Summary
En protokol til undersøgelse af biologisk væv ved høj rumlig opløsning ved hjælp af ultra-højt felt magnetisk resonansmikroskopi (MRM) ved hjælp af mikrokoil præsenteres. Trin-for-trin instruktioner er fastsat for at karakterisere mikrokoiler. Endelig er optimering af billeddannelse demonstreret på planterødder.
Abstract
Denne protokol beskriver en signal-støj-kalibrering (SNR) kalibrering og prøveforberedelsesmetode for magnetmikrosiler kombineret med biologiske prøver, der er designet til magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) med høj opløsning (MRI), også kaldet MR-mikroskopi (MRM). Det kan anvendes ved prækliniske MR-spektrometre, demonstreret på Medicago truncatula rodprøver. Mikrokospoler øger følsomheden ved at matche RF-resonatorens størrelse med størrelsen af den stikprøve, der er af interesse, hvilket muliggør højere billedopløsninger i en given dataindsamlingstid. På grund af det relativt enkle design er solenoidal mikrokoil ligetil og billige at konstruere og kan nemt tilpasses prøvekravene. Systematisk forklarer vi, hvordan man kalibrerer nye eller hjemmebyggede mikrokospoler ved hjælp af en referenceløsning. Kalibreringstrinnene omfatter: bestemmelse af impulseffekt ved hjælp af en nøddebue; skøn over homogeniteten i RF-feltet og beregning af et volumenavanaliseret signal-støj-forhold (SNR) ved hjælp af standardpulssekvenser. Vigtige trin i prøveforberedelsen til små biologiske prøver diskuteres, samt mulige formildende faktorer såsom magnetiske følsomhedsforskelle. Anvendelserne af en optimeret magnetspole demonstreres ved høj opløsning (13 x 13 x 13 μm3,2,2 pL) 3D-billeddannelse af en rodprøve.
Introduction
Magnetisk resonans billeddannelse er et alsidigt værktøj til noninvasively billede en bred vifte af biologiske prøver, der spænder fra mennesker til enkelteceller 1,2,3. Mens MR-scannere til medicinsk billedbehandling applikationer typisk bruger magneter med en feltstyrke på 1,5 T til 3 T, encellede applikationer er afbildet på meget højere felt styrker1,3,4. Studiet af prøver ved opløsninger på under hundrede mikrometer kaldes magnetisk resonansmikroskopi (MRM)5. MRM lider dog af et lavt signal-støj-forhold (SNR) sammenlignet med andre tilgængelige mikrokopi- eller billeddannelsesteknikker (f.eks. optisk mikroskopi eller CT). Der kan følges flere tilgange for at optimere SNR6. En tilgang er at bruge en højere magnetfeltstyrke, mens en supplerende tilgang er at optimere signaldetektoren til individuelle prøver. For sidstnævnte skal detektorens dimensioner justeres, så den svarer til dimensionerne af den pågældende prøve. For små prøver, der er ≈0,5-2 mm i diameter (f.eks. rodvæv), er mikrokopper nyttige, da SNR er omvendt proportional med spolens diameter6,7. Opløsninger så højt som 7,8 x 7,8 x 15 μm 3 er blevetnået på dyreceller ved hjælp af dedikerede mikrokoil8. En række mikrospole typer findes, med planar og solenoid spoler mest almindeligt anvendt afhængigt af anvendelsen og væv geometri9. Planar spoler har høj følsomhed tæt på deres overflade, hvilket er nyttigt til applikationer på tynde skiver. For eksempel er en metode designet specielt til billeddannelse perfunderet væv blevet beskrevet for planar mikrokoil10. Men planar spoler har en høj falloff af følsomhed og ingen veldefineret reference puls magt. Solenoid spoler, er cylindrisk, har et bredere område af ansøgningen og er mere begunstiget for tykkere prøver. Her beskriver vi magnetspolens egenskaber, en protokol til forberedelse af prøver til mikrospole MRI, samt kalibrering af en magnetmikroscoil (Figur 1A).
Magnetspolen består af en ledende tråd, der er spolet, som en proptrækker, omkring en kapillær, der holder prøven (Figur 1B). Mikrospolekonstruktioner kan konstrueres ved hjælp af kun emaljeret kobbertråd, et sortiment af kondensatorer og en egnet base til lodning af komponenterne (Figur 1B). De største fordele er enkelhed og lave omkostninger, kombineret med gode ydeevne egenskaber i form af SNR per enhed volumen og B1 felt homogenitet. Den nemme konstruktion muliggør hurtig iteration af coil design og geometrier. De specifikke krav til magnetmikroscoildesign og sondekarakterisering (dvs.teorien om elektronik, målinger af arbejdsborde og spektrometermålinger for en række coilgeometrier) er blevet beskrevet udførligt andre steder7,11,12,13,14.
En solenoid coil kan bygges ved at huske design regler for de ønskede dimensioner i henhold til de retningslinjer, der erbeskrevet andetsteds 15,16. I dette særlige tilfælde blev der anvendt en spole med en indre diameter på 1,5 mm, fremstillet af emaljeret kobbertråd, 0,4 mm i diameter, loopet omkring en kapillær på 1,5 mm ydre diameter. Denne magnetventil holdes på en bundplade, hvorpå der er lavet et kredsløb, bestående af en tuning kondensator (2,5 pF), en variabel matchende kondensator (1,5-6 pF) samt kobberforbindelsesledninger (Figur 1A, 1C). Tuning kondensatoren er valgt for at opnå den ønskede resonansfrekvens på 950 MHz, mens den matchende kondensator er valgt for at opnå den maksimale signaltransmission ved en impedans på 50 Ohm. Den større kondensator er variabel for at give mulighed for finere justering. Ved regelmæssig drift udføres indstilling og matchning ved hjælp af kondensatorer i sondebasen. Den samlede mikrospole skal monteres på en sonde, så den kan indsættes i magneten. Der kan være behov for en ekstra indehaver afhængigt af systemet. Her bruger vi en 22,3 T magnet kombination med en Bruker Console Avance III HD i kombination med en Micro5 sonde. I dette tilfælde brugte vi en modificeret støtteindsats udstyret med de nødvendige tilslutninger til at oprette forbindelse til sondens 1H-kanal (Figur 1A).
