Summary
含有 Avi 序列 （BDNFAvi） 的重组 BDNF 以经济高效的方式在 HEK293 细胞中生产，并通过亲和色谱进行纯化。然后，BDNFavi 与管中的酶 BirA 直接单生物素化。与市售的BDNF相比，BDNFavi和单生物素化BDNFavi保留了其生物活性。
Abstract
含有 Avi 序列 （BDNFAvi） 的重组 BDNF 在 HEK293 细胞中生产，然后通过亲和力色谱进行经济高效地纯化。一种可重复的协议被开发成直接单生物素BDNFAvi与酶BirA在管中。在这个反应中，单生物素化BDNFAvi保持其生物活性。
神经营养素是靶源生长因子，在神经元发育和维持中起着一定的作用。它们需要沿着内分泌通路的快速传输机制，以便在不同的神经元隔间之间进行远距离信号。开发分子工具，研究神经营养素的贩运，使这些蛋白质在细胞使用体内记录精确跟踪。在该协议中，我们为单生物基化BDNF的生产开发了一个优化且经济高效的程序。含有生物素可 avi 序列 （BDNFAvi） 的重组 BDNF 变种在微克范围内的 HEK293 细胞中产生，然后使用亲和力色谱在易于分量的程序中纯化。然后，纯化的BDNF可以通过与管中的BirA酶直接体外反应来均匀地进行单生物素化。单生物基化BDNF（mbtBDNF）的生物活性可以与与不同荧光团结合的链球菌结合。BDNFAvi和mbtBDNF分别通过利用西方印迹检测下游磷酸化靶点和活化转录因子CREB来保持其生物活性。使用链球菌素量子点，我们能够可视化 mbtBDNF 内化伴随激活 CREB，该激活与磷-CREB特异性抗体一起检测。此外，与链球菌素量子点结合的mbtBDNF适用于微流体室中生长的皮质神经元的逆行性传输分析。因此，在管生产mbtBDNF是一个可靠的工具，研究生理信号内位动力学和神经元的贩运。
Introduction
神经元是神经系统的功能单位，具有复杂和专门的形态，允许突触通信，因此，产生协调和复杂的行为，以回应不同的刺激。神经元投影，如树突和轴突是参与神经元交流的关键结构特征，神经营养素是决定其形态和功能1的关键参与者。神经营养素是一个分泌生长因子的家族，包括NGF、NT-3、NT-4和脑源神经营养因子（BDNF）2。在中枢神经系统（CNS），BDNF参与不同的生物过程，包括神经传学，树突状，树突脊柱的成熟，长期强权，等等3，4。3,因此，BDNF在调节神经元功能方面起着至关重要的作用。
不同的细胞过程调节BDNF动力学和功能。在神经元表面，BDNF结合肌蛋白酶受体激酶B（TrkB）和/或p75神经营养素受体（p75）。BDNF-TrkB和BDNF-p75复合物被内分泌和排序在不同的内分泌细胞器5，6，7，8。,6,7,8BDNF/TrkB复合物的细胞内贩运需要在不同的神经元,电路9、10、11,中发出正确的BDNF信号。10因此，深入了解BDNF贩运动态及其在病理生理过程中的变化对于了解BDNF在健康和疾病中的信号至关重要。开发新的和特定的分子工具来监测这一过程将有助于推动这一领域向前发展，并更好地掌握所涉及的监管机制。
有几个工具可用于研究BDNF贩运神经元。常用的方法涉及转染重组BDNF与荧光分子标记，如绿色荧光蛋白（GFP）或单体荧光红移变种的GFP mCherry12，13。,13然而，BDNF过度表达的一个主要缺点是，它消除了提供这种神经营养素的已知浓度的可能性。此外，它可能会导致细胞毒性，掩盖了结果14的解释。另一种策略是表位标记的TrkB的转染，如旗-TrkB。这种方法允许研究TrkB内化动力学15，但它也涉及转染，这可能会导致TrkB功能和细胞毒性的改变。为了克服这些方法障碍，16，17，开发了含有Avi序列（BDNFAvi）的NGF和BDNF的重组变种，这种变异可以由生物素-利加酶BirA单生物素化。生物基化重组BDNF可与不同的链球菌结合工具耦合，这些工具包括荧光团、珠子、顺磁纳米粒子等，用于检测。在活细胞成像方面，量子点（QD）已成为常用的荧光团，因为它们具有单粒子跟踪的可取特性，如与小分子荧光团18相比，亮度增加，光漂白的抵抗力增强。
