Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

بروتوكول محسن لتنقية ومباشرة أحادية الحيوية المؤتلف BDNF في أنبوب لدراسات الاتجار الخلوي في الخلايا العصبية

Published: July 11, 2020 doi: 10.3791/61262
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3, 4, 1,3
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

Summary

يتم إنتاج BDNF المؤتلف الذي يحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi) في خلايا HEK293 بطريقة فعالة من حيث التكلفة ويتم تنقيته بواسطة الكروماتوغرافيا المتقاربة. ثم BDNFavi هو مباشرة أحادية الحيوية مع إنزيم BirA في أنبوب. يحتفظ BDNFavi و BDNFavi أحادية الفينيل البيولوجية بنشاطهم البيولوجي عند مقارنتها بـ BDNF المتوفرة تجاريًا.

Abstract

يتم إنتاج BDNF المؤتلفة التي تحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi) في خلايا HEK293 ثم تنقيتها بفعالية من حيث التكلفة بواسطة الكروماتوغرافيا التقاربية. تم تطوير بروتوكول قابل للاستنساخ مباشرة أحادية أحادية BDNFAvi مع إنزيم BirA في أنبوب. في هذا التفاعل، يحتفظ BDNFAvi أحادية الحيوية بنشاطه البيولوجي.

تعتبر المغذيات العصبية عوامل نمو مشتقة من الأهداف تلعب دورًا في تطوير الخلايا العصبية وصيانتها. وهي تتطلب آليات نقل سريعة على طول المسار الداخلي للسماح بالإشارة لمسافات طويلة بين مقصورات الخلايا العصبية المختلفة. وقد مكن تطوير الأدوات الجزيئية لدراسة الاتجار بالعقاقير العصبية من التتبع الدقيق لهذه البروتينات في الخلية باستخدام في تسجيل الجسم الحي. في هذا البروتوكول، قمنا بتطوير إجراء الأمثل وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج BDNF أحادية الحيوية. يتم إنتاج متغير BDNF المؤتلف الذي يحتوي على تسلسل أفيين قابل لاتينيلية (BDNFAvi) في خلايا HEK293 في نطاق ميكروغرام ثم تنقيته في إجراء قابل للتطوير بسهولة باستخدام الكروماتوغرافيا التقارب. ويمكن بعد ذلك تنقية BDNF تكون monotinylated متجانسة من خلال رد فعل مباشرة في المختبر مع انزيم BirA في أنبوب. يمكن أن يكون النشاط البيولوجي لBDNF أحادية الحيوية (mbtBDNF) مترافقة إلى streptavidin-الاقتران مع مختلف الفلوروفوريس. تحتفظ BDNFAvi و mbtBDNF بنشاطهما البيولوجي الذي تم إثباته من خلال الكشف عن الأهداف الفوسفورية المصبّعة باستخدام البقع الغربية وتفعيل عامل النسخ CREB على التوالي. باستخدام نقاط الكم streptavidin، كنا قادرين على تصور ميغابايتBDNF استيعابية بالتزامن مع تفعيل CREB، الذي تم الكشف عنه مع جسم مضاد محدد فوسفو-كريب. بالإضافة إلى ذلك ، mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم streptavidin كانت مناسبة لتحليل النقل الرجعي في الخلايا العصبية القشرية التي تزرع في غرف microfluidic. وهكذا، في أنبوب إنتاج mbtBDNF هو أداة موثوقة لدراسة الفسيولوجية الإشارات ديناميات endosome والاتجار في الخلايا العصبية.

Introduction

الخلايا العصبية هي الوحدات الوظيفية للجهاز العصبي التي تمتلك مورفولوجيا معقدة ومتخصصة تسمح بالاتصال المتشابك ، وبالتالي ، فإن توليد السلوك المنسق والمعقد استجابة للمحفزات المتنوعة. الإسقاطات العصبية مثل dendrites والمحاور هي السمات الهيكلية الحرجة المشاركة في الاتصالات العصبية، وs neurotrophins هي اللاعبين الحاسمة في تحديد مورفولوجيا ودالة1. المغذيات العصبية هي عائلة من عوامل النمو المفرزة التي تشمل NGF، NT-3، NT-4، وعامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ (BDNF)2. في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تشارك BDNF في عمليات بيولوجية متنوعة بما في ذلك نقل الأعصاب ، التشجير ، نضوج العمود الفقري المتجني ، التقوية على المدى الطويل ، من بين أمور أخرى3،4. لذلك، BDNF يلعب دورا حاسما في تنظيم وظيفة الخلايا العصبية.

عمليات الخلوية المتنوعة تنظم ديناميات BDNF ووظيفته. على سطح الخلايا العصبية, BDNF يربط مستقبلات التروبوميوسين كيناز B (TrkB) و / أو مستقبلات المغذيات العصبية P75 (p75). يتم endocytosed BDNF-TrkB و BDNF-p75 complexs وفرزها في مختلف العضيات endocytic5,6,7,8. مطلوب الاتجار الصحيح داخل الخلايا من مجمع BDNF / TrkB لإشارات BDNF المناسبة في دوائر الخلايا العصبية المختلفة9,10,11. ولهذا السبب، فإن الفهم العميق لديناميات الاتجار بـ BDNF وتعديلاتها الموجودة في العمليات الفيزيولوجية المرضية أمر ضروري لفهم إشارات BDNF في الصحة والمرض. وسيساعد تطوير أدوات جزيئية جديدة ومحددة لرصد هذه العملية على دفع هذا المجال إلى الأمام والسماح بفهم أفضل للآليات التنظيمية المعنية.