Spolens følsomhedsmatchet design omfatter et reservoir med perfluoreret væske for at reducere uoverensstemmelser om følsomheden, som skyldes, at kobberspolen ligger tæt påprøven 17. Et reservoir blev lavet af en plastik sprøjte til at vedlægge spolen og fyldt med fomblin. Da den perfluorerede væske skal omslutte spolen, reduceres den tilgængelige diameter for en prøve til en ydre diameter på 1 mm. For at lette prøveskift blev prøven fremstillet i kapillær med en ydre diameter på 1 mm og en indre diameter på 700 μm. De nødvendige værktøjer til prøveforberedelse er vist i figur 2A.
Grundlæggende eksperimentelle MR-parametre er meget afhængige af hardwaren i det anvendte system, herunder forløbssystem, feltstyrke og konsol. Flere parametre kan bruges til at beskrive systemets ydeevne, hvoraf 90° pulslængde og -effekt, B1-homogenitet og SNR pr. enhedsvolumen (SNR/mm3)er de mest praktisk relevante. SNR/mm3 er nyttigt til at sammenligne ydeevnen af forskellige spoler på det samme system18. Mens der kan være hardwareforskelle på tværs af systemer, letter en ensartet anvendelse af en benchmarkingprotokol også sammenligningen af systemets ydeevne.
Denne protokol fokuserer på kalibrering og prøveforberedelse. Den trinvise karakterisering af solenoid mikrokoils ydeevne er vist: kalibrering af 90 ° puls længde eller effekt; vurdering af RF-feltets homogenitet og beregning af SNR pr. volumen (SNR/mm3). En standardiseret spin-ekko måling ved hjælp af et fantom er beskrevet for at lette en sammenligning af spole design, som giver mulighed for optimering af forskellige applikationer. Fantomprøver og biologiske prøvepræparater, der er specifikke for mikrokoser, er beskrevet. Protokollen kan implementeres på enhver egnet smalboringer (≤60 mm) lodret magnet udstyret med et kommercielt tilgængeligt mikrobilledsystem. For andre systemer kan det fungere som en retningslinje og kan bruges med nogle justeringer.
Biologisk prøvepræparat til MR-målinger er normalt ikke særlig omfattende, da prøven afbildes så intakt som muligt. Luftrum i biologisk væv kan dog forårsage billedartefakter på grund af forskelle i magnetisk følsomhed19. Effekten øges med stigende magnetfeltstyrke20. Således bør luftrum undgås ved høje felt styrker, og dette kan kræve nedsænkning af prøven i en væske for at undgå luft omkring vævet og fjernelse af luftrum i vævsstrukturerne. Specifikt, når mikrokoil er ansat, excision af den ønskede prøve væv kan være påkrævet, efterfulgt af nedsænkning det i en passende væske. Dette efterfølges af indsættelse af prøven i en forskåret kapillær, og endelig forsegling kapillær med kapillær voks. Brug af voks som fugemasse i stedet for lim, flammeforsegling eller alternativer betyder, at prøven let kan ekstraheres. Denne procedure er demonstreret på roden af Medicago truncatula, en lille bælgplanter plante. En fordel ved denne protokol er muligheden for efterfølgende samregistrering af MR-data med optisk mikroskopi, da prøven ikke ødelægges under MRI-målingen.
Den præsenterede protokol er velegnet til målinger af in situ med høj rumlig opløsning, og mere omfattende design kan give mulighed for billeddannelse i vivo-prøver, hvor der skal tages fat på udfordringer i forbindelse med livsstøttesystemer.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol beskriver procedurer for anvendelse og evaluering af spoleegenskaber for en 1,5 mm indre diameter (ID) magnetspole (Figur 1). Den spole, der anvendes til at demonstrere protokollen, har til huse i et følsomhedsmatchet reservoir, men protokollen gælder også for uovertrufne spoler. Protokollen kan tilpasses til andre størrelser og forskellige spektrometeropsætninger.
1. Forberedelse af referenceprøve
- Til fremstilling af 100 ml af følsomhedsreferenceopløsningen opløses 156,4 mg CuSO4 ∙ 5 H2O i 80 ml D2O indeholdt i en 100 ml GL45-kolbe. Kobbersulfatet reducerer både T1- og T2-afslapningstiden, hvilket giver mulighed for hurtigere målinger, mens D2O forhindrer strålingsdæmpning og mætningseffekter. Rør manuelt, indtil faste stoffer er helt opløst.
- Volumenet justeres til 100 ml ved hjælp af deioniseret vand for en endelig koncentration på 1 g/L CuSO4 (vandfri, 6,3 mM). Denne koncentration er tilstrækkelig til at forkorte T1 og T2 afslapning, men ikke for høj til at blive påvirket af nedbør. Referenceprøven forsegles for at undgå ændring af forholdetH 2O: D2O.
- Eventuelt skal du tilslutte sonden til en netværksanalysator for at teste, om spolen giver genlyd ved den ønskede resonansfrekvens. Udfør en S11 reflektancetest for at måle det frekvensområde, der opnås ved justering, og for Q-faktormålinger som beskrevet i detaljer af Haase et al.14. Tilslut mikrokospolen til netværksanalysen ved hjælp af et koaksialt kabel. Brug om nødvendigt et BNC-adapterkabel.
- Indstil centerfrekvensen på netværksanalysatoren til den ønskede resonansfrekvens, afhængigt af den tilsigtede magnetfeltstyrke, som spolen er designet til. Derefter skal du indstille fejebredden til 10 MHz. Juster den variable kondensator på mikrospoleenheden, hvis den findes, til at finjustere reflektorens dyp til den ønskede frekvens.
- Baseret reflektsniveauet ved centerfrekvensen og frekvensen f1 og f2 på -7 dB-niveauet. Brug disse til at beregne Q-faktoren på -7 dB-niveauet i henhold til Haase et al.14
2. Prøveforberedelse
- Hvis der forberedes en referenceprøve til kalibrering af coil, overføres 1 ml CuSO4-opløsning til en urglasskål under et stereomikroskop.
- Hvis der forberedes en biologisk prøve, overføres 1 ml perfluordecalin (PFD) til et urglas under et stereomikroskop, som vil blive brugt til at nedsænke prøven. PFD anvendes, da det kan fylde luftrum i prøven, uden at indtaste biologiske celler. Det er heller ikke observeret af proton MR. Se straks urglasset med et petriskålslåg for at forhindre fordampningstab, før PFD'en er nødvendig.