使用BDNFAvi的单生物基化BDNF（mbtBDNF）的产生是通过对驱动BDNFAvi和BirA表达的质粒进行共生共进，然后通过亲和力色谱纯化重组蛋白，每20mL的 HEK293条件培养基17产生1-2μg的BDNF。在这里，我们建议修改该协议，允许BDNFAvi纯化从500 mL的 HEK293 条件介质，寻求最大限度地提高蛋白质回收在色谱柱为基础的协议，以方便操作。用过的转染剂聚乙烯胺 （PEI） 可确保在不牺牲转染产量的情况下采用经济高效的方法。单生物素化步骤已适应体外反应，以避免与共创相关的并发症，并确保BDNF的均匀标记。mbtBDNF的生物活性通过西方的印迹和荧光显微镜实验得到证明，包括pCREB的活化和活细胞成像，以研究BDNF在微流体室中的逆行性。使用该协议允许优化，高产生产同质单生物基化和生物活性BDNF。
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Protocol
所有实验都是按照智利国家科学和技术研究委员会（智利国家科学技术研究委员会）核准的准则进行的。本研究中使用的议定书得到智利大学生物安全和生物伦理及动物福利委员会的批准。涉及脊椎动物的实验得到智利大学生物伦理和动物福利委员会的批准。
注：以下协议旨在从 HEK293 细胞中产生的 500 mL 条件介质的总体积中纯化 BDNFAvi。为净化BDNFAvi而生产并加工的有条件介质量可以根据需要向上或缩小。但是，在这种情况下可能需要进一步优化。在整个协议中使用的培养媒体和缓冲区的组成可以在补充材料中找到。
1. 从 HEK293 空调介质生产和纯化 BDNFAvi
- HEK293细胞的转染
- 在37 oC的15厘米培养皿中，在15厘米培养皿中生长 HEK293 细胞至 70% 汇合（10% 牛胎儿血清、1x 谷氨酸补充剂、1x 抗生素/抗肌理）。
- 将介质更改为转染缓冲液。
- 准备PEI-DNA混合物进行转染。分别使用两种不同的 15 mL 锥形管稀释 DNA 和 PEI 25 K。在一个管中稀释20μg质粒DNA，最终体积为500μL。在其它管中，以500μL的最终体积稀释60μg的线性PEI 25K。在室温下孵育5分钟。
- 小心地将脱氧核糖核酸溶液移液到PEI管中，通过上下运动混合一次。在室温下孵育25分钟。
- 在每个 15 厘米的培养皿中滴落 1 mL 的 PEI-DNA 混合物。在37oC下用PEI-DNA混合物孵育细胞3小时。
- 将介质更改为新的孵育缓冲液。
- 媒体收集和存储
- HEK293细胞转染后48小时从所有菜肴中收集介质。准备补充文件1"超常修改缓冲区"部分中描述的溶液的集中库存，并将其添加到 HEK293 上流液中，以实现列出的最终浓度。
注：可以丢弃或恢复细胞以作进一步分析。 - 在冰中孵育介质15分钟。
- 将介质等到离心管中。
- 在 4 °C 离心机中以 10，000 x g离心介质 45 分钟。此步骤允许消除悬浮在介质中的细胞碎片和死细胞。
- 收集超自然，加入BSA的最终浓度为0.1%。然后在-20°C储存。介质可以在冻结前等分，以便于纯化步骤中更快地解冻。
注：冷冻条件介质的存储时间长达2个月，取得了积极效果，较长的存储时间尚未评估。
- HEK293细胞转染后48小时从所有菜肴中收集介质。准备补充文件1"超常修改缓冲区"部分中描述的溶液的集中库存，并将其添加到 HEK293 上流液中，以实现列出的最终浓度。
- 介质浓度和纯化
- 在 37 °C 热调节浴中解冻介质。