هناك العديد من الأدوات المتاحة لدراسة الاتجار BDNF في الخلايا العصبية. تتضمن المنهجية الشائعة الاستخدام انتقال BDNF المؤتلف الموسومة بجزيئات الفلورسنت مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو البديل أحادي الميل الفلوري الأحمر المتحول من GFP mCherry12،13. ومع ذلك، عيب كبير من إفراط BDNF هو أنه يلغي إمكانية تقديم تركيزات معروفة من هذا neurotrophin. أيضا، قد يؤدي إلى السمية الخلوية، الغموض تفسير النتائج14. استراتيجية بديلة هي transfection من TrkB الموسومة epitope، مثل العلم-TrkB. هذه المنهجية تسمح لدراسة TrkB ديناميات استيعاب15، لكنه ينطوي أيضا على transfection ، والتي قد تؤدي إلى تغيير وظيفة TrkB والسمية الخلوية. للتغلب على هذه العقبات المنهجية، تم تطوير المتغيرات المؤتلفة من NGF و BDNF التي تحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi)، والتي يمكن أن تكون أحادية البيوتينات بواسطة إنزيم بييرا ثنائيات البيوتين،16،17. يمكن أن يقترن BDNF المؤتلفة من الاقتران مع أدوات مختلفة مرتبطة بالسنتبيدين ، والتي تشمل الفلوروفهورات والخرز والجسيمات النانوية شبه المغناطيسية وغيرها للكشف عنها. من حيث التصوير الخلايا الحية، أصبحت النقاط الكمومية (QD) تستخدم كثيرا fluorophores، كما لديهم خصائص مرغوب فيه لتتبع الجسيمات المفردة، مثل زيادة السطوع ومقاومة لphotobleaching بالمقارنة مع الفلوروفوريس جزيء صغير18.

وقد تم إنتاج ثنائيات أحادية BDNF (mbtBDNF) باستخدام BDNFAvi عن طريق co-transfection من plasmids القيادة التعبير عن BDNFAvi وبيرا، تليها تنقية البروتين المؤتلف عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب مع غلة 1-2 ميكروغرام من BDNF لكل 20 مل من HEK293 وسائل الإعلام ثقافة مكيفة17. هنا، نقترح تعديل هذا البروتوكول الذي يسمح لتنقية BDNFAvi من 500 مل من وسائل الإعلام HEK293 مكيفة، والتي تسعى إلى تحقيق أقصى قدر من الانتعاش البروتين في بروتوكول قائم على عمود الكروماتوغرافيا لسهولة التلاعب. وكيل transfection المستخدمة، البولي ايثيلينمين (PEI)، يضمن طريقة فعالة من حيث التكلفة دون التضحية العائد transfection. وقد تم تكييف خطوة أحادية ثنائي الفينيل إلى تفاعل في المختبر لتجنب المضاعفات المرتبطة بالانباتات المشتركة ولضمان وضع علامات متجانسة من BDNF. وقد تجلى النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF من خلال تجارب المجهر لطخة الغربية وفلوريسنس، بما في ذلك تنشيط pCREB والتصوير الحي للخلايا لدراسة النقل المحوري الرجعي لـ BDNF في الغرف الدقيقة الفلورية. استخدام هذا البروتوكول يسمح للإنتاج الأمثل، عالية الإنتاجية من متجانسة أحادية الحيوية و BDNF النشطة بيولوجيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة للجنة الوطنية الشيلية للبحوث العلمية والتكنولوجية. وقد وافقت على البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجان الأمن البيولوجي وأخلاقيات البيولوجيا ورعاية الحيوان التابعة جامعة كاتالونيا في شيلي. وقد وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا ورعاية الحيوان التابعة لمنظمة "الجامعة البابوية الكاثوليكية في شيلي" على إجراء تجارب تشمل الفقاريات.

ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لتنقية BDNFAvi من حجم إجمالي 500 مل من المتوسط مكيفة المنتجة في خلايا HEK293. كمية المتوسط المشروطة التي يتم إنتاجها ومعالجتها لتنقية BDNFAvi يمكن أن يكون أعلى أو تحان حسب الحاجة. ومع ذلك، قد يكون من الضروري تحقيق مزيد من التحسين في ظل هذه الظروف. ويمكن الاطلاع على تكوين وسائط الثقافة والمخازن العازلة المستخدمة في جميع أجزاء البروتوكول في مواد تكميلية.