BEMÆRK: PFD er meget flygtig og en potent langsigtet drivhusgas21. Når dens ilt-opløsende egenskaber og dens lave viskositet ikke er påkrævet, kan det erstattes med Fomblin, en perfluoroether, som også giver nogen observerbare 1H signal, men som ikke fordamper så hurtigt17. - Skær kapillærer af passende ydre diameter til størrelse, passer ind i diameteren af mikrospole holder (18 mm) og giver mulighed for repositionering(Figur 1C). Brug en keramisk fræser til at lave et snit hver 10-12 mm og bryde forsigtigt på indsnit punkt.
- Hvis der forberedes en referenceprøve, skal du bruge en pincet og stereomikroskopet til at bringe en forskåret kapillær i kontakt med overfladen af CuSO4-opløsningen inde i urglasset, så kapillær handling kan fylde kapillæren.
- Hvis der forberedes en biologisk prøve, skal du bruge en pincet og et stereomikroskop for at bringe en forskåret kapillær i kontakt med overfladen af PFD inde i urglasset, så kapillær handling til at fylde kapillæren fuldt ud. Slip kapillæren i urglasset, så det bliver helt nedsænket.
- Ekstrakt forsigtigt en fem uger gammel hele rodsystemet fra sin vækst substrat, såsom en perlite jord udskiftning. Rengør roden prøven omhyggeligt af rhizosheath. Fjern store jordpartikler ved hjælp af pincet, og hvis der findes mindre partikler, skal du fjerne dem ved at vaske rodsystemet med destilleret vand. Foto, hvis det er nødvendigt for fremtidig reference. Vælg og punktafgifter en lille del af fibrøst rod fri for rhizosheath ved hjælp af en skalpel.
- Til vakuumbehandling anbringes prøven i et 1,5 ml rør, der indeholder en passende fiksativ opløsning. Lad rørhætten være af, og forsegle derefter røret med parafilm for at forsegle rørets åbning. Derefter punch huller i filmen med et skarpt værktøj til at give mulighed for ventilation af røret.
- Sæt prøverøret i et vakuumkammer, forsegle kammeret, og tilslut en lab membran vakuumpumpe til kammeret. Underkaste prøven til vakuumbehandling i op til 30 minutter for at reducere tilstedeværelsen af luftlommer i biologiske prøver. Stands vakuumbehandlingen, når der ikke ses luftbobler, der slipper ud af prøven.
- Mens man ser gennem et stereomikroskop, skal du bruge en pincet til at nedsænke prøven i infiltrationsmediet, der er forberedt tidligere. Vask prøven af potentielle snavs.
- Prøven indsættes i kapillæren med en pincet, mens både kapillæren og prøven er helt nedsænket for at undgå, at luftbobler medtages. Brug en mindre kapillær eller sprøjtenålespids som skubbestang (Figur 2B).
- Tag prøven kapillær fra medium ur glas, ved hjælp af pincet. I tilfælde af PFD skal petriskålen låget dækkes.
- Forme silkepapiret til et fint punkt og bruge det til at fjerne ca 1 mm væske fra begge ender af kapillær.
- Smelt en lille mængde kapillær voks ved hjælp af en vokspen. Påfør voks på begge sider. Voksen vil blive uigennemsigtig, når det størkner. Pas på at udelukke luftbobler fra kapillæren (Figur 2C).
BEMÆRK: Undgå overophedning af voks eller kapillær, da dette kan forårsage eksplosiv kogning samt kavitationslommer, når den færdige prøve køler. - Bagefter skrabe overskydende voks fra ydersiden af kapillær ved hjælp af en skalpel og tør ren med fint silkepapir.
3. Montering af prøven
- Anbring en mikrokospole under stereomikroskopet, og indsæt prøven med en pincet, samtidig med at mikrospolen er stabil (Figur 2D).
- Brug en stang til at centrere prøven i mikrospolen ved at skubbe kapillæren inde i magnetspolen.
- Eventuelt anvende tape til at fastsætte placeringen af kapillær.
- Undersøg kapillæren for at sikre, at der ikke er synlige luftbobler inde i magnetspolen for at undgå MR-signaldestruktion forårsaget af følsomhedsforskelle.
- Fastgør mikrospolen til soklens sokkel, mens mikrospolen sidder oprejst(Figur 3A,3B).
- Skub forsigtigt forløbspolerne med tre akse over mikrospolen, mens forløbets vandkølende konnektorer svarer til sondebasens(figur 3C). Drej skruetråden på sondebasen for at fastgøre gradienten på plads.
BEMÆRK: Dette trin gælder kun for en Micro5-sonde. I tilfælde af andre systemer såsom Micro2.5 eller Biospect, gradienterne er på en separat sokkel end spolen.
4. Bestemmelse af spoleegenskaber
- Hvis spolen testes første gang, anvendes referenceprøveopløsningen til at skabe en homogen prøve, som er nyttig til effektkalibrering og B1-homogenitetstest. Potentielle modtagelighedsproblemer som følge af spoleledningerne kan let afprøves med denne referenceprøve.
- Sæt sonden i magneten og tilslut de nødvendige kabler: RF-sender-/modtag-kabel, vandkøleledninger, termoelementkabel og luftkølingsledning.
- Indstil den ønskede vandkøletemperatur (anbefalet 298 K) til vandkøleenheden.
- Måltemperaturen (298 K) og målgasstrømmen (300 L/h). Gasstrømmen kan være anderledes for et andet spoledesign eller prøvevolumen. Dette gælder kun for systemer med et temperaturkontrolsystem.
BEMÆRK: De næste skridt er kun nødvendige, når du tester nye (hjemmebyggede) spoler. - Tilslut sonden ved hjælp af et 50 Ω co-aksialt kabel til en netværksanalysator med en passende bred fejebredde (400 MHz), centreret om den tilsigtede resonansfrekvens.
- Overhold resonanstilstandene ved at justere de variable matchende og indstillende kondensatorer, der er til stede i sondebasen.
- Stil og match resonanstilstanden med den ønskede frekvens.