- 将介质分成离心管。
- 在 4°C 冷却离心机中，以 3，500 x g将介质离心 1 小时。此步骤允许消除剩余的细胞碎片，以确保通过色谱柱的足够流量。
- 使用具有 10 kDa 截止的蛋白质浓缩器将介质从 500 mL 降低至 100 mL。按照制造商推荐的离心参数进行最佳浓度。
- 将500μL的Ni-NTA红糖珠加入浓缩介质，在4°C的摇杆中孵育过夜。
- 组装色谱仪并倒入介质中。让它休息 5 分钟，然后打开双向停止，让介质流过。
- 用 5 mL 的洗涤缓冲液清洗珠子 5 分钟。确保重新在柱中重新填充珠子。通过打开双向止损口排空洗涤缓冲液。重复3次。
- 向列添加 1 mL 的洗脱缓冲区。确保重新暂停列中的珠子。孵育15分钟，然后在1.5 mL微离心管中收集水卢酸盐。重复此步骤 3 次，以完成 BDNFAvi 的洗脱。
- 在 15% 聚丙烯酰胺凝胶中，每种 Eluate 和不同浓度的商用 BDNF （40-160 ng） 中加载 5 μL。使用抗BDNF抗体检测西方印迹的纯化蛋白质。
- 使用市售BDNF准备的浓度曲线，确定纯化BDNFAvi在每个紫菜中的浓度。
- 在-80°C下将纯化的BDNFAvi储存。
2. 使用BirA酶对BDNFAvi进行体外单生物基化
-
体外单生物素化反应
- 准备生物素化缓冲剂试剂的浓缩库存溶液。使用浓缩库存将最大限度地减少重组蛋白的稀释。
- 以800ng的BDNFAvi等分，加入生物素化缓冲试剂和酶BirA，与BDNF的1：1摩尔关系。例如，对于 200 μL 的最终反应量添加;100 μL 溶液含有 800 ng 的 BDNFAvi，20 μL Bicine 0.5 M pH 8.3， 20 μL ATP 100 mM，20 μL MgOAc 100 mM，20 μL d-生物素500μM，0.8-1μg至1 μL的BirA-GST，并完成至200μL的超纯水。
注：成功进行生物素化反应，在400μL的等分中，其浓度约为30纳克/μL BDNFAvi，最终反应中，生物素化BDNFAvi最终浓度为±20纳克/μL。 - 在杂交烤箱中，在30°C下孵育混合物1小时，每15分钟通过管反转混合一次。
- 添加与步骤 2.1.2 相同的 ATP 和 BirA 卷，并重复步骤 2.1.3。
- 储存在-80°C，用于未来分析或立即放在冰上使用（例如，生物仿生质量控制）。
- 生物基化分析
- 每个BDNF样品在1 mL的阻滞缓冲液中阻断30μL的链球菌磁性珠。在室温下在微离心管旋转器中孵育1小时。
- 使用磁分离机架沉淀磁珠 3 至 5 分钟，或直到缓冲器完全清除磁珠并丢弃阻塞缓冲器。
- 向珠子中加入 50 μL 的新鲜阻尼缓冲液和 80 ng 的单生物基化 BDNFAvi （mbtBDNF） 样品，确保通过管道完全重新暂停。
- 在4°C下孵育1小时，在约20 RPM的微离心管旋转器中孵育。
- 使用磁性分离架收集磁珠 3 至 5 分钟，并收集上光，保持 30 μL 等分进行分析。
- 用 500 μL PBS 清洗珠子一次，然后使用磁性分离架收集珠子 3 到 5 分钟。恢复上一液，并保留 30 μL 等分进行分析。
- 向珠子添加 10 μL 的 4 倍加载缓冲液。
- 将样品加热至97°C7分钟，以加热mbtBDNF。
- 使用抗BDNF特异性抗体19检测mbtBDNF。
3. 核查 mbtBDNF 生物活性
- 通过西部印迹检测 pTrkB 和 pERK。
- 种子200万大鼠皮质神经元在60毫米培养皿。
- 培养神经元7天（DIV7）。然后，在开始实验时将介质更改为非补充神经基础。
- 介质变化一小时后，将 mbtBDNF 添加到 50 ng/mL 的最终浓度中。在37°C下孵育30分钟。保持负对盘（非刺激与BDNF）和正对盘（处理与50纳克/mL的商用BDNF）。
