्स्ड सेल में बीडीएनएफ-क्यूडी का विजुअलाइजेशन। (A)माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में उगाए गए DIV7 कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को 3.5 बजे के लिए 2 एनएम बीडीएनएफ-क्यूडी की अंतिम एकाग्रता के साथ अक्षीय डिब्बे में उत्तेजित किया गया था, और फिर माइक्रोग्रूव्स के समीपस्थ भाग को लाइव सेल माइक्रोस्कोपी सेटिंग का उपयोग करके चित्रित किया गया था। नियंत्रण स्थिति के लिए प्रतिनिधि kymographs (स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी के साथ इलाज) और बीडीएनएफ-क्यूडी के साथ उपचार पर दिखाया गया है। (ख)बीडीएनएफ-क्यूडी को आगे बढ़ाने की गति का परिमाणीकरण । मोबाइल समय पर उन लोगों के रूप में परिभाषित किया गया था जो रिकॉर्डिंग के 120 एस में 10 माइक्रोन से अधिक चले गए थे। (ग) माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में उगाए जाने वाले DIV7 कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को एक्सोनल डिब्बे में ५०० पीएम या 2 एनएम के बीडीएनएफ-क्यूडी की अंतिम एकाग्रता के साथ ३.५ बजे के लिए उत्तेजित किया गया था, और फिर नाभिक की कल्पना करने के लिए Hoechst के साथ तय और लेबल किया गया था । सोमाटोडेंड्रिटिक डिब्बे और माइक्रोग्रोव्स के डिस्टल और समीपस्थ भागों की प्रतिनिधि छवियां दिखाई जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एलुएट बीडीएनएफ (एनजी) 5μl में [एनजी/μl] कुल बीडीएनएफ [μg]
E1 142.2 28.4 28.4
E2 101.2 20.2 20.2
E3 65.6 13.1 13.1
E4 30.4 6.1 6.1
67.8

तालिका 1: BDNFAvi शुद्धि उपज का मात्राकरण (अंजीर 1A से संबंधित)। HEK293 कोशिकाओं को एक प्लाज्मिड ड्राइविंग BDNFAvi अभिव्यक्ति से संक्रमित थे, और प्रोटीन नी-एनटीए आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया था । प्रोटीन एकाग्रता और अंतिम उपज की गणना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनर्संयोजन मानव बीडीएनएफ के ज्ञात एकाग्रता वक्र में घनत्व विश्लेषण और इंटरपोलेशन द्वारा की गई थी।

पूरक फ़ाइल 1: संस्कृति मीडिया और बफर घटक कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस लेख में, एक आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी-आधारित प्रक्रिया में एलबीटीबीडीएनएफ के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए एक अनुकूलित पद्धति का वर्णन किया गया है, जो सुंग और सहयोगियों के काम के आधार पर17है। अनुकूलन में लिपोफेक्टामाइन जैसे अधिक महंगे ट्रांसफैक्शन विधियों की दक्षता को बनाए रखते हुए लागत प्रभावी ट्रांसफैक्शन रिएजेंट (पीई) का उपयोग शामिल है। यह अनुकूलन प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण लागत में कमी में तब्दील हो जाता है, जो उच्च लागत प्रभावशीलता को बनाए रखते हुए स्केलेबिलिटी की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल में उपयोग संबंधी विचारों में आसानी भी शामिल है, जिसमें 2 महीने तक वातानुकूलित मीडिया की ठंड शामिल है । ये अनुकूलन प्रक्रिया को प्रत्येक प्रयोगशाला की जरूरतों के अनुकूल बनाते हैं, लागत प्रभावशीलता में सुधार करते हैं, और सजातीय और जैविक रूप से सक्रिय पुनर्संयोजन बीडीएनएफ उत्पन्न करते हैं। प्रोटोकॉल को शंकुसंबंधी ट्यूबों में मोतियों की गुरुत्वाकर्षण वर्षा के साथ क्रोमेटोग्राफी उपकरण के उपयोग को प्रतिस्थापित करके छोटे पैमाने पर प्रस्तुतियों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। यह एक व्यवहार्य पद्धति का गठन किया है, लेकिन इसके कम समय कुशल है और हमारे अनुभव में कम पैदावार में हुई है । बायोटिन-लेबल वाले बीडीएनएफ को फ्लोरोफोरस और पैरामैग्नेटिक नैनोकणों सहित विभिन्न स्ट्रेप्टाविडिन-बाउंड प्रोबेक के साथ युग्मित किया जा सकता है, जिससे बीडीएनएफ पोस्ट-एंडोसाइटिक तस्करी के विश्लेषण के लिए विविध प्रकार के प्रयोगों को करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन सकता है । इसलिए, इस प्रोटीन के लिए एक अनुकूलित और सरल उत्पादन प्रोटोकॉल इस क्षेत्र में काम कर रही प्रयोगशालाओं के लिए अत्यधिक उपयोगी है।