- Du kan også bestemme coilkvalitetsfaktoren (Q-factor) på netværksanalysen. En metode til at opnå kvalitetsfaktoren er at bruge et koblingsnetværk og dividere midterfrekvensen (fc) med refleksionsdukkertens bredde ved -7 dB (dvs. Q = fc /(f1 - f2)14. Indstil f c til magnetens driftsfrekvens, mens f1 og f2 er indstillet til henholdsvis -7 dB-punktet til venstre og højre for fc. Nogle netværks analysatorer har indbygget Q-factor-bestemmelse.
- Start en reflektstest på scanneren, normalt kaldet en wobble kurve, og juster tuning og matchning efter behov. Det anbefales at indstille enhver tuning og matchende kondensatorer til midtpunktet af deres sortiment for nye spoler. Start derfor med en høj spektral fejebredde. I nogle tilfælde kan det være mere bekvemt at indstille og matche spolen uden for magneten på en netværksanalysator.
- Vælg en shim-fil til billedsondens største volumenspole, hvis den er tilgængelig. Hvis du starter fra en spole, der tidligere har været brugt, skal du bruge en tilgængelig shim-fil. Hvis begge indstillinger ikke er tilgængelige, skal du starte med alle shim-værdier angivet til 0.
- Vælg den korrekte spolekonfiguration for mikrospolen, hvis den er tilgængelig i billedsoftwaren (dvs. Ellers skal du oprette en ny spolekonfiguration, der matcher specifikationerne for spolen (f.eks. enkelttunet eller dobbelttunet) i henhold til manualen i systemet. Skøn for de sikre grænser for denne magnet mikrospole, der anvendes i denne forskning med 1,5 mm indre diameter i størrelse er 1 ms ved 1 W peak effekt og 1 mW kontinuerlig effekt.
FORSIGTIG: De små kondensatorer (typisk 1 mm i størrelse), der er nødvendige for mikrokospoler, er meget følsomme og let beskadiget af høje spændinger. Automatiseret pulseffektbestemmelse fungerer muligvis ikke med ikke-standardspoler, og for høje kræfter kan forårsage skade på spektrometerets spole eller andre dele af spektrometeret. Derfor anbefales manuelle justeringer. - Optag en nøddeknæmningskurve for en ny spole for at få en indikation af den korrekte RF-effekt for spolen (Figur 4). Hvis de sikre grænser for spolen er ukendte, skal du starte med 10 μs ved en lav pulseffekt på 0,6 W og langsomt øge pulslængderne med 1 μs ad gangen, indtil signalet vises.
- Brug et FID-eksperiment i mangel af gradient-kodning, og æter RF-pulse-længden systematisk, samtidig med at pulseffekten forbliver konstant. Den ideelle pulslængde er pulslængden, hvor signalintensiteten når maksimum. Hvis du tester en ny spole, skal du bruge en puls på 10 μs med en meget lav effekt først og begynde at øge pulseffekten gradvist.
BEMÆRK: Hvis strømmen er meget højere end forventet for kombinationen af spoleegenskaber og spektrometer, er dette allerede et tegn på, at den forkerte resonanstilstand er valgt. - For en spole med et homogent B1-felt,som en magnetspole, bestemmes 180° pulsen, hvor signalintensiteten falder til nul22.
- Brug et FID-eksperiment i mangel af gradient-kodning, og æter RF-pulse-længden systematisk, samtidig med at pulseffekten forbliver konstant. Den ideelle pulslængde er pulslængden, hvor signalintensiteten når maksimum. Hvis du tester en ny spole, skal du bruge en puls på 10 μs med en meget lav effekt først og begynde at øge pulseffekten gradvist.
- Indstil den bestemte 90° pulseffekt til justeringskortet i den oprettede undersøgelse. I ParaVision kan referenceeffektjusteringskortet bruges til at indtaste den hårde impulseffekt.
- Brug en localizer scanning med 3 skiver, et udsnit i hver af de tre primære akser, for at finde placeringen af spolen i magneten. Det kan du gøre ved at indlæse en lokaliseringsscanning fra spektrometerets standardbibliotek. Det anbefales at starte med et stort synsfelt uden forskydning. Udfør en automatisk justering af modtagerens forstærkning, og start målingen manuelt.
BEMÆRK: Hvis prøven er nøjagtigt i midten af forløbssystemet, viser localizer-scanningen eksemplet. Hvis spolen eller prøven ikke er centreret i billedudsnittene eller mangler, skal localizer-scanningen justeres, og i så fald skal trin 4.12 udføres igen. - Alternativt kan du bruge en supplerende måde at finde den korrekte 90 ° puls baseret på billedevaluering. Når en omtrentlig pulseffekt er fundet ved hjælp af nøddefunktionskurven, skal du justere impulskræfterne gradvist for at kontrollere billedet for B 1-felthomogenitet. For nogle spoler med et uhomogent B1 felt kan den 90° pulseffekt, der bestemmes ved hjælp af nøddeskurven, overvurderes, hvilket fører til overtipping i spolens ønskede sweet spot. I dette tilfælde skal du reducere referencepulsens effekt og kontrollere de nye billeder i forhold til de tidligere billeder (Figur 5).
- Shim magnetfeltet manuelt baseret på FID-signalet. En anbefalet ordre til indledende flimrende er Z-Z2-Z-X-Y-Z-Z2-Z-XY-XZ-YZ-Z. I tilfælde af en magnetventil er den vigtigste symmetriakse i XY-flyet. Shims i forskellige retninger kan derfor resultere i en stærkere korrektion af B0-homogeniteten for denne spolekonfiguration. De højere ordensslimr har ringe effekt og kan ignoreres.
- Der beregnes en volumenavanertiseret SNR for at gøre det muligt at sammenligne mikrospolens egenskaber på tværs af forskellige systemer, tilpasset fra producentens protokol18. For de mikrokoiler, der anvendes her, brugte vi en spin-echo sekvens med følgende parametre: synsfelt (FOV) 6 mm x 6 mm, gentagelsestid (TR) 1000 ms, ekkotid (TE) 7 ms, Matrix 256 x 256 og skivetykkelse = 0,5 mm. Juster udsnitstykkelsen, indtil modtagerens forstærkning er enhedsenhed. Juster derefter antallet af udsnit, så udsnit strækker sig ud over området B1-felt homogenitet. Optag billederne uden signalgennemst gennemsnit, hvis det er muligt.