- 收集介质，用 1x PBS 轻轻清洗每道菜。收集并丢弃 1x PBS。
- 将盘子放在冰上，并在每道菜中加入50-80μL的解液缓冲液。使用细胞刮刀对细胞进行回线。
注：应尽快执行解解步骤，以避免蛋白质脱磷和降解。1-2分钟的剧烈刮擦足以想象西方印迹所感兴趣的蛋白质。 - 收集解液缓冲液，以最高速度在涡流混合器中搅拌5 s。
- 将解液缓冲液在 14，000 x g （4 °C） 下离心 10 分钟，收集上流液。
- 通过BCA蛋白质定量协议20量化上清液的蛋白质含量。
- 将加载缓冲液添加到每个条件含有 30-50 μg 蛋白质的等分物中，并将其加载到 12% 聚丙烯酰胺凝胶中，用于西印。使用特定的磷抗体检测 pTrkB 和 pERK 以验证 BDNFAvi 生物活性。
- 通过pCREB免疫荧光验证BDNF-QD生物活性。
- 种子40，000大鼠皮质神经元在10毫米盖玻片，以前自 <3>克拉，并处理与聚L-莱辛，如前面所述21。
- 培养神经元7-8天在神经元维持缓冲液（见补充材料）在37oC。
- 要开始实验，将介质更改为未松松的神经基础介质，并在 37 oC 下孵育 1 小时。
- 通过添加 mbtBDNF 等等项（量子点链素结合量（链球菌素-QD）来准备与量子点 （BDNF-QD） 结合的 mbtBDNF，以实现 1：1BDNF-QD 摩尔比。然后，用神经基础介质稀释至20μL。用铝箔包裹管子，保护管子免受光线的腐蚀。
注：准备另一个管与相同体积的量子点链球菌素结合，并稀释到20μL与神经基础介质作为负对。 - 在摇杆的室温下，孵育 mbtBDNF/ 链球菌素-QD混合物 30 分钟。
- 在神经基础介质中将BDNF-QD稀释至所需的最终浓度（200 pM和2nM）。
- 使用非补充神经基础介质孵育1小时后，用BDNF-QD或链球菌素-QD（控制）刺激神经元最终浓度为200 pM，BDNF为2nM，在37°C下为30分钟。
- 用 1x PBS （37 °C） 清洗盖玻片 3 次，用含有磷酸酶抑制剂的 4% 甲醛溶液处理盖玻片，将细胞固定 15 分钟。
- 用PBS清洗细胞3次，然后用阻尼/渗透缓冲液（BSA 5%，Triton X-100 0.5%，1x磷酸酶抑制剂）孵育1小时。
- 在4°C下用抗pCREB抗体1：500（3%BSA，0.1%Triton X-100）过夜孵育。
- 第二天，用1x PBS洗涤3次，用二次抗体1：500孵育1小时（3%BSA，0.1%Triton X-100）。
- 用 1 倍 PBS 洗涤 3 次。加入 Hoechst 核染色溶液 （5 μg/mL） 7 分钟。
- 用 1x PBS 清洗 3 次并安装。
- 活神经元中BDNF-QD逆行的斧弓传输的可视化
- 准备微流体室和种子神经元，如前面描述的16。
- 在培养7-8天后，将培养基更改为非补充神经基础介质。
- 通过添加 mbtBDNF 等等项（量子点链素结合量（链球菌素-QD）来准备与量子点 （BDNF-QD） 结合的 mbtBDNF，以实现 1：1BDNF-QD 摩尔比。然后，用神经基础介质稀释至20μL。用铝箔包裹管子，保护管子免受光线的腐蚀。
注：准备另一个管与相同体积的量子点链球菌素结合，并稀释到20μL与神经基础介质作为控制。 - 在摇杆的室温下，孵育 mbtBDNF/ 链球菌素-QD混合物 30 分钟。
- 将 BDNF-QD 稀释到所需的最终浓度 （2 nM）。
- 使用非补充神经基基孵育1小时后，将BDNF-QD或控制混合物加入微流体室的气动室。在37°C下孵育210分钟，以确保BDNF-QD的净逆行运输。
- 对于活细胞成像，使用适合这些目的的显微镜（37°C 和 5% CO2），使用 100 倍目标的微毛体片段中可视化轴向逆行传输。以 1 帧/s 速率获取图像。
