Summary
Rekombinant BDNF som inneholder en Avi-sekvens (BDNFAvi) produseres i HEK293-celler på en kostnadseffektiv måte og renses av affinitetkromatografi. BDNFavi blir deretter direkte mono-biotinylert med enzymet BirA i et rør. BDNFavi og mono-biotinylated BDNFavi beholder sin biologiske aktivitet sammenlignet med kommersielt tilgjengelig BDNF.
Abstract
Rekombinant BDNF som inneholder en Avi-sekvens (BDNFAvi) produseres i HEK293-celler og deretter kostnadseffektivt renset av affinitetkromatografi. En reproduserbar protokoll ble utviklet for å direkte mono-bio-tinylate BDNFAvi med enzymet BirA i et rør. I denne reaksjonen beholder mono-biotinylert BDNFAvi sin biologiske aktivitet.
Neurotrophins er målavledede vekstfaktorer som spiller en rolle i nevronal utvikling og vedlikehold. De krever raske transportmekanismer langs den endokytiske veien for å tillate langdistansesignal mellom forskjellige nevronale rom. Utviklingen av molekylære verktøy for å studere smugling av neurotrophins har gjort det mulig for nøyaktig sporing av disse proteinene i cellen ved hjelp av in vivo-opptak. I denne protokollen utviklet vi en optimalisert og kostnadseffektiv prosedyre for produksjon av mono-biotinylated BDNF. En rekombinant BDNF-variant som inneholder en biotinylable avi-sekvens (BDNFAvi) produseres i HEK293-celler i mikrogramområdet og deretter renses i en lett skalerbar prosedyre ved hjelp av affinitetkromatografi. Den rensede BDNF kan deretter homogent være mono-biotinylated av en direkte in vitro reaksjon med enzymet BirA i et rør. Den biologiske aktiviteten til den mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) kan konjugeres til streptavidin-konjugert til forskjellige fluorofofag. BDNFAvi og mbtBDNF beholder sin biologiske aktivitet demonstrert gjennom påvisning av nedstrøms fosforylerte mål ved hjelp av henholdsvis vestlig blot og aktivering av transkripsjonsfaktoren CREB. Ved hjelp av streptavidin-quantum prikker, var vi i stand til å visualisere mbtBDNF internalisering samtidig med aktivering av CREB, som ble oppdaget med et fosfo-CREB spesifikt antistoff. I tillegg var mbtBDNF konjugert til streptavidin-quantum prikker egnet for retrograd transportanalyse i kortikale nevroner dyrket i mikrofluidiske kamre. Dermed, i rør produsert mbtBDNF er et pålitelig verktøy for å studere fysiologisk signalisering endosome dynamikk og menneskehandel i nevroner.
Introduction
Nevroner er de funksjonelle enhetene i nervesystemet som har en kompleks og spesialisert morfologi som tillater synaptisk kommunikasjon, og dermed generering av koordinert og kompleks oppførsel som svar på ulike stimuli. Nevronale projeksjoner som dendritter og aksoner er kritiske strukturelle egenskaper involvert i nevronal kommunikasjon, og neurotrophins er avgjørende aktører i å bestemme deres morfologi og funksjon1. Neurotrophins er en familie av utskilte vekstfaktorer som inkluderer NGF, NT-3, NT-4, og hjerne-avledet nevrotrofisk faktor (BDNF)2. I sentralnervesystemet (CNS) deltar BDNF i ulike biologiske prosesser, inkludert nevrotransmisjon, dendrittisk arborisering, modning av dendrittiske spines, langsiktig potensering, blant annet3,4. Derfor spiller BDNF en kritisk rolle i å regulere nevronal funksjon.
Ulike cellulære prosesser regulerer BDNF-dynamikken og funksjonen. På den nevronale overflaten binder BDNF tropomyosinreseptorkinase B (TrkB) og/eller p75 neurotrophinreseptoren (p75). BDNF-TrkB og BDNF-p75 komplekser er endokytosed og sortert i forskjellige endokytiske organeller5,,6,,7,,8. Korrekt intracellulær smugling av BDNF/TrkB-komplekset er nødvendig for riktig BDNF-signalering i forskjellige nevronale kretser9,,10,,11. Av denne grunn er en dyp forståelse av BDNF trafficking dynamikk og dens endringer som finnes i patofysiologiske prosesser avgjørende for å forstå BDNF signalering i helse og sykdom. Utviklingen av nye og spesifikke molekylære verktøy for å overvåke denne prosessen vil bidra til å drive dette feltet fremover og tillate en bedre forståelse av de regulatoriske mekanismene som er involvert.