- Den normaliserede SNR (SNR/mm3)bestemmes i to trin. Først beregnes voxelvolumen (Vvoxel)(Eq. 1):
(1)
BEMÆRK: Enhederne for Dx, Dy og D skive er i mm. Denne beregning kan ligeledes udføres for en række udsnit. - Vælg de områder, der er af interesse for at bestemme signalintensiteten (μROI) for prøven og signalintensiteten (μstøj) ogstandardafvigelsen( σ støj ) for et område uden for prøven (dvs.støjen). Middelsignalet tages fra midten af billedet, mens støjsignalet beregnes ud fra hjørneplasterne (Figur 6). Enten spektrometerkontrolsoftwaren eller billedbehandlingssoftware til generelle formål kan anvendes til disse beregninger. Brug en enkelt gentagelse, hvis det er muligt, for at opretholde sammenligneligheden mellem forskellige spoler.
- Brug værdierne til at beregne en normaliseret diskenhed (Eq. 2):
(2)
For den spole, der anvendes her i kombination med referenceopløsningen, resulterer Eq. 2 i følgende opløsning:
(3)
BEMÆRK: Når man sammenligner SNR af spoler ved forskellige magnetfelt styrker, afslapning egenskaber fantom skal måles23, medmindre en meget lang gentagelse tid og meget kort ekko tid anvendes.
- Den normaliserede SNR (SNR/mm3)bestemmes i to trin. Først beregnes voxelvolumen (Vvoxel)(Eq. 1):
- Kontroller, om der er problemer med modtagelighed på grund af inhomogeniteter i magnetfelter: indlæs og kør en mge-sekvens (multiple gradient-echo) (Figur 7). Magnetfelt inhomogeneities på grund af følsomhed forskelle er synlige i billederne med længere ekko gange, som gradient ekko ikke refokusere spins, som dephase på grund af statisk felt inhomogeneities. På denne måde kan uhomogeniteter i prøven visualiseres (på grund af luftrum i prøven) samt B0 felt inhomogeniteter, der indføres med spolematerialet. Brug følgende parametre, der skal justeres afhængigt af specifikationerne for spektrometeret og spolen, der anvendes: TR 200 ms, TE 3,5 ms med 48 ekkoer fordelt 3,5 ms fra hinanden, flip vinkel 30 grader. Matrix størrelse 128 x 128.
BEMÆRK: Hvis der blev observeret flere (potentielle) resonanstilstande eller refleksionsdips i resonanskurven (wobble), skal du gentage ovenstående trin for hver resonanstilstand for at bestemme den mest følsomme. Afhængigt af mikrospolen kan forskellige dele af mikrospolesamlingen være udsat for utilsigtede resonanstilstande.
(1)
(2)
(3)5. Billedbehandling i høj opløsning
- Kør et 3D-FLASH-eksperiment med følgende parametre: TR 70 ms, TE 2,5 ms, matrixstørrelse på 128 x 64 x 64, FOV 1,6 x 0,8 x 0,8 mm, flipvinkel 30° og modtagerbåndbredde 50 kHz.
- Udled pulskræfterne fra den referencepulseffekt, der er fastlagt tidligere. dette er automatisk i de fleste billedbehandlingssoftware. Bestem modtagerens forstærkning ved hjælp af automatiske justeringer. Juster om nødvendigt FOV og dækker hele objektet i begge fasekodningsretninger for at undgå aliasing. Kør en gradueringscyklussimulering, hvis den er tilgængelig på systemet, for at kontrollere, at eksperimentets arbejdscyklus forbliver inden for specifikationerne for gradientspolerne.
BEMÆRK: Disse parametre er specifikke for den spole, der anvendes til demonstration; det er vigtigt at optimere til de lokale systemdeler.
6. Genindvinding af prøver til yderligere undersøgelse eller opbevaring
- Tag prøvekapillæren ud af mikroscoil.
- Brug en pincet, fjerne voks stik under et stereomikroskop.
- Brug en sprøjte til at vaske prøven ud af kapillæren med en opløsning af valg. Alternativt kan du bruge en glasskuberstang til at skubbe prøven ud.
- For at undgå dehydrering af prøven opbevares der et egnet medium til opbevaring.
Representative Results
Karakterisering af coil
Efter vellykket tuning og matchning af en spole, kan dens ydeevne være kendetegnet ved spolen Q-faktor, 90 ° reference puls, og SNR/mm3. For den her påvist 1,5 mm ID-følsomhedsmatchet magnetspole var den målte Q-faktor (losset) 244 sammenlignet med 561 for en 5 mm fuglefoderspole.
Referencen 90° puls var 12 μs ved et effektniveau på 0,6 W; jf. 5 μs ved 45 W for en 5 mm fuglefoderspole (Figur 4 og Figur 5). Dette svarer til en RF puls felt styrke (B1), ved hjælp 
af 0,53 mT for mikrospole og 1,17 mT for birdcage coil14, hvor y er gyromagnetic forholdet, mens tau er pulsen varighed. Da pulseffektniveauet (P) er forskelligt, kan spoler sammenlignes med hensyn til overførselseffektivitet: 
henholdsvis 0,69 mT/W1/2 og 0,18 mT/W1/2 for henholdsvis mikrospole og fuglebur14. Sammenlignet med en 90 ° puls, mikroscoil er fundet at være en faktor ≈ 4 gange mere følsomme end birdcage coil.
Effekt af følsomhedsmatchning
Ved ultrahøje feltstyrke bliver prøve- og spolemodtagelighed en dominerende faktor for billedkvaliteten, som det ses i figur 7A,7B. Sammenlignet med en spole, der mangler en følsomhed, der matcher væskebeholderen, bevares signalet længere og mere homogent i en referenceprøve. På grund af følsomhedsbeholderen falder de maksimale prøvedimensioner dog med hensyn til spolen uden beholderen.
Billedbehandling i høj opløsning
En høj opløsning på 13 x 13 x 13 μm3 af en Medicago truncatula rodprøve blev opnået i 20 timer og 23 minutter (Figur 8). Startende fra overfladen af roden, er roden cortex set, sammen med nogle resterende vand på ydersiden af roden. Desuden er xylem observeret som et mørkt bånd omslutter phloem. Nogle luftlommer er observeret som mørke pletter med fuldstændig signaltab.
Symbiotiske rodknuder af M. truncatula kan også afbildes ved hjælp af denne protokol (Figur 9). Ved hjælp af en lidt større uovertruffen spole (længde ca. 3500 μm, indre diameter 1500 μm) blev billeder med en opløsning på op til 16 x 16 x 16 μm3 opnået på 33 minutter.