1. إنتاج وتنقية BDNFAvi من HEK293-مكيفة وسائل الإعلام

  1. نقل خلايا HEK293
    1. تنمو خلايا HEK293 إلى التقاء 70٪ في 15 تكملة DMEM المتوسطة (10٪ مصل الجنين البقري، 1x تكملة الغلوتامات، 1x المضادات الحيوية / المضادة للصم) في 15 سم الأطباق ثقافة في 37 درجة مئوية.
    2. تغيير الوسيطة إلى المخزن المؤقت transfection.
    3. إعداد خليط بي أي-الدنا لتحول. استخدام اثنين من أنابيب المخروطية 15 مل مختلفة لتخفيف الحمض النووي وجزيرة الأمير إدوارد 25 K، على التوالي. تمييع 20 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في حجم النهائي من 500 ميكرولتر في أنبوب واحد. تخفيف 60 ميكروغرام من 25K PEI خطي في حجم النهائي من 500 ميكرولتر في أنبوب آخر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. بعناية ماصة حل الحمض النووي في أنبوب PEI، خلط مرة واحدة عن طريق أعلى إلى أسفل الحركة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
    5. بالتنقيط 1 مل من خليط بي اي-الحمض النووي في جميع أنحاء كل طبق 15 سم. احتضان الخلايا مع خليط بي أي-الحمض النووي لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية.
    6. تغيير وسيطة إلى عازلة حضانة جديدة.
  2. جمع الوسائط وتخزينها
    1. جمع المتوسطة من جميع الأطباق 48 ساعة بعد transfection من خلايا HEK293. إعداد الأرصدة المركزة من الحلول الموصوفة في قسم "العازلة التعديل الفائقة" من الملف التكميلي 1 وإضافتها إلى عظمى HEK293 لتحقيق التركيزات النهائية المذكورة.
      ملاحظة: يمكن تجاهل الخلايا أو استردادها لمزيد من التحليل.
    2. احتضان المتوسطة في الجليد لمدة 15 دقيقة.
    3. Aliquot الوسط في أنابيب الطرد المركزي.
    4. جهاز طرد مركزي في المتوسط 10،000 س ز لمدة 45 دقيقة في جهاز طرد مركزي 4 °C. هذه الخطوة تسمح بإزالة حطام الخلية والخلايا الميتة المعلقة في وسائل الإعلام.
    5. جمع ااابر، إضافة BSA بتركيز نهائي من 0.1٪. ثم تخزين في -20 درجة مئوية. ويمكن نقل وسائل الإعلام قبل تجميد لذوبان أسرع خلال خطوة تنقية.
      ملاحظة: أوقات التخزين من الوسائط المُعدّلة المجمدة التي تصل إلى شهرين قد أسفرت عن نتائج إيجابية، لم يتم تقييم أوقات التخزين الأطول.
  3. تركيز وسائل الإعلام وتنقيتها
    1. ذوبان وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية حمام thermoregulated.
    2. Aliquot وسائل الإعلام في أنابيب الطرد المركزي.
    3. جهاز طرد مركزي متوسط ل 1 ساعة في 3,500 x ز في جهاز طرد مركزي مبرد 4 °C. وتسمح هذه الخطوة بإزالة بقايا حطام الخلايا لضمان التدفق الكافي عبر عمود الكروماتوغرافيا.
    4. استخدام المكثفات البروتين مع قطع 10 كيلو Da للحد من وسائل الإعلام من 500 مل إلى 100 مل. اتبع معلمات الطرد المركزي الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للحصول على التركيز الأمثل.
    5. إضافة 500 μL من ني NTA أنغروس الخرز إلى وسائل الإعلام المركزة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في الروك.
    6. تجميع جهاز الكروماتوغرافيا وصب وسائل الإعلام في ذلك. السماح لها بقية لمدة 5 دقائق ثم فتح stopcock 2-الاتجاه للسماح للتدفق المتوسط من خلال.
    7. غسل الخرز مع 5 مل من مخزن الغسيل لمدة 5 دقائق. تأكد من إعادة تعليق الخرز في العمود. استنزاف المخزن المؤقت من خلال فتح stopcock 2-way. كرر 3 مرات.
    8. إضافة 1 مل من العازلة elution إلى العمود. تأكد من إعادة تعليق الخرز في العمود. احتضان لمدة 15 دقيقة، ومن ثم جمع eluate في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر هذه الخطوة 3 مرات ل elution كاملة من BDNFAvi.
    9. تحميل 5 ميكرولتر من كل مُلَزات وتركيزات مختلفة من BDNF المتاحة تجارياً (40-160 نانوغرام) في هلام بولي كلريد بنسبة 15%. الكشف عن البروتين النقي عن طريق النشاف الغربية باستخدام المضادة BDNF المضادة.
    10. تحديد تركيز BDNFAvi المنقى في كل مُلَح باستخدام منحنى التركيز المعد مع BDNF المتوفرة تجاريًا.
    11. Aliquot وتخزين BDNFAvi المنقى في -80 درجة مئوية.

2. في المختبر أحادية ثنائي الفينيل من BDNFAvi باستخدام انزيم بيرا

  1. في المختبر أحادية التفاعل البيولوجي
    1. إعداد حلول المخزون المركزة من الكواشف العازلة biotinylation. استخدام الأسهم المركزة سوف يقلل من تخفيف البروتين المؤتلف.
    2. خذ aliquot من 800 نانوغرام من BDNFAvi وإضافة الكواشف العازلة biotinylation و BirA انزيم في علاقة 1:1 الضرس إلى BDNF. على سبيل المثال، لحجم التفاعل النهائي 200 μL إضافة; 100 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على 800 نانوغرام من BDNFAvi، 20 ميكرولتر بيسين 0.5 م 8.3، 20 ميكرولتر ATP 100 mM، 20 ميكرولتر MgOAc 100 مل م، 20 ميكرولتر د-البيوتين 500 ميكرومتر، 0.8-1 ميكروغرام إلى 1 ميكرولتر من BirA-GST، وكاملة إلى 200 ميكرولتر مع المياه فائقة الخطورة.
      ملاحظة: تم إجراء تفاعلات اتينيل ناجحة مع 400 ميكروغرام من 400 ميكرولتر تحتوي على تركيز حوالي 30 نانوغرام / ميكرولتر BDNFAvi ، مما أدى إلى BDNFAvi ثنائي حيوي متجانس إلى تركيز نهائي من ~ 20 نانوغرام / ميكرولتر في التفاعل النهائي.
    3. احتضان الخليط في 30 درجة مئوية في فرن التهجين لمدة 1 ساعة. اخلط المحتوى عن طريق انعكاس الأنبوب كل 15 دقيقة.
    4. إضافة نفس وحدة التخزين من ATP و BirA كما في الخطوة 2.1.2 وكرر الخطوة 2.1.3.
    5. يُخزن عند -80 درجة مئوية لإجراء التحليلات المستقبلية أو الاحتفاظ به على الجليد للاستخدام الفوري (على سبيل المثال، مراقبة جودة المعالجة البيولوجية).
  2. تحليل ثنائيات البيوت
    1. كتلة 30 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي streptavidin لكل عينة BDNF في 1 مل من العازلة حظر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في أنبوب microcentrifuge الدوار.
    2. عجلت الخرز المغناطيسي باستخدام رف فصل المغناطيسي لمدة 3 إلى 5 دقائق أو حتى المخزن يظهر تماما مسح الخرز وتجاهل العازلة حظر.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من العازلة منع جديدة و 80 نانوغرام من أحادية الحيوية BDNFAvi (mbtBDNF) عينة إلى الخرز، مع التأكد من resuspend لهم تماما عن طريق pippeting.
    4. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في دوار أنبوب microcentrifuge الغزل في حوالي 20 دورة في الدقيقة.
    5. جمع الخرز باستخدام رف الفصل المغناطيسي لمدة 3 إلى 5 دقائق، وجمع افرا، والحفاظ على aliquot 30 ميكرولتر للتحليل.
    6. غسل الخرز مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، ومن ثم جمعها باستخدام رف الفصل المغناطيسي لمدة 3 إلى 5 دقائق. استرداد فائقة والحفاظ على aliquot 30 ميكرولتر للتحليل.
    7. إضافة 10 μL من 4x تحميل العازلة إلى الخرز.
    8. سخني العينات إلى 97 درجة مئوية لمدة 7 دقائق لـ mbute mbtBDNF.
    9. كشف mbtBDNF باستخدام المضادة المضادة BDNF محددة19.