Det finnes flere verktøy tilgjengelig for studiet av BDNF smugling i nevroner. En vanlig metodikk innebærer transfeksjon av rekombinant BDNF merket med fluorescerende molekyler som grønt fluorescerende protein (GFP) eller den monomeriske fluorescerende rødforskjøvet variant av GFP mCherry12,13. Imidlertid er en stor mangel på BDNF overuttrykk at det eliminerer muligheten for å levere kjente konsentrasjoner av denne nevrotrophin. Det kan også føre til cellulær toksisitet, som skjuler tolkningen av resultatene14. En alternativ strategi er transfeksjon av en epitop-merket TrkB, for eksempel Flag-TrkB. Denne metodikken gjør det mulig å studere TrkB internaliseringsdynamikk15, men det innebærer også transfeksjon, noe som kan resultere i endret TrkB-funksjon og cellulær toksisitet. For å overvinne disse metodiske hindringer, rekombinant varianter av NGF og BDNF inneholder en Avi sekvens (BDNFAvi), som kan være mono-biotinylated av biotin-ligase enzymet BirA, ble utviklet16,17. Biotinylert rekombinant BDNF kan kobles til forskjellige streptavidin-bundne verktøy, som inkluderer fluorofos, perler, paramagnetiske nanopartikler blant annet for deteksjon. Når det gjelder levende celleavbildning, har kvanteprikker (QD) blitt ofte brukt fluoroforeer, da de har ønskelige egenskaper for enkeltpartikkelsporing, for eksempel økt lysstyrke og motstand mot fotobleking sammenlignet med små molekylfluorophores18.
Produksjonen av mono-biotinylert BDNF (mbtBDNF) ved hjelp av BDNFAvi er oppnådd ved samtidig transfeksjon av plasmider som driver uttrykket av BDNFAvi og BirA, etterfulgt av rensing av rekombinant protein ved affinitet kromatografi med et utbytte på 1-2 μg BDNF per 20 ml HEK293-condition kultur media17. Her foreslår vi en endring av denne protokollen som gjør det mulig for BDNFAvi rensing fra 500 ml HEK293-conditioned media, som søker å maksimere protein utvinning i en kromatografi-kolonne basert protokoll for enkel manipulering. Det brukte transfeksjonsmidlet, polyetylenimin (PEI), sikrer en kostnadseffektiv metode uten å ofre transfeksjonsutbytte. Mono-biotinylation trinnet har blitt tilpasset en in vitro reaksjon for å unngå komplikasjoner forbundet med co-transfections og for å sikre homogen merking av BDNF. Den biologiske aktiviteten til mbtBDNF ble demonstrert av vestlige blot- og fluorescensmikroskopieksperimenter, inkludert aktivering av pCREB og levende celleavbildning for å studere retrograd aksonal transport av BDNF i mikrofluidiske kamre. Bruken av denne protokollen muliggjør optimalisert, høykapasitetsproduksjon av homogen mono-biotinylert og biologisk aktiv BDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med de godkjente retningslinjene til CONICYT (Chilean National Commission for Scientific and Technological Research). Protokollene som ble brukt i denne studien ble godkjent av Biosecurity og Bioethical and Animal Welfare Committees av Pontificia Universidad Católica de Chile. Eksperimenter med virveldyr ble godkjent av bioetisk og dyrevelferdskomiteen ved Pontificia Universidad Católica de Chile.
MERK: Følgende protokoll ble utformet for å rense BDNFAvi fra et totalt volum på 500 ml kondisjonert medium produsert i HEK293-celler. Mengden kondisjonert medium som produseres og behandles for å rense BDNFAvi, kan opp eller nedskaleres etter behov. Ytterligere optimalisering kan imidlertid være nødvendig under disse omstendighetene. Sammensetningen av kulturmedier og buffere som brukes gjennom hele protokollen finnes i supplerende materialer.
1. Produksjon og rensing av BDNFAvi fra HEK293-betingede medier
- Transfeksjon av HEK293-celler
- Vokse HEK293 celler til 70% samløpet i supplert DMEM medium (10% storfe fosteretret, 1x glutamat supplement, 1x antibiotika / antimykotisk) i 15 cm kulturretter ved 37 ºC.
- Endre medium til transfeksjonsbuffer.
- Forbered PEI-DNA-blandingen for transfeksjon. Bruk to forskjellige 15 ml koniske rør for å fortynne henholdsvis DNA og PEI 25 K. Fortynn 20 μg plasmid DNA i et endelig volum på 500 μL i ett rør. Fortynn 60 μg lineær PEI 25K i et endelig volum på 500 μL i det andre røret. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Forsiktig pipette DNA-løsningen inn i PEI-røret, bland en gang med opp-ned bevegelse. Inkuber ved romtemperatur i 25 min.