प्रोकैरियोटिक सिस्टम में बीडीएनएफ24जैसे जटिल पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के साथ पुनः संयोजन प्रोटीन का उत्पादन अक्सर प्रोटीन में होता है जो सही ढंग से मुड़ा नहीं जाता है और इस प्रकार खराब जैविक गतिविधि25होती है। इसलिए, बायोएक्टिव प्रोटीन प्राप्त करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति आवश्यक है। पीई के उपयोग को पहले संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं25,26में पुनर्संयोजन प्रोटीन के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में वर्णित किया गया है और अकादमिक प्रयोगशालाओं के संदर्भ में एचईके293 कोशिकाओं के ट्रांसफैक्शन में इसकी दक्षताको 27पर प्रकाश डाला गया है। इसलिए, इस सेल लाइन का उपयोग एक ऐसे पैमाने पर BDNFAvi का उत्पादन करने के लिए एक वैध विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है जिसे अकादमिक प्रयोगशाला द्वारा प्रबंधित किया जा सकता है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल को एक HEK293 सेल लाइन की पीढ़ी द्वारा आगे अनुकूलित किया जा सकता है, जो बीडीएनएफवी से संक्रमित है, जो क्षणिक ट्रांसफेक्शन कदम को समाप्त करेगा, इस प्रकार समय और संसाधनों की बचत होगी। अनुकूलन का एक और संभावित स्रोत अनुयायी कोशिकाओं के बजाय निलंबन में कोशिकाओं का उपयोग है। HEK293 कोशिकाओं को निलंबन में बनाए रखा जा सकता है, जो प्रति लीटर28ग्राम की सीमा में पुनर्संयोजन प्रोटीन की महत्वपूर्ण मात्रा पैदा करता है।

प्रोटोकॉल में एक और सुधार एक इन विट्रो रणनीति का उपयोग करके बीडीएनएफवी प्रोटीन का बायोटिनेलेशन है, जो पिछले वीवो सह-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल में बदलता है। क्षणिक सह-ट्रांसफैक्शन के निर्माण की अभिव्यक्ति के संदर्भ में अप्रत्याशित परिणाम हो सकते हैं, जैसा कि कई सेल लाइनों में और कई ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स29के साथ प्रदर्शित किया गया है। विभिन्न कारक सह-ट्रांसफैक्शन संदर्भ में संक्रमित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं, जिसमें वैक्टर, सेल प्रकार और प्लाज्मिड एकाग्रता शामिल हैं। कारकों की यह बहुलता अनुकूलन और प्रजनन एक जटिल कार्य बनाती है। दूसरी ओर, इन विट्रो पद्धति उन स्थितियों पर बेहतर नियंत्रण की अनुमति देती है जिनमें बायोटिनाइलेशन प्रतिक्रिया होती है। इस पद्धति के परिणामस्वरूप पुनर्संयोजन बीडीएनएफ की प्रजनन योग्य और सजातीय लेबलिंग हो जाती है।