3 - التحقق من النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF

  1. الكشف عن pTrkB وperk بواسطة لطخة الغربية.
    1. بذور 2 مليون الخلايا العصبية القشرية الفئران في أطباق ثقافة 60 ملم.
    2. ثقافة الخلايا العصبية لمدة 7 أيام (DIV7). ثم، تغيير متوسطة إلى غير مكملة االأصبي المتوسط عند بدء التجربة.
    3. بعد ساعة واحدة من التغيير المتوسط، أضف mbtBDNF إلى تركيز نهائي قدره 50 نانوغرام/مل. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. الحفاظ على طبق التحكم السلبي (غير محفزة مع BDNF) وطبق تحكم إيجابي (تعامل مع 50 نانوغرام / مل من BDNF المتاحة تجاريا).
    4. جمع المتوسطة وغسل بلطف كل طبق مع 1X برنامج تلفزيوني. جمع وتجاهل 1X برنامج تلفزيوني.
    5. ضع الأطباق على الجليد وأضف 50-80 ميكرولتر من عازلة التحلل إلى كل طبق. استخدام مكشطة الخلية لlyse الخلايا.
      ملاحظة: يجب تنفيذ خطوة التحلل بأسرع وقت ممكن لتجنب dephosphorylation البروتين وتدهور. 1-2 دقيقة من الكشط قوية كافية لتصور البروتينات من الفائدة من قبل النشاف الغربية.
    6. جمع العازلة تحلل ويحرك في خلاط دوامة في أعلى سرعة لمدة 5 s.
    7. الطرد المركزي العازلة تحلل في 14،000 س ز (4 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة. جمع supernatant.
    8. كمي محتوى البروتين من عظمى من قبل بروتوكول الكم البروتين BCA20.
    9. إضافة العازلة التحميل إلى aliquot التي تحتوي على 30-50 ميكروغرام من البروتين لكل حالة وتحميله في هلام بولياكريلاميد 12٪ لنشاف الغربية. الكشف عن pTrkB وperK باستخدام أجسام مضادة فوسفو محددة للتحقق من النشاط البيولوجي BDNFAvi.
  2. التحقق من النشاط البيولوجي BDNF-QD بواسطة pCREB من الفلورا المناعية.
    1. البذور 40،000 الخلايا العصبية القشرية الفئران في 10 ملم يغطي، سابقا autoclaved وتعامل مع بولي-L-ليسين كما وصف سابقا21.
    2. ثقافة الخلايا العصبية لمدة 7-8 أيام في العازلة صيانة الخلايا العصبية (انظر المواد التكميلية) في 37 ºC.
    3. لبدء التجربة، قم بتغيير الوسط المتوسط إلى المتوسط العصبي غير المُؤدّن وحضن في 37 درجة مئوية لمدة ساعة.
    4. إعداد mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم (BDNF-QD) عن طريق إضافة إلى mbtBDNF aliquot، وحجم اللازمة من نقطة الكم streptavidin conjugate (Streptavidin-QD) لتحقيق 1:1 BDNF-QD ضروس النسبة. ثم، تخفيف إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
      ملاحظة: إعداد أنبوب آخر مع نفس حجم نقطة الكم streptavidin conjugate وتمييعه إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية كتحكم سلبي.
    5. احتضان mbtBDNF / streptavidin QD خليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الروك.
    6. تخفيف BDNF QD إلى التركيز النهائي المطلوب (200 pM و 2 nM) في الوسط العصبي.
    7. بعد 1 ح من الحضانة مع غير مكملة العصبية المتوسطة، وتحفيز الخلايا العصبية مع BDNF-QD أو Streptavidin-QD (السيطرة) إلى تركيز نهائي من 200 pM و 2 nM من BDNF لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    8. غسل الأغطية 3 مرات مع 1X برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية) وإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة عن طريق علاج غطاء مع 4٪ حل شبهformaldehyde تحتوي على مثبطات فوسفاتاز.
    9. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم احتضان مع حظر / permeabilization العازلة (BSA 5٪، تريتون X-100 0.5٪، 1x فوسفاتاز المانع) لمدة 1 ساعة.
    10. احتضان مع الأجسام المضادة pCREB 1:500 (في 3٪ BSA، 0.1٪ تريتون X-100) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    11. في اليوم التالي، اغسل 3 مرات مع 1x PBS، واحتضان لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية 1:500 (3٪ BSA، 0.1٪ تريتون X-100).
    12. غسل 3 مرات مع 1X PBS. إضافة حل البقع النووية Hoechst (5 ميكروغرام / مل) لمدة 7 دقائق.
    13. غسل 3 مرات مع 1X برنامج تلفزيوني وجبل.
  3. التصور من النقل المحوري الرجعية من BDNF QD في الخلايا العصبية الحية
    1. إعداد غرف microfluidic والخلايا العصبية البذور كما هو موضح سابقا16.
    2. بعد 7-8 أيام في الثقافة، وتغيير المتوسطة إلى غير مكملة العصبي المتوسط.
    3. إعداد mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم (BDNF-QD) عن طريق إضافة إلى mbtBDNF aliquot، وحجم اللازمة من نقطة الكم streptavidin conjugate (Streptavidin-QD) لتحقيق 1:1 BDNF-QD ضروس النسبة. ثم، تخفيف إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
      ملاحظة: إعداد أنبوب آخر مع نفس حجم نقطة الكم streptavidin conjugate وتمييعه إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية كأداة تحكم.
    4. احتضان mbtBDNF / streptavidin QD خليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الروك.
    5. تخفيف BDNF QD إلى التركيز النهائي المطلوب (2 ن م).
    6. بعد 1 ساعة من الحضانة مع المتوسطة العصبية غير مكملة إضافة BDNF QD أو خليط التحكم في مقصورات محور عصبي من غرفة microfluidic. احتضان لمدة 210 دقيقة في 37 درجة مئوية لضمان النقل العكسي صافي BDNF QD.
    7. للتصوير الخلية الحية، تصور نقل الوراء المحوري في الجزء من microgrooves التي هي قريبة إلى مقصورة الجسم الخلية باستخدام هدف 100x باستخدام مجهر مناسب لهذه الغرض (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون). الحصول على الصور في 1 إطار / ثانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام بروتوكول يستند إلى عمود الكروماتوغرافي يسمح بمعالجة كميات كبيرة من وسائط HEK293 مكيفة. في الشكل 1، تظهر نتائج تنقية BDNFAvi من 500 مل من وسائل الإعلام المكيفة. elutions متتالية من BDNFAvi من ني NTA أغاروز الخرز العائد انخفاض تركيزات BDNFAvi (الشكل 1A). بعد أربعة من التلميحات المتتالية (كل منها يدوم 15 دقيقة)، يتم استرداد غالبية BDNF التي تم التقاطها بواسطة الخرز. تتراوح تركيزات الرواد من 6 إلى 28 نانوغرام/ميكرولتر، وبلغ إجمالي الغلة حوالي 60 ميكروغرام من BDNFAvi(الجدول 1). ثم تم إنتاج BDNFAvi biotinylated بكفاءة من قبل رد فعل في المختبر بوساطة BirA-GST، كما يتضح من عدم وجود BDNFAvi غير البيولوجية في كبرى(الشكل 1B). يرجى ملاحظة أن المعالجة الحيوية المعروضة في الشكل 1B تتوافق مع الاقتباس من إجمالي BDNF المنتج ، ولكن يمكن توسيع التفاعل لأحجام أكبر.