- Drypp 1 ml pei-DNA-blandingen gjennom hver 15 cm fat. Inkuber cellene med PEI-DNA-blandingen i 3 timer ved 37 ºC.
- Endre medium til fersk inkubasjonsbuffer.
- Medieinnsamling og lagring
- Samle mediet fra alle rettene 48 timer etter transfeksjon av HEK293 celler. Forbered konsentrerte bestander av løsningene som er beskrevet i delen "supernatant modifikasjonsbuffer" i tilleggsfil 1, og legg dem til HEK293 supernatant for å oppnå de oppførte endelige konsentrasjonene.
MERK: Celler kan kastes eller gjenopprettes for videre analyse. - Inkuber mediet i is i 15 min.
- Aliquot mediet i sentrifuge rør.
- Sentrifuger mediet ved 10.000 x g i 45 min i en 4 °C sentrifuge. Dette trinnet tillater eliminering av cellerester og døde celler suspendert i media.
- Samle supernatants, tilsett BSA ved en endelig konsentrasjon på 0,1%. og deretter oppbevare ved -20 °C. Mediene kan aliquoted før frysing for raskere tining under rensing trinn.
MERK: Lagringstidene for frosne betingede medier på opptil 2 måneder har gitt positive resultater, lengre lagringstider har ikke blitt evaluert.
- Samle mediet fra alle rettene 48 timer etter transfeksjon av HEK293 celler. Forbered konsentrerte bestander av løsningene som er beskrevet i delen "supernatant modifikasjonsbuffer" i tilleggsfil 1, og legg dem til HEK293 supernatant for å oppnå de oppførte endelige konsentrasjonene.
- Mediekonsentrasjon og rensing
- Tin media i en 37 °C thermoregulated bad.
- Aliquot media i sentrifuge rør.
- Sentrifuger mediet i 1 timer ved 3500 x g i en 4 °C avkjølt sentrifuge. Dette trinnet gjør det mulig å eliminere gjenværende celleavfall for å sikre tilstrekkelig strøm gjennom kromatografikolonnen.
- Bruk proteinkonsentratorene med en 10 kDa cutoff for å redusere mediet fra 500 ml til 100 ml. Følg produsentens anbefalte sentrifugeringsparametere for optimal konsentrasjon.
- Tilsett 500 μL Ni-NTA agarose perler til konsentrert media og inkuber over natten ved 4 °C i en rocker.
- Monter kromatografiapparatet og hell mediet inn i det. La den hvile i 5 min og åpne deretter den 2-veis stoppekranen for å la mediet strømme gjennom.
- Vask perlene med 5 ml vaskebuffer i 5 min. Pass på å resusped perlene i kolonnen. Tøm vaskebufferen ved å åpne den toveis stoppekranen. Gjenta 3 ganger.
- Legg til 1 ml elutionbuffer i kolonnen. Pass på å resusped perlene i kolonnen. Inkuber i 15 min, og samle deretter eluatten i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gjenta dette trinnet 3 ganger for fullstendig elution av BDNFAvi.
- Last 5 μL av hver eluat og forskjellige konsentrasjoner av kommersielt tilgjengeligE BDNF (40-160 ng) i en 15% polyakrylamidgel. Oppdag det rensede proteinet ved vestlig oppblåsthet ved hjelp av et anti-BDNF-antistoff.
- Bestem konsentrasjonen av renset BDNFAvi i hver elua ved hjelp av konsentrasjonskurven tilberedt med den kommersielt tilgjengelige BDNF.
- Aliquot og oppbevar den rensede BDNFAvi ved -80 °C.
2. In vitro monobiotylisering av BDNFAvi ved bruk av BirA-enzymet
-
In vitro mono-biotinylation reaksjon
- Forbered konsentrerte lagerløsninger av biotinylation buffer reagenser. Bruken av konsentrerte bestander vil minimere fortynning av rekombinant protein.
- Ta en aliquot på 800 ng av BDNFAvi og tilsett biotinylation buffer reagenser og enzymet BirA i en 1:1 molar forhold til BDNF. For eksempel, for en 200 μL endelig reaksjonsvolum legge til; 100 μL oppløsning som inneholder 800 ng BDNFAvi, 20 μL Bicine 0,5 M pH 8,3, 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotin 500 μM, 0,8-1 μg til 1 μL BirA-GST, og komplett til 200 μL med ultrapure vann.