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Representative Results
使用基于色谱柱的协议可以处理大量 HEK293 条件介质。在图1中，显示了从500mL的调节介质中纯化BDNFAvi的结果。从Ni-NTA agarose珠连续洗脱BDNFAvi产生BDNFAvi浓度下降（图1A）。经过四次连续洗脱（每次持续15分钟），珠子捕获的大多数BDNF被恢复。Eluates 的浓度范围为 6 至 28 ng/μL，总产量约为 BDNFAvi 的 60 μg（表 1）。然后，由BirA-GST调解的体外反应有效地对in vitroBDNFAvi进行生物素化，上因剂中缺乏非生物素化BDNFAvi（图1B）就证明了这一点。请注意，图1B中显示的生物素化对应于所生产的总 BDNF 的等分，但反应可以放大以扩大体积。
然后，利用两种不同的实验方法对mbtBDNF的生物活性进行了评价。首先，在60毫米板（200万个神经元，DIV7）中播种的皮质神经元用50纳克/mL的mbtBDNF刺激30分钟，然后蛋白质被准备用于西部印迹分析。通过检测pTrkB（Y515）和pERK（T202/Y204），对mbtBDNF的生物活性进行量化。BDNF 与 TrkB 的结合通过细胞内域中的自动磷化反应触发受体的激活，而 ERK 是 BDNF 信号通路22的已知目标。两种磷酸化蛋白的带子在用商用BDNF和mbtBDNF治疗的神经元中具有类似的强度，并且都显示出比控制条件更强的信号（图2A）。然后，对mbtBDNF与链球菌素-QD耦合的生物活性进行了评价，以证明它们可用于实时成像实验。皮质神经元在10毫米盖中播种（每个盖40，000个细胞，DIV7），最后浓度为200 pM或2 nM BDNF-QD，在固定和染色pCREB之前30分钟。CREB是一个转录因子，由皮质神经元22，23,的激活ERK1/2瞄准。刺激浓度增加的BDNF-QD的神经元导致CREB的磷酸化剂量增加，QD粒子在核周围存在（图2B），表明BDNF-QD粒子被内分泌，并触发与BDNF中导TrkB激活相关的信号通路的激活。当刺激浓度低的BDNF-QM（200 pM）的神经元时，检测到pCREB信号增加两倍，而用2 nM刺激时，pCREB信号增加3.5倍（图2C）。这些结果表明，生物素化BDNFAvi具有生物活性，与链球菌素-QD耦合时不会失去活性，因此适合免疫荧光和活细胞成像。
最后，利用微流体室对BDNF-QD的成像潜力进行了分体培养评估。皮质神经元在微流体室（15毫米盖， 每个微流体室50，000个神经元，DIV7，分离突触和体细胞的隔间，并刺激2nM BDNF-QD3.5小时。进行活细胞显微镜，结果的kymograph用于量化BDNF-QD含有器官的速度（图3A）。检测到平均移动速度为0.91 μm/s（图3B），与先前对细胞质膜内基传输7，16的分析一样。使用2nM链球菌素-QD治疗的微流体室在微腔中未显示移动QD，如摄影师图所示（图3A）。在相同条件下生长的细胞用500 pM或2 nM BDNF-QD刺激210分钟，然后用核染色进行固定和标记。如图3C所示，神经元显示BDNF-QD在所有分析的子舱中，包括微型的近位和近侧部分和躯体室的剂量依赖性积累。相比之下，控制神经元在整个腔室中几乎没有QD信号。因此，BDNF-QD可以在微流体室的活细胞和固定细胞中检测。
图1：HEK293细胞中BDNFAvi的生产和单生物基化。HEK293细胞使用PEI试剂和BDNFAvi编码质粒进行转染，48小时后收集条件介质。BDNFAvi含有6x希西丁标签，允许使用镍亚硝酸（Ni-NTA）色谱进行纯化。商用重组人类BDNF的预期分子量为±13 kDa，而BDNFAvi的分子量为±18kDa。BDNFAvi 与树脂结合，经过连续四个洗脱步骤的完全洗脱。（A） 西方印迹使用抗BDNF抗体检测内部准备的重组BDNF和商业BDNF。含有已知数量的商用人类BDNF和每一 ELUATE的5μL的等分被加载到SDS-PAGE凝胶中，用于使用针对BDNF的抗体检测BDNFAvi。表1显示了每个水线中存在的BDNFAvi浓度。通过从市售BDNF的浓度曲线进行密度分析和插值，获得每个水深酸盐中BDNF的浓度和浓度。（B） BDNFAvi 生物素化验证.80纳米生物素化BDNFAvi（mbtBDNF）在4°C下用30μL的链球菌素与磁珠（20%浆料）耦合1小时孵育。然后，使用磁分离器分离磁珠。链球菌珠用加载缓冲器加热，以游化生物基化BDNFAvi（珠道）。上流剂 （SN 通道） 也经过装载缓冲液处理，在凝胶（SN 车道）中加热和加载。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：mbtBDNF生物活性的验证。（A） DIV7 皮质神经元血清饿死 1 小时， 然后用50纳克/mL的商用BDNF或mbtBDNF刺激30分钟。蛋白质被提取并加载到SDS-PAGE凝胶中，用于使用磷特异性抗体分析TrkB和ERK1/2磷酸化，并与使用抗体对总TrkB和ERK1/2的蛋白质总水平进行比较。（B） DIV7皮质神经元血清被血清饿死1小时，然后用200 pM或2 nM的mbtBDNF最终浓度与斯特普他丁-QD（BDNF-QD）耦合30分钟进行刺激。然后，对细胞进行固定，并标记pCREB进行荧光显微镜分析。（C） 核pCREB荧光强度的定量。结果对应于从3个独立实验中汇集的90个神经元，显示为均值= SEM。统计分析对应于具有 Tukey 多重比较测试的一个双向 ANOVA（***p < 0.0001）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在活细胞和固定细胞中对BDNF-QD进行可视化。（A） 在微流体室中生长的DIV7皮质神经元在轴突腔中受到刺激，最终浓度为2 nM BDNF-QD，为3.5小时，然后用活细胞显微镜设置对微流体近端部分进行成像。显示了控制状况（用链球菌素-QD治疗）和BDNF-QD治疗时具有代表性的基米表。（B） BDNF-QD移动速度的量化。移动 puncta 被定义为在 120 s 的录制中移动超过 10 μm 的 puncta。（C） 在微流体室中生长的DIV7皮质神经元在气囊中受到刺激，最终浓度为BDNF-QD为500 pM或2 nM，为3.5小时，然后用 Hoechst 进行固定和标记，以可视化核。显示了躯干隔间和微粒的侧向和近位部分的代表性图像。请单击此处查看此图的较大版本。
| 埃卢亚特 | Bdnf （ng） 在 5μl | [ng/[l] | BDNF[μg] 总计 |
| E1 | 142.2 | 28.4 | 28.4 |
| E2 | 101.2 | 20.2 | 20.2 |
| E3 | 65.6 | 13.1 | 13.1 |
| E4 | 30.4 | 6.1 | 6.1 |
| 67.8 |
表1：BDNFAvi纯化产量的量化（与图1A有关）。HEK293细胞通过驱动BDNFAvi的质粒进行转染，该蛋白通过Ni-NTA亲和色谱法进行纯化。蛋白质浓度和最终产量通过密度分析计算，并在商用可售重组人类BDNF的已知浓度曲线中插值。
补充文件1：文化媒体和缓冲区组件请点击这里下载此文件。
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Discussion
本文根据宋和合作者17的工作，描述了在基于亲和力色谱的工艺中生产和纯化mbtBDNF的优化方法。优化包括使用具有成本效益的转染试剂 （PEI），同时保持更昂贵的转染方法（如脂氨基胺）的效率。这种优化可显著降低协议成本，实现可扩展性，同时保持高成本效益。该协议还包括易用性考虑，包括冻结有条件介质长达2个月。这些优化使程序适应每个实验室的需求，提高成本效益，并产生均匀和生物活性重组BDNF。该协议还可以通过用圆锥管中珠子的引力沉淀取代色谱仪的使用，适应小规模生产。这是一个可行的方法，但其效率较低，并导致我们的经验产量较低。然后，生物素标记的BDNF可以耦合到不同的链球蛋白结合探头，包括荧光和顺磁纳米粒子，因此，它成为进行不同类型的实验以分析BDNF后细胞贩运的宝贵工具。因此，这种蛋白质的优化和简单的生产协议对于在这一领域的实验室中非常有用。
在原核系统中生产具有复杂翻译后修饰的重组蛋白，如BDNF24，往往导致蛋白质不能正确折叠，因此具有不良的生物活性25。因此，在哺乳动物细胞中表达是获得生物活性蛋白质所必需的。此前，PEI的使用被描述为在转染哺乳动物细胞25、26,中大规模生产重组蛋白的可行替代品，在学术实验室中，HEK293细胞转染的效率已得到强调。因此，使用此细胞系代表一个有效的选择，以可由学术实验室管理的量级生产BDNFAvi。通过生成与BDNFAvi稳定转染的 HEK293 细胞系，可以进一步优化拟议的协议，从而消除瞬态转染步骤，从而节省时间和资源。优化的另一个潜在的来源是使用悬浮细胞而不是粘附细胞。HEK293细胞可以保持悬浮，产生大量的重组蛋白在克每升28的范围内。
该协议的另一个改进是使用体外策略对BDNFAvi蛋白进行生物基化，取代了之前的体内共膜感染协议。瞬态共膜在构造的表达方面可能产生意外的结果，如在多个细胞系和几个转染试剂29中所证明的。各种因素可影响转染蛋白在共转染环境中的表达，包括载体、细胞类型和质粒浓度。这种多重因素使得优化和可重复性成为一项复杂的任务。另一方面，体外方法可以更好地控制生物素化反应发生的条件。此方法可产生重组 BDNF 的可重复和均匀标记。
正如生物活性验证实验所证明的，在BDNF-TrkB信号通路激活方面，使用该协议生产的mbtBDNF可与市售的重组人类BDNF相媲美。数据还显示，将BDNF耦合到streptavidin-QD不会干扰BDNF-TrkB信令。此外，我们表明，BDNF-QD可以通过活细胞和固定细胞的荧光显微镜检测。因此，mbtBDNF是研究逆行斧弓贩运的宝贵工具，它比替代探针（如BDNF-GFP16）具有显著优势。本文中描述的协议为mbtBDNF的产生提供了可靠和一致的方法，然后可用于表达TrkB或p75的不同神经元模型的内分泌动力学研究。BDNF信号对神经元形态学和功能3、4、21,21有有效影响，最近被提出为增强神经元再生的潜在治疗工具3,30、31，使其研究30,31在细胞生物学和生物医学领域具有相关性。研究BDNF信号和贩运的影响将进一步促进我们对神经元细胞生物学的理解，并可能允许在临床环境中利用其再生潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢方德西特 （1171137） （FCB）， 巴塞尔科技卓越中心 （AFB 170005） （FCB）， 千禧年核心 （P07/011-F（FCB）、威康信托高级调查员奖（107116/Z/15/Z）和英国痴呆症研究所基金会奖（GS）。这项工作得到了UC微镜协会（UMA UC）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
References
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
- Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