ثم تم تقييم النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF باستخدام نهجين تجريبيين مختلفين. أولا، الخلايا العصبية القشرية بذر في 60 ملم لوحات (2 مليون الخلايا العصبية، DIV7) تم تحفيز مع 50 نانوغرام/مل من mbtBDNF لمدة 30 دقيقة، ومن ثم تم إعداد البروتينات لتحليل البقعة الغربية. تم تحديد النشاط البيولوجي للميغا بايتBDNF كمياً عن طريق الكشف عن pTrkB (Y515) وpERK (T202/Y204). ربط BDNF إلى TrkB يؤدي إلى تنشيط مستقبلات من خلال رد فعل autophosphorylation في مجالها داخل الخلايا، وERK هو هدف معروف من BDNF إشارة مسار22. وكان نطاقات لكل من البروتينات الفوسفورية كثافة مماثلة في الخلايا العصبية تعامل مع BDNF التجارية وmbtBDNF، وكلاهما أظهر إشارة أقوى من حالة التحكم(الشكل 2A). ثم تم تقييم النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF مقرونًا بـ Streptavidin-QD لإثبات أنه يمكن استخدامها في تجارب التصوير الحي. تم زرع الخلايا العصبية القشرية في 10 ملم يغطي (40،000 الخلايا لكل غطاء، DIV7) وعالجت مع تركيز نهائي من 200 درجة ص أو 2 NM BDNF-QD لمدة 30 دقيقة قبل تحديد وتلطيخ لpCREB. CREB هو عامل النسخ الذي يستهدفه ERK1/2 المنشط في الخلايا العصبية القشرية22,23. وأدى تحفيز الخلايا العصبية مع زيادة تركيزات BDNF-QD إلى زيادة تعتمد على الجرعة من الفوسفور من CREB ووجود جزيئات QD المحيطة النواة(الشكل 2B)،مما يشير إلى أن جزيئات BDNF-QD كانت endocytosed وأثار تنشيط مسارات إشارة المرتبطة تنشيط TrkB بوساطة BDNF. تم الكشف عن زيادة ضعفي في إشارة pCREB عند تحفيز الخلايا العصبية مع تركيز منخفض من BDNF-QD (200 درجة مئوية)، في حين أدى التحفيز مع 2 nM إلى زيادة 3.5 أضعاف في إشارة pCREB(الشكل 2C). هذه النتائج تثبت أن BDNFAvi الحيوي نشط بيولوجيا، وأنه لا يفقد نشاطه عندما يقترن streptavidin QD، مما يجعلها مناسبة للflufluorescence والتصوير بالخلايا الحية.

وأخيراً، تم تقييم إمكانات التصوير لدى BDNF-QD في الثقافات المجزأة باستخدام غرف microfluidic. تم زرع الخلايا العصبية القشرية في غرف microfluidic (15 ملم يغطي، 50,000 خلية عصبية لكل غرفة microfluidic, DIV7) لفصل مقصورات محور عصبي وsmatodendritic وتم تحفيزها مع 2 NM BDNF-QD ل3.5 ح تم إجراء المجهر الخلية الحية، واستخدمت kymographs الناتجة لتحديد سرعة BDNF-QD التي تحتوي على العضيات(الشكل 3A). تم الكشف عن متوسط سرعة الحركة من 0.91 ميكرومتر / ث (الشكل 3B) ، وهو ما يتماشى مع التحليلات السابقة للنقل بالوساطة cytoplasmic dynein7،16. لم تظهر الغرف microfluidic تعامل مع 2 nM streptavidin-QD QDs تتحرك في microgrooves، كما هو مبين في kymograph (الشكل 3A). تم تحفيز الخلايا التي نمت في ظل نفس الظروف مع 500 pM أو 2 NM BDNF-QD لمدة 210 دقيقة، ثم ثابتة ووصفت مع تلطيخ نووي. كما هو مبين في الشكل 3C، تظهر الخلايا العصبية تراكمًا يعتمد على الجرعة من BDNF-QD في جميع المقصورات الفرعية المحللة ، بما في ذلك الأجزاء القريبة والهية من المغذيات الدقيقة والمقصورة الصبحية. في المقابل، أظهرت الخلايا العصبية السيطرة تقريبا أي إشارة QD في جميع أنحاء الغرفة. لذلك، يمكن الكشف عن BDNF-QD في الخلايا الحية والثابتة في الغرف microfluidic.