Figur 1: En magnetmikrospole. (A) Solenoid coil design består af wire looped helically, typisk viklet omkring en kapillær. Trådens geometri, såsom dens tykkelse, diameter, antal viktninger og trådafstand, påvirker spolens egenskaber. (B) En hjemmebygget magnetmikrospole med et reservoir for følsomhed matchende væske (Fomblin). Den består af et 0,4 mm tykt belagt kobbertrådsår seks gange omkring kapillær med en ydre diameter på 1500 μm og en spolelængde på 3500 μm. Spolen er nedsænket i et reservoir, som er lavet af en sprøjte. Prøve kapillærer op til en ydre diameter på 1000 μm kan indsættes. Der anvendes to kondensatorer, en 1,5 pF kondensator i serie med induktoren og en anden variabel på 1,5-6 pF kondensator placeres parallelt med induktoren. Alle komponenter er loddet til et glasfiber bord (gul). Det er monteret på en kommerciel holder (grå polymer), der er modificeret til at støtte reservoiret. c) Komponenter til udformning af magnetspole: 1. magnetspole, 2. prøvekapillær, 3. 1,5 pF tuning kondensator, 4. variabel matchende kondensator, 5. glasfiber bundplade, 6. kobbertråd fører. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Prøvepræparering under et stereomikroskop. a) Genstande, der er nødvendige for fremstilling af mikrokospoler. Fra venstre mod højre: 1. CuSO4 referenceløsning, 2. perfluordecalin, 3. mikrospole, 4. skalpel, 5. positiv spænding pincet, 6. pincet, 7. kapillærer ydre diameter = 1000 μm, 8. vokspen, 9. kapillær voks, 10. nitrilhandsker, 11. stereomikroskop, 12. se glas med petriskålbetræk, 13. plantemateriale i vækstunderlag. Ikke vist: 2 ml sprøjte med ø 0,8 x 40 mm nål og fint silkepapir. b) Nærføring af prøven i kapillær med pincet, mens begge holdes nedsænket. c) Forsegling af kapillæren med smeltet voks. d) Indsættelse af den forberedte kapillær i mikroscoil. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Komponenten i en mikrobilledsonde. a)Micro5 sondebase, der indeholder alle nødvendige tilslutninger til vandkøling, opvarmning, temperaturfølere, gradienteffekt, RF (co-aksialt stik synligt) og eventuelt sondeidentifikation (PICS). Under sondebasen er der knapper, der gør det muligt at justere de variable tuning og matchende kondensatorer, samt fastholde skruer til at holde sonden på plads inde i spektrometeret. (B) Den hjemmebyggede mikrospolemontering oven på sondebasen. Bemærk de variable kondensatorer (hvid keramik), der er monteret på sondebasen, der giver mulighed for tuning og matchning. c) Integreret 3-aksial gradient monteret på sondebasen med vandkølende beholdere og guldbelagte kontakter til jordforbindelse af gradienten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Nøddekurve. Der anskaffes en nøddekurve til bestemmelse af referencepulsens effekt. Referencepulseffekten (90° puls) defineres som den kombination af effekt og pulslængde, der er nødvendig for at generere et B1-felt, der vender al tilgængelig magnetisering i z-retningen til det tværplan. Der registreres en række pulser, hvis der ikke er forløbskodning. Med hver puls øges enten puls- eller pulseffekten. Her indstilles pulseffekten til 0,6 W, mens pulslængden øges med 1 μs hver gang. Den maksimale signalintensitet angiver 90° pulsen, omkring 12 μs. 180° pulsen kan også bestemmes på denne måde ved hjælp af minimumsintensiteten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Visuel bestemmelse af 90° pulseffekt. Når der er fundet en omtrentlig referencepulseffekt ved hjælp af en nøddekurve, kan den kontrolleres visuelt ved at variere pulslængden. Afhængigt af spolen kan B1-feltet være mere eller mindre følsomt over for ændringer. a) 11 μs pulslængde. b) 12 μs pulslængde, optimal for denne spole. c) 13 μs pulslængde. d) 20 μs pulslængde. Hvis pulseffekten er indstillet for højt, kan der forekomme over-deponering, hvilket reducerer billedintensiteten i midten af spolen (pilespids). Det øgede B1-felt øger også spolens rækkevidde, som det kan observeres i billedets bredde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Placering af interesseregion. De regioner af interesse (ROI) for volumen normaliseret SNR beregning kan ses. Middelprøveintensiteten udtages af et investeringsafkast, der falder ind under referenceopløsningsprøven. Den gennemsnitlige støj og standardafvigelsen beregnes ud fra et eller flere investeringsafkast, der er placeret i billedets hjørner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: RF homogenitet evalueret ved gradient ekko billeddannelse. En mge-sekvens (multiple gradient echo) bruges til at evaluere RF-homogeniteten( B1 -Field) ved hjælp af en række forløbsek echoer. Grundlæggende parametre var: gentagelsestid 200 ms, ekkotid 3,5 ms med antallet af ekkoer 48, ekkoafstand 3,5 ms, 64 gennemsnit, anskaffelsestid 27 m 18 s, flip vinkel 30°. Synsfelt var 5 x 5 mm, matrix 128 x 128, opløsning 39 x 39 x 200 μm. (A) Modtagelighed-matchede spole. Følsomheden matchende væske (Fomblin) omkring RF spole reducerer følsomhedseffekter på grund af spoletråden. Små luftbobler forårsager tab af signal, efterhånden som ekkotiden øges. (B) En spole (ikke modtagelighed matchet) med lige spole diameter. Ved længere ekkotider observeres stigende artefakter forårsaget af B0 felt inhomogenitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: 3D-billeddannelse af en Medicago truncatula rodsektion. (Top)FLASH-billede. Flere funktioner i rodsektionen kan skelnes, herunder epidermis (e), cortex (c), phloem (ph) og xylem (xylem). Luftlommer (a) i roden forårsage fuldstændig signaltab. Grundlæggende parametre var som følger: Gentagelsestid 70 ms, ekkotid 2,5 ms, 256 gennemsnit, anskaffelsestid 20 h 23 m. Opløsning 13 x 13 x 13 μm3. Matrix størrelse var 128 x 64 x 64 og synsfelt 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Modtagerbåndbredde 50 kHz. (Nederst) MSME-billede. Grundlæggende