MERK: Vellykkede biotinylation reaksjoner har blitt utført med aliquots på 400 μL som inneholder en konsentrasjon på ca 30 ng / μL BDNFAvi, noe som resulterer i en homogent biotinylert BDNFAvi til en endelig konsentrasjon på ~ 20 ng / μL i den endelige reaksjonen. - Inkuber blandingen ved 30 °C i en hybridiseringsovn i 1 h. Bland innholdet ved rørinversjon hvert 15.
- Legg til samme volum av ATP og BirA som i trinn 2.1.2 og gjenta trinn 2.1.3.
- Oppbevares ved -80 °C for fremtidige analyser eller oppbevares på is for umiddelbar bruk (f.eks. biotinylation kvalitetskontroll).
- Biotinyleringsanalyse
- Blokk 30 μL av streptavidin magnetiske perler per BDNF prøve i 1 ml blokkeringsbuffer. Inkuber ved romtemperatur i 1 timer i en mikrocentrifugerørritator.
- Utfell de magnetiske perlene ved hjelp av et magnetisk separasjonsstativ i 3 til 5 minutter eller til bufferen vises helt ryddet av perlene og kast blokkeringsbufferen.
- Tilsett 50 μL fersk blokkeringsbuffer og 80 ng av mono-biotinylated BDNFAvi (mbtBDNF) prøve til perlene, og sørg for å resuspend dem helt ved pippeting.
- Inkuber ved 4 °C i 1 time i en mikrocentrifugerørritator som spinner ved ca. 20 o/min.
- Samle perlene ved hjelp av det magnetiske separasjonsstativet i 3 til 5 minutter, og samle supernatanten, og hold en 30 μL aliquot for analyse.
- Vask perlene en gang med 500 μL PBS, og samle dem deretter ved hjelp av det magnetiske separasjonsstativet i 3 til 5 minutter. Gjenopprett supernatanten og hold en 30 μL aliquot for analyse.
- Tilsett 10 μL 4x lastebuffer til perlene.
- Varm prøvene til 97 °C i 7 min for å få mbtBDNF.
- Oppdag mbtBDNF ved hjelp av et anti-BDNF-spesifikt antistoff19.
3. Verifisering av mbtBDNF biologisk aktivitet
- Påvisning av pTrkB og pERK av vestlig blot.
- Frø 2 millioner rottekortikale nevroner i 60 mm kulturretter.
- Kultur nevronene i 7 dager (DIV7). Deretter endrer du mediet til ikke-supplert nevrobasal mediun når du starter eksperimentet.
- En time etter middels endring, legg mbtBDNF til en endelig konsentrasjon på 50 ng / ml. Inkuber i 30 min ved 37 ºC. Hold en negativ kontrollrett (ikke stimulert med BDNF) og en positiv kontrollrett (behandlet med 50 ng/ml kommersielt tilgjengelig BDNF).
- Samle mediet og vask forsiktig hver tallerken med 1x PBS. Samle og kast 1x PBS.
- Legg rettene på is og tilsett 50-80 μL lysisbuffer til hver tallerken. Bruk en celleskraper til å lyse cellene.
MERK: Lysis-trinnet bør utføres så raskt som mulig for å unngå proteindefosforylering og nedbrytning. 1-2 minutter med kraftig skraping er nok til å visualisere proteiner av interesse ved vestlig blotting. - Samle lysis buffer og rør i en vortex mikser ved høyeste hastighet for 5 s.
- Sentrifuger lysisbufferen ved 14 000 x g (4 °C) i 10 min. Samle supernatanten.
- Kvantifiser proteininnholdet i supernatanten ved BCA protein kvantifiseringsprotokoll20.
- Legg lasting buffer til en aliquot som inneholder 30-50 μg protein per tilstand og laste den i en 12% polyakrylamid gel for vestlig blotting. Oppdag pTrkB og pERK ved hjelp av spesifikke fosforantistoffer for å verifisere BDNFAvi biologisk aktivitet.
- Verifisering av BDNF-QD biologisk aktivitet ved pCREB immunofluorescens.
- Frø 40.000 rottekortikale nevroner i 10 mm dekkslips, tidligere autoklavert og behandlet med poly-L-lysin som beskrevet tidligere21.
- Kultur nevronene i 7-8 dager i nevronal vedlikeholdsbuffer (se tilleggsmaterialer) ved 37 ºC.
- For å starte eksperimentet, endre mediet til unsupplemented neurobasal medium og inkubere ved 37 ºC for 1 t.
- Forbered mbtBDNF konjugert til kvanteprikker (BDNF-QD) ved å legge til en mbtBDNF aliquot, det nødvendige volumet av quantum dot streptavidin conjugate (streptavidin-QD) for å oppnå en 1:1 BDNF-QD molar ratio. Deretter fortynnes til 20 μL med neurobasal medium. Pakk røret i aluminiumsfolie for å beskytte det mot lyset.
MERK: Forbered et annet rør med samme volum kvanteprikk streptavidin konjugat og fortynn det til 20 μL med neurobasal medium som en negativ kontroll. - Inkuber mbtBDNF/streptavidin-QD-blandingen i 30 min ved romtemperatur i en rocker.
- Fortynn BDNF-QD til ønsket endelig konsentrasjon (200 pM og 2 nM) i nevrobasalmedium.
- Etter 1 t inkubasjon med ikke-supplert nevrobasalmedium, stimulere nevronene med BDNF-QD eller streptavidin-QD (kontroll) til en endelig konsentrasjon på 200 pM og 2 nM BDNF i 30 min ved 37 °C.
- Vask dekklipsene 3 ganger med 1x PBS (37 °C) og fest cellene i 15 min ved å behandle dekkslippen med 4 % paraformaldehydoppløsning som inneholder fosfatasehemmere.
- Vask cellene 3 ganger med PBS, og inkvemt deretter med blokkering/permeabiliseringsbuffer (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, 1x fosfatasehemmer) i 1 time.
- Inkuber med anti-pCREB antistoff 1:500 (i 3% BSA, 0,1% Triton X-100) over natten ved 4 °C.
- Neste dag, vask 3 ganger med 1x PBS, og inkuber i 1 timer med det sekundære antistoffet 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100).
- Vask 3 ganger med 1x PBS. Tilsett Hoechst kjernefysisk flekkløsning (5 μg/ml) i 7 min.
- Vask 3 ganger med 1x PBS og monter.
- Visualisering av retrograd axonal transport av BDNF-QD i levende nevroner
- Forbered mikrofluidiske kamre og frønevroner som beskrevet tidligere16.
- Etter 7-8 dager i kultur, endre mediet til ikke-supplert neurobasal medium.
- Forbered mbtBDNF konjugert til kvanteprikker (BDNF-QD) ved å legge til en mbtBDNF aliquot, det nødvendige volumet av quantum dot streptavidin conjugate (streptavidin-QD) for å oppnå en 1:1 BDNF-QD molar ratio. Deretter fortynnes til 20 μL med neurobasal medium. Pakk røret i aluminiumsfolie for å beskytte det mot lyset.
MERK: Forbered et annet rør med samme volum kvanteprikk streptavidin konjugat og fortynn det til 20 μL med neurobasal medium som en kontroll. - Inkuber mbtBDNF/streptavidin-QD-blandingen i 30 min ved romtemperatur i en rocker.
- Fortynn BDNF-QD til ønsket endelig konsentrasjon (2 nM).
- Etter 1 t inkubasjon med ikke-supplert nevrobasal medium tilsett BDNF-QD eller kontrollblandingen til de feksale rommene i det mikrofluidiske kammeret. Inkuber i 210 min ved 37 °C for å sikre en netto retrograd transport av BDNF-QD.
- For levende celleavbildning visualiserer du aksonal retrogradtransport i segmentet av mikrogrokovene som er proksimale for cellekroppsrommet ved hjelp av et 100x-mål ved hjelp av et mikroskop som passer for disse formålene (37 °C og 5 % CO2). Skaff deg bilder på 1 bilde/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruken av en kromatografisk kolonnebasert protokoll gjør det mulig å behandle betydelige volumer av HEK293-kondisjonerte medier. I figur 1vises resultatene av rensingen av BDNFAvi fra 500 ml kondisjonert medier. Påfølgende elutasjoner av BDNFAvi fra Ni-NTA agarose perler gir avtagende konsentrasjoner av BDNFAvi (Figur 1A). Etter fire påfølgende elutions (hver varer 15 min), er flertallet av BDNF fanget av perlene gjenopprettet. Konsentrasjonene av eluatene varierer fra 6 til 28 ng/μL, og den totale avkastningen utgjorde ca. 60 μg BDNFAvi (tabell 1). Den produserte BDNFAvi ble deretter effektivt biotinylated av en in vitro reaksjon mediert av BirA-GST, som demonstrert av mangel på ikke-biotinylated BDNFAvi i supernatant (Figur 1B). Vær oppmerksom på at biotinyleringen som presenteres i figur 1B tilsvarer et aliquot av den totale BDNF produsert, men reaksjonen kan skaleres opp for større volumer.