Figure 1
الشكل 1: إنتاج ثنائي ثنائي أحادي من BDNFAvi في خلايا HEK293. تم إصابة خلايا HEK293 باستخدام كاشف PEI و BDNFAvi ترميز البلازميد وتم جمع وسائل الإعلام المشروطة بعد 48 ح. يحتوي BDNFAvi على علامة 6x Histidine تسمح بالتنقية باستخدام حمض النيكل نيتريلورياستيك (Ni-NTA) chromatography. يتوفر تجارياً المؤتلف BDNF الإنسان لديه الوزن الجزيئي المتوقع من ~ 13 كيلو Da، في حين BDNFAvi يعرض الوزن الجزيئي من ~ 18 كيلو Da. BDNFAvi ملزمة إلى الراتنج كان مُلَجَمَاً بالكامل بأربع خطوات متتالية. (أ)لطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة BDNF للكشف في المنزل أعدت BDNF المؤتلف والتجارية BDNF. تم تحميل Aliquots التي تحتوي على كميات معروفة من BDNF البشرية المتاحة تجاريا و 5 ميكرولتر من كل مُلِد في هلام SDS-PAGE للكشف عن BDNFAvi باستخدام جسم مضاد ضد BDNF. ويبين الجدول 1 تركيزات BDNFAvi الموجودة في كل مُسَل. تم الحصول على كمية وتركيز BDNF في كل مُمَيّة من خلال تحليل قياس الكثافة والاستيفاء من منحنى تركيز BDNF المتاح تجاريًا. (B) التحقق من ثنائيات BDNFAvi الحيوية. تم احتضان ثمانين نانوغرام من BDNFAvi (mbtBDNF) من الكائنات النانوية الحيوية (mbtBDNF) مع 30 ميكرولتر من streptavidin إلى جانب الخرز المغناطيسي (20٪ ملاط) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. ثم تم عزل الخرز المغناطيسي باستخدام فاصل مغناطيسي. تم تسخين الخرز streptavidin مع العازلة التحميل إلى elute BDNFAvi biotinylated (حارة الخرز). كما عولج المُنَاط (ممر SN) بمخزن التحميل المؤقت، والساخنة والمحملة في الجل (ممر SN). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحقق من النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF. (A) كانت الخلايا العصبية القشرية DIV7 في مصل جائع لمدة 1 ساعة ، ثم حفزت مع 50 نانوغرام / مل من BDNF المتاحة تجاريا أو mbtBDNF لمدة 30 دقيقة. تم استخراج البروتينات وتحميلها في هلام SDS-PAGE لتحليل TrkB و ERK1/2 فوسفوريليشن باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو ومقارنتها بالمستويات الإجمالية للبروتين باستخدام الأجسام المضادة ضد مجموع TrkB و ERK1/2. (B)كانت الخلايا العصبية القشرية DIV7 في مصل جائع لمدة 1 ساعة ، ثم تم تحفيزها بتركيز نهائي من 200 درجة ص أو 2 nM من mbtBDNF مقرونة بـ Streptavidin-QD (BDNF-QD) لمدة 30 دقيقة. ثم تم إصلاح الخلايا وتم وضع علامة على pCREB لتحليل المجهر المفلور. (C)القياس الكمي كثافة الفلورية pCREB النووية. تتوافق النتائج مع 90 خلية عصبية تم تجميعها من 3 تجارب مستقلة، تظهر على أنها متوسط ± SEM. يتوافق التحليل الإحصائي مع ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار المقارنات المتعددة لـ Tukey (****p < 0.0001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التصور من BDNF-QD في الخلايا الحية وثابتة. (A)تم تحفيز الخلايا العصبية القشرية DIV7 التي تزرع في الغرف الدقيقة فلورية في مقصورة محور عصبي مع تركيز نهائي من 2 NM BDNF-QD لمدة 3.5 ساعة، ومن ثم تم تصوير الجزء القريب من الميكروبروفوس باستخدام إعداد المجهر الخلية الحية. تظهر كيموغرافات تمثيلية لحالة التحكم (المعالجة بـ streptavidin-QD) وعند العلاج بـ BDNF-QD. (ب)القياس الكمي لسرعة تحريك BDNF-QD. تم تعريف البونكتا المتنقلة بأنها تلك التي انتقلت أكثر من 10 ميكرومتر في 120 s من التسجيل. (C) تم تحفيز الخلايا العصبية القشرية DIV7 التي تزرع في غرف microfluidic في مقصورة محور عصبي مع تركيز نهائي من BDNF-QD من 500 درجة مئوية أو 2 nM لمدة 3.5 ساعة، ثم ثابتة ووسمت مع Hoechst لتصور النوى. وتظهر صور تمثيلية للحجرة الرماوية والأجزاء البعيدة والقريبة من الغرويات الصغيرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الـ Eluate BDNF (نانوغرام) في 5μl [نانوغرام/ميكرولتر] إجمالي BDNF [ميكروغرام]
E1 142.2 28.4 28.4
هاء2 101.2 20.2 20.2
E3 65.6 13.1 13.1
هاء -4 30.4 6.1 6.1
67.8

الجدول 1: القياس الكمي لغلة تنقية BDNFAvi (المتعلقة بالينية 1 ألف). تم إصابة خلايا HEK293 بتعبير BDNFAvi يقود BDNFAvi ، وتم تنقية البروتين من قبل الكروماتوغرافيا تقارب Ni-NTA. تم حساب تركيز البروتين والعائد النهائي من خلال التحليل الكثافة والاستيفاء في منحنى التركيز المعروف لـ BDNF البشري المؤتلف المتوفر تجاريًا.