parametre var som følger: Gentagelsestid 500 ms, ekkotid 5,2 ms, 28 gennemsnit, anskaffelsestid 15 h 55 m. Opløsning 13 x 13 x 13 μm3. Matrix størrelse var 128 x 64 x 64 og synsfelt 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Modtagerbåndbredde 70 kHz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: 3D-billeddannelse af en Medicago truncatula rodklyd. (Top) Billede med lav opløsning. Grundlæggende parametre var som følger: Gentagelsestid 60 ms, ekkotid 2,3 ms, 4 gennemsnit, anskaffelsestid 4 m. Opløsning 31 x 31 x 31 μm3. Matrix størrelse var 64 x 32 x 32 og synsfelt 2 x 1 x 1 mm. Modtagerbåndbredde 50 kHz. (Nederst) Billede i høj opløsning. Grundlæggende parametre var som følger: Gentagelsestid 60 ms, ekkotid 2,3 ms, 8 gennemsnit, anskaffelsestid 33 m. Opløsning 16 x 16 x 16 μm3. Matrix størrelse var 128 x 64 x 64 og synsfelt 2 x 1 x 1 mm. Modtagerbåndbredde 50 kHz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol er bedst egnet til biologiske prøver, da mange materialer og geologiske prøver har betydeligt kortere T2 afslapning gange, som ikke kan afbildes af de sekvenser, der anvendes her. Selv nogle biologiske væv, som udviser høj prøve magnetisk følsomhed heterogenitet, kan være svært at billedet på ultra-højt felt, da virkningerne er korreleret til feltet styrke24. Protokollen er ikke kun nyttig for nye spoler, men kan også hjælpe med fejlfinding og diagnosticering af potentielle problemer. Ved test af nye eller ukendte prøver kan denne protokol udføres på forhånd på referenceopløsningen for at kontrollere, at den eksperimentelle opsætning fungerer i overensstemmelse med specifikationerne. Dette hjælper i fejlfinding, da spektrometeret kan udelukkes som en kilde til artefakter og funktionsfejl. Desuden indstiller dette tuning og matchende kondensatorer på sonden til værdier, der er typiske for mikroscoil.
Når der ikke registreres noget signal ved det første eksperiment, kan lokaliseringsscanningens synsfelt forstørres for at kontrollere, om prøven ses. Derefter skal du kontrollere, om spolen er indstillet korrekt, igen, og forsøg en anden lokalisatorscanning. Det er muligt, at spolen udviser yderligere utilsigtede resonanstilstande, i hvilket tilfælde den korrekte skal bestemmes. Hvis der stadig ikke kan opnås et billede, fjernes prøven for at kontrollere dens position i mikroscoilsamlingen og kontrollere, at prøven er intakt (dvs. at der ikke er luftbobler eller utætheder i tætningerne). Endelig kan der fremstilles en prøve med vand i stedet for PFD. Hvis prøven giver lidt påviseligt signal i localizer scanningen, det omgivende vand i kapillær kan stadig detekteres.
Da mikrokoil ideelt set er meget tæt på prøven, kan de magnetiske følsomhedsforskelle mellem luften og ledningen forårsage yderligere signaltab, som det ses i figur 7B. Potentielle artefakter omfatter rumlig fejlmapping og unormal signalintensitet variation. Især gradient-echo type puls sekvenser påvirkes af denne ikke-ensartet signal tab. Af denne grund præsenterede vi en følsomhed-matchede spole, ved nedsænkning wiren i fluorvæske (Fomblin eller FC-43). B1-estimeringsmetoden i denne protokol kan hjælpe med at afgøre, om B1-følsomhedsforskellene berettiger til, at følsomhedsmatchningsstrategier medtages i udformningen af spolesamlingen. En alternativ metode til at konstruere en modtagelighed matchet spole er at bruge modtagelighed-matchede wire25. Desuden er der kun modtagelighed spørgsmål på grund af spolen er behandlet med denne tilgang. Uoverensstemmelser om modtagelighed i prøven (f.eks. på grund af luftrum) er fortsat udfordrende.
Luftlommer eller bobler udgør en eksperimentel udfordring, der forårsager omfattende signaltab forårsaget af følsomhedsforskelle ved luftens grænseflade og væsken ellerprøven 19 (Figur 5A). Et kritisk aspekt af vellykket prøve forberedelse er nedsænkning af både prøve og kapillær. Men selv små bobler kan forårsage signaltab, især for sekvenser af gradientekkotype. Mobile luftbobler kan migrere gennem kapillæren, indtil de er i kontakt med prøven. Nogle af disse virkninger kan afhjælpes ved lidt vippe kapillær, så den ene ende er højere end den anden. Vippe sikrer potentielle luftbobler holdes på plads i den højere ende, uden at forstyrre prøven. Det er også vigtigt at kontrollere, at kapillær voks danner en god forsegling, da dehydrering kan forårsage store luftbobler til at danne.
For luftrummene inde i prøven blev PFD anvendt til at fylde de intercellulære luftrum, uden at cellemembranerne26 blev gennemtrængende. Men selv med denne tilgang var vi ikke i stand til at fjerne alle luftrum. Derudover betyder denne tilgang, at vi har brug for en ekstra agent, som normalt ikke foretrækkes på grund af ønsket om at studere et system så noninvasively som muligt.
Kapillærernes cylindriske form betyder, at perfusionsopsætninger bør være levedygtige, især for væv, der er sårbare over for forfald, såsom biopsier eller studier af processer i levende rodmateriale. To trin kunne realisere en perfusion setup. For det første ville tilslutning af et medium tilspændingsrør samt et drænrør på hver side af kapillæren være tilstrækkelig til at skabe en kemostat. For det andet kan tilføjelsen af en fordybning i prøvekapillæren holde prøven på plads i forhold til strømningsretningen. Dette svarer til en protokol, der er udgivet for planar mikrokoiler10.
Den noninvasive karakter af MR-billeddannelse kombineret med den inaktive væske, der anvendes i denne protokol (PFD eller Fomblin), betyder, at prøverne efter afslutningen af forsøg kan fjernes fra deres kapillærer til yderligere undersøgelse. Kombinationerne omfatter optisk eller elektronmikroskopi og andre destruktive billedbehandlingsteknikker. Vi har for nylig vist en kombination med optisk mikroskopi på Medicago truncatula rodknuder27.
Vi har demonstreret en metode til billeddannelse plantemateriale ved hjælp af dedikerede mikrospoler på en ultra-høj felt NMR spektrometer. Relativt store prøvemængder kan undersøges ved høj opløsning med god RF-homogenitet. Desuden kan spektroskopisk billeddannelse udføres ved højere opløsninger end ellers muligt. Tilpasning af mikroscoildesign til prøver lettes ved hjælp af en effektiv metode til at bestemme spolens egenskaber. Solenoid coil-tilgangen kan også let anvendes på andre prøver end planter, herunder animalsk væv.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Eksperimenterne med 950 MHz-instrumentet blev støttet af uNMR-NL, en NWO-finansieret national køreplan for storstilet facilitet i Nederlandene (projekt 184.032.207). R.S. blev støttet af BioSolarCells konsortieprojektet U2.3. J.R.K. blev støttet af Hollands Ph.d.-skole (Magnetic Resonance Research School) [022.005.029]. Vi takker Defeng Shen og Ton Bisseling for at levere Medicago truncatula prøver. Vi takker endvidere Klaartje Houben, Marie Renault og Johan van der Zwan for teknisk support på uNMR-NL anlægget. Vi vil også gerne takke Volker Lehmann, Henny Janssen og Pieter de Waard for teknisk hjælp. Vi udtrykker vores taknemmelighed over for Frank Vergeldt, John Philippi og Karthick B. Sai Sankar Gupta for deres råd. Endelig takker vi Jessica de Ruiter for at give voice-over til videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference solution preparation | |||
| CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
| D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
| Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
| Sample preparation | |||
| Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
| Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
| Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
| Syringe | Generic | - | Used to apply PFD and manipulate the sample |
| Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
| Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
| Imaging Hardware | |||
| 22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
| Air cooler | Bruker GmbH | - | Used to regulate probe temperature |
| Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
| Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
| Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
| RF microcoil | Home-built | - | contains Fomblin |
| Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
| Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |
References
- Ciobanu, L., Pennington, C. H. 3D micron-scale MRI of single biological cells. Solid State Nuclear Magnetic Resonance. 25 (1-3), 138-141 (2004).
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Radecki, G., Nargeot, R., Jelescu, I. O., Le Bihan, D., Ciobanu, L. Functional magnetic resonance microscopy at single-cell resolution in Aplysia californica. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8667-8672 (2014).
- Lee, C. H., et al. Magnetic Resonance Microscopy (MRM) of Single Mammalian Myofibers and Myonuclei. Scientific Reports. 7 (1), 39496 (2017).
- Callaghan, P. T. Principles of nuclear magnetic resonance microscopy. , Oxford University Press. Oxford. (1994).
- Glover, P., Mansfield, S. P. Limits to magnetic resonance microscopy. Reports on Progress in Physics. 65 (10), 1489-1511 (2002).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and analysis of microcoils for NMR microscopy. Journal of Magnetic Resonance. Series B. 108, 114-124 (1995).
- Lee, C. H., Flint, J. J., Hansen, B., Blackband, S. J. Investigation of the subcellular architecture of L7 neurons of Aplysia californica using magnetic resonance microscopy (MRM) at 7.8 microns. Scientific Reports. 5, 11147 (2015).
- Fratila, R. M., Velders, A. H. Small-Volume Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Annual Review of Analytical Chemistry. 4 (1), 227-249 (2011).
- Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. Journal of Visualized Experiments. (128), 1-10 (2017).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design. Part I: Optimizing RF homogeneity and coil dimensions. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (2), 128-142 (2001).
- Vegh, V., Gläser, P., Maillet, D., Cowin, G. J., Reutens, D. C. High-field magnetic resonance imaging using solenoid radiofrequency coils. Magnetic Resonance Imaging. 30 (8), 1177-1185 (2012).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design Part II: Optimizing winding parameters for maximum signal-to-noise performance. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (3), 190-210 (2001).
- Haase, A., et al. NMR probeheads for in vivo applications. Concepts in Magnetic Resonance. 12, 361-388 (2000).
- Webb, A. G. Radiofrequency microcoils for magnetic resonance imaging and spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance. 229, 55-66 (2013).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and Analysis of Microcoils for NMR Microscopy. Journal of Magnetic Resonance, Series B. 108 (2), 114-124 (1995).
- Olson, D. L., Peck, T. L., Webb, A. G., Magin, R. L., Sweedler, J. V High-Resolution Microcoil 1H-NMR for Mass-Limited, Nanoliter-Volume Samples. Science. 270 (5244), (1995).
- Oerther, T. Micro Imaging Manual for AV3 Systems. , Bruker Biospin GmbH. Rheinstetten, Germany. (2012).
- Callaghan, P. T. Susceptibility and Diffusion Effects in NMR Microscopy. Encyclopedia of Magnetic Resonance. , (2007).
- Donker, H. C. W., Van As, H., Snijder, H. J., Edzes, H. T. Quantitative 1H-NMR imaging of water in white button mushrooms (Agaricus bisporus). Magnetic Resonance Imaging. 15 (1), 113-121 (1997).
- Tsai, W. T. Environmental property modelling of perfluorodecalin and its implications for environmental fate and hazards. Aerosol and Air Quality Research. 11 (7), 903-907 (2011).
- Keifer, P. A. 90° pulse width calibrations: How to read a pulse width array. Concepts in Magnetic Resonance. 11 (3), 165-180 (1999).
- Vlaardingerbroek, M. T., den Boer, J. A. Magnetic Resonance Imaging: Theory and Practice. , Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 05252-05255 (2003).
- Schenck, J. F. The role of magnetic susceptibility in magnetic resonance imaging: MRI magnetic compatibility of the first and second kinds. Medical Physics. 23 (6), 815-850 (1996).
- Kc, R., Henry, I. D., Park, G. H. J., Aghdasi, A., Raftery, D. New solenoidal microcoil NMR probe using zero-susceptibility wire. Concepts in Magnetic Resonance Part B: Magnetic Resonance Engineering. 37 (1), 13-19 (2010).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- van Schadewijk, R., et al. Magnetic Resonance Microscopy at Cellular Resolution and Localised Spectroscopy of Medicago truncatula at 22.3 Tesla. Scientific Reports. 10 (1), 971 (2020).