जैसा कि जैविक गतिविधि सत्यापन प्रयोगों द्वारा प्रदर्शित किया गया है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पादित एलबीटीबीडीएनएफ बीडीएनएफ-TrkB सिग्नलिंग पाथवे एक्टिवेशन के संदर्भ में वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध पुनर्संयोजन मानव बीडीएनएफ के बराबर है। आंकड़ों से यह भी पता चलता है कि स्ट्रेप्टाविडिन-क्यूडी के लिए कपलिंग बीडीएनएफ-TrkB सिग्नलिंग में हस्तक्षेप नहीं करता है । इसके अलावा, हमने दिखाया कि बीडएनएफ-क्यूडी का पता लाइव और फिक्स्ड सेल में एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा लगाया जा सकता है। इसलिए, mbtBDNF प्रतिगामी अक्षीय तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है और यह बीडीएनएफ-जीएफपी16जैसे वैकल्पिक जांच पर महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है। इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल mbtBDNF के उत्पादन के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत कार्यप्रणाली प्रदान करता है, जिसका उपयोग TRKB या p75 को व्यक्त करने वाले विभिन्न न्यूरोनल मॉडलों में पोस्ट-एंडोसाइटिक गतिशीलता अध्ययन में किया जा सकता है। बीडीएनएफ सिग्नलिंग में न्यूरोनल,आकृति विज्ञान और कार्य3, 4,,21पर शक्तिशाली प्रभाव पड़ता है, और हाल ही में न्यूरोनल पुनर्जनन30,,31को बढ़ाने के लिए एक संभावित चिकित्सीय उपकरण के रूप में प्रस्तावित किया गया है, जिससे इसका अध्ययन सेलुलर जीव विज्ञान और बायोमेडिसिन के क्षेत्र में प्रासंगिक हो गया है।21 BDNF संकेत और तस्करी के प्रभाव का अध्ययन और न्यूरोनल सेल जीव विज्ञान की हमारी समझ अग्रिम होगा और नैदानिक सेटिंग्स में अपनी पुनर्योजी क्षमता के दोहन के लिए अनुमति दे सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों कृतज्ञता Fondecyt (११७११३७) (FCB), विज्ञान और प्रौद्योगिकी में उत्कृष्टता के बेसल केंद्र (AFB १७०००५) (FCB), मिलेनियम-न्यूकीय से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैus (P07/011-F) (FCB), वेलकम ट्रस्ट सीनियर अन्वेषक पुरस्कार (107116/Z/15/Z) (जीएस) और एक यूके डिमेंशिया रिसर्च इंस्टीट्यूट फाउंडेशन अवार्ड (जीएस) । इस काम को यूनिदाद डी माइक्रोस्कोपिया अवनजादा यूसी (उमा यूसी) ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 way stopcock BioRad 7328102 Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanol Sigma M6250 BDNF elution buffer
Acrylamide/Bisacrylamide BioRad 1610154 SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10K Millipore UFC901024 BDNF concentration
Ammonium Persulfate Sigma A9164 SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibody Sigma T8578 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibody Alomone AGP-021 Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibody Alomone ANT-010 Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibody Cell Signaling 9102 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133) Cell Signaling 9198 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204) Cell Signaling 4370 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515) Abcam ab109684 Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/Antimycotic Gibco 15240-062 HEK293 maintenance
ATP Sigma A26209 BDNF monobiotinylation buffer
B-27 Supplement Gibco 17504-044 Neuron maintenance
Bicine Sigma B3876 BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GST BPS Bioscience 70031 Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal Serum HyClone HC.SH30396.02 HEK293 maintenance
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoResearch 001-000-162 BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-Biotin Sigma B4639 BDNF monobiotinylation buffer
DMEM High Glucose Medium Gibco 11965-092 Neuron seeding
DMEM Medium Gibco 11995-081 HEK293 maintenance
Econo Column Funnel BioRad 7310003 Chromatography apparatus component
EDTA Merck 108418
EZ-ECL Kit Biological Industries 1633664 Protein detection by western blotting
Glutamax Gibco 35050-061 Neuron and HEK293 maintenance
Glycerol Merck 104094 BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse Serum Gibco 16050-122 Neuron seeding
ImageQuant LAS 500 GE Healthcare Life Sciences 29005063 Western blot image acquisition
Imidazole Sigma I55513 BDNF buffer modification component
KCl Winkler BM-1370 PBS component
KH2PO4 Merck 104873 PBS component
Laminin Invitrogen 23017-015 Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing Adaptor BioRad 7323245 Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP Substrate Millipore WBLUF0100 Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2 Merck 105819 BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904 Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads Invitrogen 65001 Biotinylation verification
Na2HPO4 Merck 106586 BDNF buffer modification component
NaCl Winkler BM-1630 PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4 Merck 106346 BDNF buffer modification component
Neurobasal Medium Gibco 21103-049 Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose Beads Qiagen 30210 BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-E Nikon Microscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose Membrane BioRad 1620115 Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU Camera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340 BDNF buffer modification component
Paraformaldehyde Merck 104005 Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 Neuron maintenance
Poli-D-Lysine Corning DLW354210 Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-Lysine Millipore P2363 Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography Column BioRad 7311550 Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25K Polysciences Inc. PLY-0296 HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate Invitrogen Q10121MP Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
Saponin Sigma S4521 Detergent for immunofluorescence assays
Syldgard 184 silicone elastomer base Poirot 4019862 Microfluidic chamber preparation
TEMED Sigma T9281 SDS-PAGE gel preparation
Tris Winkler BM-2000 Lysis buffer component
Triton X100 Merck 108603 Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5% Gibco 15400-054 HEK293 passaging

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References

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न्यूरॉन्स में सेलुलर ट्रैफिकिंग स्टडीज के लिए एक ट्यूब में मोनो-बायोटाइनलेट रेकॉम्बिनेंट बीडीएनएफ को शुद्ध और सीधे मोनो-बायोटाइनलेट रेकॉम्बिनेंट बीडीएनएफ के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल
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Stuardo, N., Moya-Alvarado, G., Ramírez, C., Schiavo, G., Bronfman, F. C. An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons. J. Vis. Exp. (161), e61262, doi:10.3791/61262 (2020).

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