ملف إضافي 1: الوسائط الثقافية ومكونات المخزن المؤقت الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، يتم وصف منهجية الأمثل لإنتاج وتنقية mbtBDNF في إجراء قائم على اللونية تقارب، استنادا إلى عمل سونغ والمتعاونين17. وتشمل التحسينات استخدام كاشف نقل فعال من حيث التكلفة (PEI) مع الحفاظ على كفاءة أساليب نقل أكثر تكلفة مثل الدهون. ويترجم هذا التحسين إلى تخفيض كبير في تكلفة البروتوكول، مما يسمح بالتدرج مع الحفاظ على فعالية عالية من حيث التكلفة. ويتضمن البروتوكول أيضا اعتبارات سهولة الاستخدام، بما في ذلك تجميد وسائل الإعلام المكيفة لمدة تصل إلى شهرين. هذه التحسينات تجعل الإجراء قابلاً للتكيف مع احتياجات كل مختبر، وتحسين فعالية التكلفة، و الإنتاجية متجانسة ونشطة بيولوجيا BDNF. ويمكن أيضا تكييف البروتوكول مع الإنتاجات الصغيرة الحجم عن طريق استبدال استخدام جهاز الكروماتوغرافيا بهطول الجاذبية من الخرز في الأنابيب المخروطية. وهذا يشكل منهجية قابلة للتطبيق، ولكنها أقل كفاءة في الوقت، وقد أدت إلى انخفاض غلة تجربتنا. ويمكن بعد ذلك أن تقترن BDNF المسمى البيوتين بمسبارات مختلفة مرتبطة بالوسط، بما في ذلك الفلوروفور والجسيمات النانوية الخافتة، مما يجعلها أداة قيمة لإجراء أنواع متنوعة من التجارب لتحليل الاتجار بالأشخاص بعد انتهاء النفاد. لذلك ، فإن بروتوكول إنتاج محسن وبسيط لهذا البروتين مفيد للغاية للمختبرات العاملة في هذا المجال.

إنتاج البروتينات المؤتلفة مع تعديلات معقدة بعد الترجمة، مثل BDNF24، في أنظمة prokaryotic غالبا ما يؤدي إلى البروتينات التي لا يتم طيها بشكل صحيح وبالتالي لديها ضعف النشاط البيولوجي25. ولذلك، والتعبير في خلايا الثدييات ضروري للحصول على البروتين النشط بيولوجيا. وقد وصف استخدام PEI سابقا كبديل قابل للتطبيق لإنتاج واسع النطاق من البروتينات المؤتلفة في الخلايا الثدييات المصابة25,26, وقد تم تسليط الضوء على كفاءتها في نقل خلايا HEK293 في سياق المختبرات الأكاديمية27. لذلك، يمثل استخدام خط الخلية هذا خيارًا صالحًا لإنتاج BDNFAvi على مقياس يمكن إدارته من قبل مختبر أكاديمي. ويمكن تحسين البروتوكول المقترح أكثر من ذلك من خلال توليد خط خلية HEK293 المصابة بشكل ثابت BDNFAvi ، والتي من شأنها القضاء على خطوة النقل العابرة ، وبالتالي توفير الوقت والموارد. مصدر آخر محتمل للتحسين هو استخدام الخلايا في التعليق بدلا من الخلايا المنضمة. يمكن الحفاظ على خلايا HEK293 في التعليق، وتوليد كميات كبيرة من البروتين المؤتلف في نطاق غرام لكل لتر28.

وثمة تحسن آخر في البروتوكول هو الحقنة الحيوية للبروتين BDNFAvi باستخدام استراتيجية في المختبر، والاستعاضة عن السابق في بروتوكول vivo co-transfection. يمكن أن يكون النقل المشترك العابر نتائج غير متوقعة من حيث التعبير عن الثوابت ، كما تم إثباته في خطوط الخلايا المتعددة ومع عدة الكواشف transfection29. يمكن أن تؤثر عوامل مختلفة على التعبير عن البروتينات المُصابة بالعدوى في سياق التسرّد المشترك، بما في ذلك النواقل وأنواع الخلايا وتركيز البلازميد. هذا التعدد من العوامل يجعل التحسين والتكرار مهمة معقدة. من ناحية أخرى ، تسمح منهجية في المختبر بتحكم أفضل في الظروف التي يحدث فيها تفاعل ثنائي الفينيل الحيوي. هذه المنهجية ينتج في وضع العلامات القابلة للاستنساخ ومتجانسة من BDNF المؤتلف.