Deretter ble den biologiske aktiviteten til mbtBDNF evaluert ved hjelp av 2 forskjellige eksperimentelle tilnærminger. Først ble kortikale nevroner seeded i 60 mm plater (2 millioner nevroner, DIV7) stimulert med 50 ng / ml mbtBDNF i 30 min, og deretter proteiner ble forberedt for vestlig blot analyse. Den biologiske aktiviteten til mbtBDNF ble kvantifisert ved å oppdage pTrkB (Y515) og pERK (T202/Y204). Binding av BDNF til TrkB utløser aktivering av reseptoren gjennom en autofosforyleringsreaksjon i sitt intracellulære domene, og ERK er et kjent mål for BDNF-signalveien22. Båndene for begge fosforerte proteiner hadde en lignende intensitet i nevroner behandlet med kommersiellE BDNF og mbtBDNF, og begge viste et sterkere signal enn kontrolltilstand (Figur 2A). Deretter ble den biologiske aktiviteten til mbtBDNF kombinert til streptavidin-QD evaluert for å vise at de kan brukes i live bildebehandlingseksperimenter. Kortikale nevroner ble seeded i 10 mm deksler (40.000 celler per deksel, DIV7) og behandlet med en endelig konsentrasjon på 200 pM eller 2 nM BDNF-QD i 30 min før feste og farging for pCREB. CREB er en transkripsjonsfaktor som er målrettet av aktivert ERK1/2 i kortikale nevroner22,,23. Stimulerende nevroner med økende konsentrasjoner av BDNF-QD resulterte i en doseavhengig økning av fosforylering av CREB og tilstedeværelse av QD-partikler rundt kjernen (Figur 2B), noe som indikerer at BDNF-QD-partiklene var endokdotosert og utløste aktivering av signalveier forbundet med BDNF-mediert TrkB-aktivering. En dobbeltdobling i pCREB-signalet ble påvist ved stimulerende nevroner med lav konsentrasjon av BDNF-QD (200 pM), mens stimulerende med 2 nM resulterte i en 3,5 ganger økning i pCREB-signalet (figur 2C). Disse resultatene viser at den biotinylated BDNFAvi er biologisk aktiv, og at den ikke mister sin aktivitet når den kobles til streptavidin-QD, noe som gjør den egnet for immunofluorescens og levende celleavbildning.
Til slutt ble bildepotensialet til BDNF-QD evaluert i kompartiserte kulturer ved hjelp av mikrofluidiske kamre. Kortikale nevroner ble seeded i mikrofluidiske kamre (15 mm deksler, 50.000 nevroner per mikrofluidisk kammer, DIV7) for å skille de akanale og somatodendritiske rommene og ble stimulert med 2 nM BDNF-QD for 3,5 h. Mikroskopi i live celle ble utført, og de resulterende kymografene ble brukt til å kvantifisere hastigheten til BDNF-QD som inneholder organeller (figur 3A). En gjennomsnittlig glidehastighet på 0,91 μm/s ble påvist (Figur 3B), som er i tråd med tidligere analyser av cytoplasmatisk dyneinmedi-mediert transport7,16. Mikrofluidiske kamre behandlet med 2 nM streptavidin-QD viste ikke bevegelige QDer i mikrogrokovene, som vist av kymografen (Figur 3A). Celler dyrket under de samme forholdene ble stimulert med 500 pM eller 2 nM BDNF-QD i 210 min, og deretter fast og merket med en kjernefysisk farging. Som vist i figur 3Cviser nevroner en doseavhengig akkumulering av BDNF-QD i alle de analyserte sub-rommene, inkludert de proksimale og distale delene av mikrogroove og somatodendritisk rom. I motsetning viste kontrollnevroner nesten ingen QD-signal i hele kammeret. Derfor kan BDNF-QD oppdages i levende og faste celler i mikrofluidiske kamre.
Figur 1: Produksjon og monobiotinlering av BDNFAvi i HEK293-celler. HEK293 celler ble transfected ved hjelp av PEI reagens og en BDNFAvi koding plasmid og betingede medier ble samlet inn etter 48 h. BDNFAvi inneholder en 6x Histidine tag slik at rensing ved hjelp av nikkel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) kromatografi. Kommersielt tilgjengelig rekombinant humant BDNF har en forventet molekylvekt på ~ 13 kDa, mens BDNFAvi viser en molekylvekt på ~ 18 kDa. BDNFAvi bundet til harpiksen ble fullt utgravd med fire påfølgende elution trinn. (A)Vestlig blot ved hjelp av anti-BDNF antistoffer for å oppdage i huset forberedt rekombinant BDNF og kommersielle BDNF. Aliquots som inneholder kjente mengder kommersielt tilgjengelige humane BDNF og 5 μL av hver eluat ble lastet inn i en SDS-PAGE gel for påvisning av BDNFAvi ved hjelp av et antistoff mot BDNF. Tabell 1 indikerer konsentrasjonene av BDNFAvi som finnes i hver eluat. Mengden og konsentrasjonen av BDNF i hver eluate ble oppnådd ved densitometrisk analyse og interpolering fra konsentrasjonskurven til kommersielt tilgjengelig BDNF. (B) Verifisering av BDNFAvi biotinylation. Åtti nanogram biotinylert BDNFAvi (mbtBDNF) ble inkubert med 30 μL streptavidin koblet til magnetiske perler (20% slurry) i 1 time ved 4 °C. Deretter ble magnetiske perler isolert ved hjelp av en magnetisk separator. De streptavidin perler ble oppvarmet med lasting buffer for å elute biotinylated BDNFAvi (perler kjørefelt). Supernatanten (SN lane) ble også behandlet med lasting buffer, oppvarmet og lastet i gel (SN lane). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Verifisering av mbtBDNF biologisk aktivitet. (A)DIV7 kortikale nevroner ble sultet i 1 timer, og deretter stimulert med 50 ng/ml kommersielt tilgjengeligE BDNF eller mbtBDNF i 30 min. Proteiner ble ekstrahert og lastet i en SDS-PAGE gel for analyse av TrkB og ERK1/2 fosforylering ved hjelp av fosfospesifikke antistoffer og sammenlignet med de totale nivåene av proteinet ved hjelp av antistoffer mot total TrkB og ERK1/2. (B)DIV7 kortikale nevroner ble sultet i 1 timer, og deretter stimulert med en endelig konsentrasjon på 200 pM eller 2 nM mbtBDNF koblet til streptavidin-QD (BDNF-QD) i 30 min. Deretter ble cellene fikset og pCREB ble merket for fluorescensmikroskopianalyse. (C) Kvantifisering av kjernefysisk pCREB fluorescens intensitet. Resultatene tilsvarer 90 nevroner samlet sammen fra 3 uavhengige eksperimenter, vist som gjennomsnitt ± SEM. Den statistiske analysen tilsvarer en enveis ANOVA med Tukeys flersammenligningstest (****p < 0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Visualisering av BDNF-QD i aktive og faste celler. (A)DIV7 kortikale nevroner dyrket i mikrofluidiske kamre ble stimulert i aksonal rommet med en endelig konsentrasjon på 2 nM BDNF-QD i 3,5 timer, og deretter ble den proksimale delen av mikrogrokovene avbildet ved hjelp av en levende cellemikroskopiinnstilling. Representative kymografer for kontrolltilstand (behandlet med streptavidin-QD) og ved behandling med BDNF-QD er vist. (B) Kvantifisering av hastigheten på å flytte BDNF-QD. Mobil puncta ble definert som de som flyttet mer enn 10 μm i 120-s av opptak. (C) DIV7 kortikale nevroner dyrket i mikrofluidiske kamre ble stimulert i akaksialrommet med en endelig konsentrasjon av BDNF-QD på 500 pM eller 2 nM i 3,5 timer, og deretter fast og merket med Hoechst for å visualisere kjernene. Representative bilder av det somatodendritiske rommet og de distale og proksimale delene av mikrogrokovene vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eluate (andre) | BDNF (ng) i 5μl | -Jeg har ikke noe å si. | Totalt BDNF [μg] |
| E1 (andre) | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| E2 (andre) | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| E3 (andre) | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| E4 (andre) | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
Tabell 1: Kvantifisering av BDNFAvi renseutbytte (relatert til fig. 1A). HEK293 celler ble transi infisert med en plasmid kjøring BDNFAvi uttrykk, og proteinet ble renset av Ni-NTA affinitet kromatografi. Proteinkonsentrasjon og endelig utbytte ble beregnet ved densitometrisk analyse og interpolering i den kjente konsentrasjonskurven til kommersielt tilgjengelig rekombinant humant BDNF.
Tilleggsfil 1: Kulturmedier og bufferkomponenter Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen er en optimalisert metodikk for produksjon og rensing av mbtBDNF i en affinitet kromatografi-basert prosedyre beskrevet, basert på arbeidet til Sung og samarbeidspartnere17. Optimaliseringene inkluderer bruk av en kostnadseffektiv transfeksjonsreagens (PEI) samtidig som effektiviteten av dyrere transfeksjonsmetoder som lipofectamin opprettholdes. Denne optimaliseringen oversettes til en betydelig kostnadsreduksjon i protokollen, noe som muliggjør skalerbarhet samtidig som den opprettholder høy kostnadseffektivitet. Protokollen inkluderer også brukervennlighetshensyn, inkludert frysing av betingede medier i opptil 2 måneder. Disse optimaliseringene gjør prosedyren tilpasningsdyktig til hvert laboratoriums behov, forbedrer kostnadseffektiviteten og gir homogen og biologisk aktiv rekombinant BDNF. Protokollen kan også tilpasses mindre skala produksjoner ved å erstatte bruken av kromatografi apparatet med gravitasjonsnedbør av perlene i koniske rør. Dette utgjør en levedyktig metodikk, men den mindre tidseffektive og har resultert i lavere utbytter i vår erfaring. Den biotin-merkede BDNF kan deretter kobles til forskjellige streptavidin-bundet sonder, inkludert fluorofos og paramagnetiske nanopartikler, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for å utføre ulike typer eksperimenter for analyse av BDNF post-endoktorisk menneskehandel. Derfor er en optimalisert og enkel produksjonsprotokoll for dette proteinet svært nyttig for laboratorier som arbeider på dette feltet.
Produksjon av rekombinante proteiner med komplekse post-translasjonelle modifikasjoner, for eksempel BDNF24,i prokaryotiske systemer resulterer ofte i proteiner som ikke er riktig foldet og dermed har dårlig biologisk aktivitet25. Derfor er uttrykk i pattedyrceller nødvendig for å oppnå et bioaktivt protein. Bruken av PEI har tidligere blitt beskrevet som et levedyktig alternativ for storskala produksjon av rekombinante proteiner i transfiserte pattedyrceller25,,26, og effektiviteten i transfeksjon av HEK293-cellene i sammenheng med akademiske laboratorier har blitt fremhevet27. Bruk av denne cellelinjen representerer derfor et gyldig alternativ for å produsere BDNFAvi på en skala som kan administreres av et akademisk laboratorium. Den foreslåtte protokollen kan optimaliseres ytterligere av genereringen av en HEK293 cellelinje stabilt transfisert med BDNFAvi, som ville eliminere det forbigående transfeksjonstrinnet, og dermed spare tid og ressurser. En annen potensiell kilde til optimalisering er bruk av celler i suspensjon i stedet for tilhengerceller. HEK293 celler kan opprettholdes i suspensjon, genererer betydelige mengder rekombinant protein i størrelsesorden gram per liter28.
En annen forbedring i protokollen er biotinylation av BDNFAvi protein ved hjelp av en in vitro strategi, erstatte den forrige in vivo co-transfection protokollen. Forbigående co-transfection kan ha uventede resultater i form av uttrykk for konstruksjonene, som har blitt demonstrert i flere cellelinjer og med flere transfeksjon reagenser29. Ulike faktorer kan påvirke uttrykket av transfiserte proteiner i en co-transfection kontekst, inkludert vektorer, celletyper og plasmidkonsentrasjon. Dette mangfoldet av faktorer gjør optimalisering og reproduserbarhet til en kompleks oppgave. På den annen side gir en in vitro-metodikk bedre kontroll over forholdene der biotinylationreaksjonen finner sted. Denne metodikken resulterer i reproduserbar og homogen merking av rekombinant BDNF.
Som demonstrert av de biologiske aktivitetsverifiseringseksperimentene, er mbtBDNF produsert ved hjelp av denne protokollen sammenlignbar med kommersielt tilgjengelig rekombinant humanTBDNF når det gjelder BDNF-TrkB signalisering. Dataene viser også at kobling BDNF til streptavidin-QD ikke forstyrrer BDNF-TrkB-signalering. I tillegg viste vi at BDNF-QD kan oppdages ved epifluorescensmikroskopi i levende og faste celler. Derfor representerer mbtBDNF et verdifullt verktøy for å studere retrograd axonal trafficking og det presenterer betydelige fordeler over alternative sonder, for eksempel BDNF-GFP16. Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen gir en pålitelig og konsekvent metodikk for produksjon av mbtBDNF, som deretter kan brukes i post-endocytic dynamikk studier i ulike nevronale modeller som uttrykker TrkB eller p75. BDNF signalering har potente effekter på nevronal morfologi og funksjon3,,4,21, og har nylig blitt foreslått som et potensielt terapeutisk verktøy for å forbedre nevronal regenerering30,31, noe som gjør studien relevant innen cellulær biologi og biomedisin. Studien av effekten av BDNF-signalering og menneskehandel vil ytterligere fremme vår forståelse av nevronal cellebiologi og kan tillate sele av sitt regenerative potensial i kliniske omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra Fondecyt (1171137) (FCB), Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) og en UK Dementia Research Institute Foundation award (GS). Dette arbeidet ble støttet av Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
- Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