كما يتضح من تجارب التحقق من النشاط البيولوجي، فإن mbtBDNF المنتجة باستخدام هذا البروتوكول مماثلة لBDNF الإنسان المؤتلف المتاحة تجاريا من حيث BDNF-TrkB إشارة المسار التنشيط. وتظهر البيانات أيضا أن اقتران BDNF إلى streptavidin QD لا تتداخل مع BDNF-TrkB الإشارات. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا أنه يمكن اكتشاف BDNF-QD عن طريق المجهر الضوئي في الخلايا الحية والثابتة. ولذلك، يمثل mbtBDNF أداة قيمة لدراسة الاتجار بمحور المحاور الرجعية، وهو يقدم مزايا كبيرة على التحقيقات البديلة، مثل BDNF-GFP16. البروتوكول الموصوف في هذه المقالة يوفر منهجية موثوقة ومتسقة لإنتاج mbtBDNF، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك في دراسات ديناميات ما بعد endocytic في نماذج الخلايا العصبية المختلفة التي تعبر عن TrkB أو p75. إشارات BDNF له آثار قوية على مورفولوجيا الخلايا العصبية والوظيفة3,4,21, وقد اقترح مؤخرا كأداة علاجية محتملة لتعزيز تجديد الخلايا العصبية30,31, مما يجعل دراستها ذات الصلة في مجالات البيولوجيا الخلوية والطب الحيوي. دراسة آثار إشارات BDNF والاتجار سوف تزيد من تعزيز فهمنا لبيولوجيا الخلايا العصبية وربما تسمح لتسخير إمكاناتها التجديدية في البيئات السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي من Fondecyt (1171137) (FCB) ، ومركز القاعدية للتميز في العلوم والتكنولوجيا (AFB 170005) (FCB) ، Millenium - Nucleus (AFB 170005) ، ميلينيوم - نيوكليوس (AFB) P07/011-F( FCB)، وجائزة ويلكوم تراست لكبار المحققين (107116/Z/15/Z) (GS) وجائزة مؤسسة معهد بحوث الخرف في المملكة المتحدة (GS). وقد دعم هذا العمل اتحاد الميكروسكوبيا أفانزادا UC .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 way stopcock BioRad 7328102 Chromatography apparatus component
2-mercaptoethanol Sigma M6250 BDNF elution buffer
Acrylamide/Bisacrylamide BioRad 1610154 SDS-PAGE gel preparation
Amicon Ultra-15 10K Millipore UFC901024 BDNF concentration
Ammonium Persulfate Sigma A9164 SDS-PAGE gel preparation
anti B-III-Tubulin antibody Sigma T8578 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti BDNF antibody Alomone AGP-021 Western blot assays for BDNF quantification
anti BDNF antibody Alomone ANT-010 Western blot assays for BDNF quantification
Anti ERK antibody Cell Signaling 9102 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pCREB antibody (S133) Cell Signaling 9198 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pERK antibody (T202, Y204) Cell Signaling 4370 Western blot assays for BDNF biological activity detection
anti pTrkB antibody (Y515) Abcam ab109684 Western blot assays for BDNF biological activity detection
Antibiotic/Antimycotic Gibco 15240-062 HEK293 maintenance
ATP Sigma A26209 BDNF monobiotinylation buffer
B-27 Supplement Gibco 17504-044 Neuron maintenance
Bicine Sigma B3876 BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GST BPS Bioscience 70031 Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation
Bovine Fetal Serum HyClone HC.SH30396.02 HEK293 maintenance
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoResearch 001-000-162 BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence
D-Biotin Sigma B4639 BDNF monobiotinylation buffer
DMEM High Glucose Medium Gibco 11965-092 Neuron seeding
DMEM Medium Gibco 11995-081 HEK293 maintenance
Econo Column Funnel BioRad 7310003 Chromatography apparatus component
EDTA Merck 108418
EZ-ECL Kit Biological Industries 1633664 Protein detection by western blotting
Glutamax Gibco 35050-061 Neuron and HEK293 maintenance
Glycerol Merck 104094 BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays
Hettich Rotina 46R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for clearing the medium of debris
Hettich Universal 32R Centrifuge Hettich Discontinued Centrifuge used for protein concentrator centrifugation
Horse Serum Gibco 16050-122 Neuron seeding
ImageQuant LAS 500 GE Healthcare Life Sciences 29005063 Western blot image acquisition
Imidazole Sigma I55513 BDNF buffer modification component
KCl Winkler BM-1370 PBS component
KH2PO4 Merck 104873 PBS component
Laminin Invitrogen 23017-015 Cover coating for compartmentalized neurons
Luer Tubing Adaptor BioRad 7323245 Chromatography apparatus component
Luminata™ Forte Western HRP Substrate Millipore WBLUF0100 Protein detection by western blotting
Mg(CH3COO)2 Merck 105819 BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904 Mounting reagent for immunofluorescence assays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads Invitrogen 65001 Biotinylation verification
Na2HPO4 Merck 106586 BDNF buffer modification component
NaCl Winkler BM-1630 PBS component, BDNF buffer modification component
NaH2PO4 Merck 106346 BDNF buffer modification component
Neurobasal Medium Gibco 21103-049 Neuron maintenance
Ni-NTA Agarose Beads Qiagen 30210 BDNF AviTag purification
Nikon Ti2-E Nikon Microscope for fluorescence imaging
Nitrocellulose Membrane BioRad 1620115 Protein transfer for western blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU Camera for epifluorescence imaging
P8340 Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8340 BDNF buffer modification component
Paraformaldehyde Merck 104005 Fixative for immunofluorescence assays
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 Neuron maintenance
Poli-D-Lysine Corning DLW354210 Cover coating for compartmentalized neurons
Poli-L-Lysine Millipore P2363 Cover coating for non-compartmentalized neurons
Poly-Prep Chromatography Column BioRad 7311550 Chromatography apparatus component
Polyethyleneimine 25K Polysciences Inc. PLY-0296 HEK293 transfection
Quantum Dots 655 streptavidin conjugate Invitrogen Q10121MP Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments
Saponin Sigma S4521 Detergent for immunofluorescence assays
Syldgard 184 silicone elastomer base Poirot 4019862 Microfluidic chamber preparation
TEMED Sigma T9281 SDS-PAGE gel preparation
Tris Winkler BM-2000 Lysis buffer component
Triton X100 Merck 108603 Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays
Trypsin-EDTA 0.5% Gibco 15400-054 HEK293 passaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
  24. Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Tags

علم الأعصاب، الإصدار 161، BDNF، أحادية ثنائي الفينيل، نقاط الكواتوم، الاتجار المحوري، تنقية البروتين، ديناميات إندوسوم، في تتبع الجسم الحي
بروتوكول محسن لتنقية ومباشرة أحادية الحيوية المؤتلف BDNF في أنبوب لدراسات الاتجار الخلوي في الخلايا العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stuardo, N., Moya-Alvarado, G.,… More

Stuardo, N., Moya-Alvarado, G., Ramírez, C., Schiavo, G., Bronfman, F. C. An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons. J. Vis. Exp. (161), e61262, doi:10.3791/61262 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter