Summary
Präsentiert hier ist ein Protokoll für Pseudomonas aeruginosa Infektion und Phagentherapie Anwendung bei Mukoviszidose (CF) Zebrafisch-Embryonen.
Abstract
Antimikrobielle Resistenzen, eine wichtige Folge diagnostischer Unsicherheit und antimikrobieller Überverschreibung, sind eine zunehmend anerkannte Ursache für schwere Infektionen, Komplikationen und Sterblichkeit weltweit mit enormen Auswirkungen auf unsere Gesellschaft und das Gesundheitssystem. Insbesondere Patienten mit geschwächtem Immunsystem oder bereits bestehenden und chronischen Pathologien, wie Zwiespäitische Fibrose (CF), werden häufigen Antibiotikabehandlungen unterzogen, um die Infektionen mit dem Auftreten und der Diffusion multiresistenter Isolate zu kontrollieren. Daher ist es dringend notwendig, alternative Therapien anzugehen, um bakteriellen Infektionen entgegenzuwirken. Die Verwendung von Bakteriophagen, den natürlichen Feinden von Bakterien, kann eine mögliche Lösung sein. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll beschreibt die Anwendung der Phagentherapie gegen Pseudomonas aeruginosa Infektion bei CF-Zebrafischembryonen. Zebrafisch-Embryonen wurden mit P. aeruginosa infiziert, um zu zeigen, dass die Phagentherapie gegen P. aeruginosa-Infektionen wirksam ist, da sie Dielealität, bakterielle Belastung und pro-entzündliche Immunantwort bei CF-Embryonen reduziert.
Introduction
Phage-Therapie, die Verwendung der natürlichen Feinde von Bakterien, um bakterielle Infektionen zu bekämpfen, gewinnt neues Interesse als bakterielle Resistenz gegen Antibiotika wird weit verbreitet1,2. Diese Therapie, die seit Jahrzehnten in Osteuropa verwendet wird, könnte als eine ergänzende Behandlung von Antibiotika bei der Heilung von Lungeninfektionen bei Patienten mit CF und als mögliche therapeutische Alternative für Patienten mit Bakterien, die gegen alle derzeit verwendeten Antibiotika2 ,,3. Vorteile der Antibiotikatherapie sind, dass sich Bakteriophagen an der Infektionsstelle vermehren, während Antibiotika metabolisiert und aus dem Körper eliminiert werden4,5. In der Tat hat sich die Verabreichung von Cocktails von virulenten Phagen, die in verschiedenen Laboratorien isoliert wurden, bei der Behandlung von Pseudomonas aeruginosa Infektionen in Tiermodellen, die so unterschiedlich sind wie Insekten und Säugetiere, als wirksamerwiesen.,7,8 Die Phage-Therapie war auch in der Lage, die bakterielle Belastung in Mitpfoten von P. aeruginosa und Escherichia coli infizierten Verbrennungswunden in einer randomisierten klinischen Studie zu reduzieren9.
Zebrafische (Danio rerio) hat sich vor kurzem als ein wertvolles Modell zur Untersuchung von Infektionen mit mehreren Krankheitserregern, einschließlich P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus und Burkolderia cepacia12,13. Durch die Mikroinjektion von Bakterien direkt in die Embryo-Blutzirkulation14 ist es einfach, eine systemische Infektion zu etablieren, die durch das angeborene Immunsystem des Zebrafisches entgegengewirkt wird, das evolutionär mit Neutrophilen und Makrophagenähnlichgeneration ähnlich dem menschlichen Pendant konserviert wird. Darüber hinaus fehlt zebrafischembryonen im ersten Lebensmonat die adaptive Immunantwort, was sie zu idealen Modellen für die Untersuchung der angeborenen Immunität macht, die der kritische Abwehrmechanismus bei menschlichen Lungeninfektionenist 15. Zebrafish hat sich vor kurzem als ein leistungsfähiges genetisches Modellsystem herausgebildet, um den CF-Beginn besser zu verstehen und neue pharmakologische Behandlungen zu entwickeln10,16,17. Das CF-Zebrafischmodell von cftr knock-down, das mit Morpholino-Injektion in Zebrafische erzeugt wurde, präsentierte eine gedämpfte Atemausbruchsreaktion und reduzierte Neutrophilenmigration10, während der cftr-Knock-out zu einer beeinträchtigten inneren Organposition und zur Zerstörung der exokrinen Bauchspeicheldrüse führt, einem Phänotyp, der die menschliche Krankheit widerspiegelt16,17. Von größtem Interesse war die Feststellung, dass die bakterielle Belastung von P. aeruginosa bei cftr-Funktionsverlust-Embryonen signifikant höher war als bei Kontrollen nach 8 Stunden nach der Infektion (hpi), was den Ergebnissen von Mäusen und menschlichen Bronchialepithelzellen2,18entspricht. cftr
In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Phagentherapie gegen P. aeruginosa Infektionen in Zebrafischembryonen wirksam ist.
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Protocol
Erwachsene Zebrafische (Danio rerio) aus dem AB-Stamm (European Zebrafish Resource Center EZRC) werden gemäß internationalen (EU-Richtlinie 2010/63/EU) und nationalen Richtlinien (italienisches Dekret vom4. März 2014, Nr. 26) über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, gepflegt. Die Standardbedingungen werden in der Fischanlage mit einem 14 h Licht/10 h-Dunkelzyklus und einer Tankwassertemperatur bei 28° C festgelegt.
1. Vorbereitung von Lösungen und Werkzeugen
- Vorbereitung einer 50-fachen Bestandslösung und 1x Arbeitslösungen für E3-Embryomedium für den Anbau von Zebrafischembryonen (siehe Tabelle 1).
- Pigmentierungsblockungslösung herstellen, um die Embryopigmentierung ab 24 Stunden nach der Befruchtung zu blockieren (24 hpf) (siehe Tabelle 1).
- Bereiten Sie 25x Lager und 1x arbeitende Tricane Anästhesielösung vor, wie in Tabelle 1beschrieben.
HINWEIS: Um das wiederholte Einfrieren und Auftauen der Lösung zu vermeiden, die die Stammlösung beschädigen könnte, machen Sie Aliquots von 2 ml 25x Tricain eund bei -20 °C. - Bereiten Sie Spuren für die Embryo-Mikroinjektion vor, indem Sie 1 g Agarose in 100 ml destilliertemH2O in einem mikrowavablen Kolben oder einer Flasche auflösen. Mikrowelle für 1-3 min, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
- Positionieren Sie Zebrafisch-Mikrospritzformen (siehe Materialtabelle)auf den Kopf gestellt in einer Petrischale (90 mm x 15 mm) und bedecken Sie die gesamte Oberfläche, indem Sie das flüssige Agarosegel mit einer Breite von ca. 10 mm gießen.
- Entfernen Sie die Form, sobald die Agarose verfestigt ist. Füllen Sie die Petrischale mit 1x E3 Embryo Medium. Diese kann bei 4 °C ca. eine Woche gelagert werden. Vor gebrauchen durch das frische E3-Medium, das Tricain enthält, ersetzen.
HINWEIS: Ältere Schimmelpilze können Pilze oder bakterielle Verunreinigungen entwickeln. - Verwenden Sie feuerpolierte 10 cm Borosilikatkapillaren, um Nadeln für die Mikroinjektion vorzubereiten und sie durch Anziehen der Griffe am Mikropipette-Zieher zu befestigen. Stellen Sie den Abzieher mit den folgenden Einstellungen ein: Hitze 500, Geschwindigkeit 100, Zeit 150, Ziehen 150.
2. P. aeruginosa (PAO1) Inokulumzubereitung
- Impfen 1 Kolonie von GFP+P. aeruginosa Stamm PAO119 in 5 ml LB Brühe (siehe Tabelle 1) und wachsen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln (200 U/min).
- Verdünnen Sie die oben genannte Nachtkultur auf OD600 = 0,1 in 10 ml LB-Brühe und wachsen Sie mit Schütteln (200 Rpm) auf OD600 = 0,5 bei 37 °C an.
- Zentrifuge 2 ml der Kultur für 2 min bei 4 °C bei 16.100 x g und das Zellpellet auf OD600 = 1, was etwa 1 x 109 cfu/ml entspricht, in 1 ml der physiologischen Lösung (siehe Tabelle 1).
- Die Zellsuspension in physiologischer Lösung auf ca. 5 x 107cfu/ml verdünnen und bei 4 °C lagern.
3. Phage Stockvorbereitung
- 1 Kolonie von P. aeruginosa Stamm PAO1 in 5 ml LB Brühe impfen und über Nacht bei 37 °C mit Schütteln inkubieren. Die Nachtkultur auf OD600 = 0,01 in 500 ml LB-Brühe verdünnen und bei 37 °C mit Schütteln auf OD600 = 0,05 wachsen, was etwa 2,5 x 107 cfu/ml entspricht.
- Zur verdünnten Kultur von P. aeruginosa, fügen Sie etwa 1,25 x 107 Phagen, um die Vielzahl der Infektion (M.O.I.) von 10-3zu erhalten. Bei 37 °C mit Schütteln bebrüten, bis der OD600 auf etwa 0,1-0,3 sinkt (je nach verwendetem Phagen in etwa 3 bis 5 h).
HINWEIS: Für dieses Experiment wurden vier Phagen ausgewählt, die den PAO1-Stamm infizieren: Zwei Podoviridae, GenBank-Beitrittsnummern vB_PaeP_PYO2, MF490236 und vB_PaeP_DEV, MF490238, sowie zwei Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 und vB_PaeM_E217, MF490240. Führen Sie die folgenden Schritte für jeden Phagen einzeln aus. - Das Lysat mit 1 mg/ml DNase und RNase 30 min bei 37 °C inkubieren. Zentrifuge bei 5.000 x g für 30 min bei 4 °C und vorsichtig den Überstand (SN) wiederherstellen. Filtern Sie den SN mit einem Filter mit einem Porendurchmesser von 0,8 m.
- Zum SN 58 g/L Von NaCl und 105 g/L PEG6000 hinzufügen. Unter Rühren bei RT 20 min auflösen und dann über Nacht bei 4 °C aufbewahren. Zentrifuge bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C bei Phagenniederschlag. Entfernen Sie den SN und lösen Sie das Phagenpellet vorsichtig in 15 ml TN-Puffer auf (siehe Tabelle 1).
- Reinigen Sie die Phagen mit CsCl Dichtegradienten, wie in den schritten unten beschrieben.
- In einem Polyallomer Ultrazentrifugenrohre für SW41 Rotor, bereiten Sie einen CsCl Schrittdichtegradientdurchfall durch Schichtung 2 ml der vier CsCl-Lösungen in Tabelle 1beschrieben . Fügen Sie 3,5 ml Phagenaufhängung in jedem der 4 Rohre hinzu.
HINWEIS: CsCl ist giftig, nehmen Sie geeignete Sicherheitsverfahren an, um es zu behandeln und zu entsorgen. - Führen Sie die Rohre in den Rotor ein und stellen Sie sicher, dass die Rohre ausgeglichen sind (der Gewichtsunterschied zwischen den beiden gegenüberliegenden Rohren muss ≤ 0,01 g betragen).
- Zentrifuge für 2 h bei 4 °C und 100, 000 x g (25.000 U/min für SW41 Rotor). Nach der Zentrifugation, entfernen Sie langsam die Rohre und vorsichtig immobilisieren Sie sie auf einem Träger. Zeichnen Sie mit einer Spritze mit 19 G Nadel das weiß/opaleszierende Band auf, das sich normalerweise zwischen dem dichte bereich d=1.5 und dem d=1.4 Dichtebereich befindet.
- Übertragen Sie die Suspensionen von der Spritze in neue Polyallomerrohre für den SW60-Rotor und verwenden Sie die d=1.4-Lösung, um die Rohre präzise auszugleichen.
- Zentrifugieren Sie die Federung bei 4 °C und 150.0000 x g (38.000 U/min für den SW60-Rotor) für mindestens 16 h.
- Sammeln Sie das sichtbare Band wie oben (siehe Schritt 3.3.3) und übertragen Sie es in Dialyseröhren mit 6.000 Da Cut-off. Dialyse das erhaltene sichtbare Band 2x für 20 min gegen 500 ml Wasser und über Nacht gegen 500 ml TN Puffer. Mit einem 0,22 m Porenfilter filtern und bei 4 °C lagern.
- In einem Polyallomer Ultrazentrifugenrohre für SW41 Rotor, bereiten Sie einen CsCl Schrittdichtegradientdurchfall durch Schichtung 2 ml der vier CsCl-Lösungen in Tabelle 1beschrieben . Fügen Sie 3,5 ml Phagenaufhängung in jedem der 4 Rohre hinzu.
4. Phage-Cocktail-Zubereitung
- Machen Sie eine Mischung aus vier Phagen, die den Stamm PAO1 infizieren, zuvor isoliert und charakterisiert8. Vor dem Mischen, schätzen Sie den Titer jedes Phagenbestands durch Plaque-Assay20.
- Montieren Sie den Phagencocktail mit einem Gesamttiter von 5 × 108 pfu/ml, indem Sie gleich vier Phagenpräparate an derselben pfu/mL unmittelbar vor jedem Experiment mischen, um genaue Phagen-Titer zu gewährleisten.
5. Sammlung und Herstellung von Zebrafischembryonen zur cftr morpholinos Mikroinjektion
HINWEIS: Sammeln Sie 1-2 Zellembryonen von wildlebenden Zebrafischen für cftr morpholinos (cftr-MOs) Mikroinjektion.
- Zwei Tage vor dem bakteriellen Mikroinjektionsexperiment, richten Sie Brutpaare ein und sammeln Embryonen, wie zuvor beschrieben21. Erwachsene Zebrafische (Danio rerio) der AB-Sorte wurden vom European Zebrafish Resource Center, EZRC, gekauft.
- Am Tag danach die Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung mit einer Plastikpipette oder mit einem Feinnetzsieb sammeln. Legen Sie die gesammelten Embryonen in eine Petrischale, die E3-Embryomedium enthält, und entfernen Sie vorsichtig den Schmutz mit einer Plastikpipette, um eine Kontamination zu vermeiden, die die Embryoentwicklung beeinträchtigen könnte.
- Bereiten Sie 5 l Morpholino-Injektionslösung vor, indem Sie die beiden Morpholino-Stammlösungen (1 mM) in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,25 pmol/embryo ATG-MO + 0,25 pmol/embryo splice-MO verdünnen. Um die Embryo-Injektion nachzuverfolgen, fügen Sie dem Morpholino-Injektionslösungsmix 0,5 l Phenolrot hinzu.
- Laden Sie eine Mikroinjektionsnadel mit ca. 5 l der Morpholino-Mischlösung mit einer 20-L-Mikropipette mit feiner Gel-Ladespitze. Befesten Sie die Nadel am Mikromanipulator, der mit einem Ständer verbunden ist, und positionieren Sie sie unter einem Stereomikroskop.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, dass die Lösung die Spitze der Nadel erreicht, da der Druck der Mikroinjektorpumpe sie drückt. - Clip aus der Spitze der Nadel durch Schneiden der Nadelspitze mit feiner steriler Pinzette. Messen Sie den Durchmesser des Tropfens mit einem Skalenbalken im Okular des Mikroskops. Alternativ können Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerschlitten werfen und das Mikroinjektionsvolumen einstellen, indem Sie die Lösung in den Öltropfen injizieren, um die Tröpfchengröße zu bewerten. Verwenden Sie einen Tropfen mit einem Durchmesser von 156 m, um ein Volumen von 2 nL zu injizieren.
- Stellen Sie den Mikroinjektor ein, indem Sie den Kompensationsdruck auf 15 hPa, die Einspritzzeit auf 0,5 s und den Injektionsdruck zwischen 300 und 600 hPa einstellen, um je nach verwendeter Nadel das richtige Injektionsvolumen zu erhalten.
- Mit einer Kunststoffpipette ordnen Sie die Embryonen von Schritt 5.2 auf ein Glas in einer Petrischale mit 96 mm Durchmesser an.
HINWEIS: Zu viel E3-Medium verhindert das richtige Eindringen der Mikroinjektionsnadel in die Chorion der Embryonen. - Durchdringen Sie die Chorion und dann das Eigelb mit der Nadel, um 2 nL in den Embryo zu injizieren, wie zuvor beschrieben22.
- Injizierende Embryonen in eine Petrischale mit E3-Medium geben und bei 28 °C in einen Inkubator geben, damit sie sich bis zum Tag danach entwickeln können.
6. Mikroinjektion von Zebrafischembryonen mit Bakterien und Phagencocktail
HINWEIS: Um eine systemische Infektion durchzuführen, muss der Embryo eine Durchblutung haben, die in der Regel nach 26 hpf beginnt.
- Nach 26 hpf (für Zebrafisch-Entwicklungsstadien beziehen sich auf Kimmel21) dechoronatische Embryonen mit Pronaselösung, die durch Auflösen von Pronasepulver in E3-Medium in einer Konzentration von 2 mg/ml hergestellt werden. Die Embryonen werden vorsichtig pipette, um die Chorion zu brechen. Entsorgen Sie das Pronase/E3-Medium und spülen Sie das Gericht mehrmals mit frischem E3 ab, um alle Pronase zu entfernen.
- Anästhetisieren Zebrafisch-Embryonen in E3-Medium, das Tricain ca. 5 min vor injektionn enthält.
- Pipette die anästhesierten Embryonen in die Spur in Schritt 1 vorbereitet. Verwenden Sie eine feine Gel-Ladespitze, um die Embryonen in der seitlichen Position zu säumen.
- Laden Sie eine Mikroinjektionsnadel mit ca. 5 l des P. aeruginosa Präparats, wie in Teil 5 beschrieben.
- Setzen Sie die Nadel dorsal an den Ausgangspunkt des Kanals von Cuvier, wo sie beginnt, sich über den Dottersack auszubreiten. Injizieren Sie ein Volumen von 1-3 nL und stellen Sie sicher, dass sich das Volumen direkt innerhalb des Kanals ausdehnt und in den Kreislauf gelangt.
- Etwa nach jedem 50 injizierten Embryo injizieren Sie einen Tropfen der Bakterien in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr mit 100 l sterilem PBS, um zu überprüfen, ob das Injektionsvolumen gleich bleibt. Das Inokulum auf LB-Agar (siehe Tabelle 1) über Nacht bei 37 °C verbuchen, um die KBE zu bewerten.
- Die mikroinjizierten Embryonen in zwei saubere Petrischalen mit frischem E3-Medium + PTU übertragen und bei 28 °C inkubieren.
- An zwei ausgewählten Zeitpunkten: 30 min oder 3 h nach der bakteriellen Injektion, nehmen Sie eine der Petri-Schalen mit bakteriellen Embryonen aus dem Brutkasten heraus und richten Sie sie in der Spur aus, wie in 6.3 für die Phagencocktail-Injektion beschrieben.
- Eine Mikroinjektionsnadel mit ca. 5 l des Phagencocktails (in Schritt 4) mit einer feinen Gelladespitze aufladen und am Mikroinjektor fixieren (siehe Schritt 5).
- Injizieren Sie den Phagencocktail in den Kanal von Cuvier der Embryonen, die zuvor mit Bakterien injiziert wurden.
- Die mikroinjizierten Embryonen in zwei saubere Petrischalen mit frischem E3-Medium + PTU übertragen und bei 28 °C inkubieren.
7. Bewertung der bakteriellen Belastung von Embryonen, die mit PAO1 und Phagen injiziert werden
- Bei 8 PSi, Pipette 15 beästheten Embryonen von der Petrischale zu einem 1,5 ml Zentrifugenrohr.
- Ersetzen Sie die Anästhesielösung durch 300 L von 1% Triton X-100 in PBS (PBSTritonX) und homogenisieren Sie die Embryonen, indem Sie sie mindestens 15x durch eine Insulinspritze mit einer sterilen 27-G-Nadel übergeben.
- Vorbereiten Sie serielle Verdünnungen von Homogenaten in sterilen PBS, indem Sie 100 l des verdünnten Homogenats in 900 l steriles PBS übertragen.
- Zur Auswahl für den natürlich amperbfesten PAO1-Stamm, Platte 100 l der Verdünnungen auf LB-Agar mit Ampicillin (100 g/ml) zugesetzt und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Am Tag danach zählen Sie die Anzahl der Kolonien, multiplizieren Sie mit dem Verdünnungsfaktor, um die Gesamtzahl der KBE zu bestimmen, und dividieren Sie durch die Anzahl der Embryonen, die homogenisiert wurden, um die durchschnittliche Anzahl von KBE/infizierten Embryonen zu erhalten.
8. Bewertung der Letalität von Embryonen, die mit PAO1 und Phagen injiziert werden
- Um die Tödlichkeit der PAO1-Infektion zu bewerten, bewerten Sie die injizierten Embryonen mit 20 PSi unter einem Stereomikroskop und zählen Sie für die toten Embryonen (weiß/nicht transparent).
- Berechnen Sie die halbmaximale tödliche Konzentration 50 (LD50) Dosis von PAO1, die den Tod von 50% der injizierten Embryonen bei 20 hpf bestimmt.
9. Embryo-Vorbereitung für Stereomikroskop-Zeitraffer-Bildgebung der GFP+ PAO1-Infektion
- Präatolieren Sie die Form für die Live-Embryo-Bildgebung, indem Sie 1,5% niedrigschmelzende Agarose in 100 ml E3-Lösung auflösen.
- Fügen Sie 1% Tricaine (siehe Tabelle 1) hinzu, um die Embryonen zu beästhesieren.
- Bei 4 PSi einen Embryo mit einer Kunststoffpipette in eine Glasbodenschale übertragen und die warme Agaroselösung mit niedrigem Schmelzpunkt hinzufügen.
- Positionieren Sie die Glasbodenschale unter einem Stereomikroskop und positionieren Sie den Embryo mit einer Spitze in der gewünschten Ausrichtung. Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um vorsichtig einen Tropfen Agarose auf den Embryo hinzuzufügen.
- Lassen Sie die Agarose 5-10 min abkühlen und füllen Sie die Glasbodenschale vorsichtig mit E3, das die Anästhesielösung enthält, um den Embryo feucht zu halten.
- Legen Sie die Glasbodenschale mit dem Embryo unter das fluoreszierende Stereomikroskop mit einem Fluoreszenzfilter (Kanal 488 nm) für GFP+ Bakterien. Entfernen Sie die Petrischale erst nach weiteren Anschaffungen mit den gleichen Parametern bei 9, 14 und 18 PSi.
10. Expressionsanalysen von proinflammatorischen Zytokinen
- Bei 20 PS i die Embryonen mit Tricain 1x Lösung ansiebeund von der Petrischale in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen.
- Entfernen Sie unter einer Dunstabzugshaube die Anästhesielösung und ersetzen Sie sie durch 200 L Guanidiumhydrochlorid-Reagenz.
- Homogenisieren Sie Embryonen, indem Sie sie zunächst wiederholt durch eine 200-L-Pipette und dann mindestens 15x mit einer Insulinspritze mit einer sterilen 27 G Nadel pipetieren.
- Extrahieren Sie die gesamte RNA aus homogenisierten Zebrafischembryonen unter Verwendung eines handelsüblichen Guanidiumhydrochlorid-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Behandeln Sie 1 g jeder RNA-Probe mit 2 l/l DNase I (RNase-frei) nach den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie 1 g DNase I-behandelte RNA für die Reverse-Transkriptionsreaktion (RT) mit handelsüblichem Kit (siehe Tabelle der Materialien), in einem Gesamtvolumen von 20 l gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Führen Sie die RT qPCR-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 10 l mit 1x SYBR Green Mastermix unter Verwendung von 1,5 l einer 1:6-Verdünnung der RT-Reaktion durch. Verwenden Sie für die Normalisierung die Primer für die Haushaltungsgene rpl8 und für pro-inflammatorische Zytokine, verwenden Sie Primer für TNF-α und IL-1" (siehe Tabelle 2). qPCR-Protokoll war: Zyklus 1 Schritt 1: 95 °C, 2 min, einmal wiederholen; Zyklus 2: Schritt 1 95 °C, 10 s, Schritt 2 55 °C, 30 s, 40x wiederholen; Zyklus 3: Schritt 1 72 °C, 15 Min.
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Representative Results
Die hier vorgestellten Ergebnisse und Zahlen beziehen sich auf CF-Embryonen, die durch injektion von cftr morpholinos erzeugt wurden, wie zuvorbeschrieben 10 und in Schritt 5. Zur Validierung des CF-Phänotyps wurde die eingeschränkte Position der inneren Organe wie Herz, Leber und Bauchspeicheldrüse, wie zuvor beschrieben17 (Abbildung 1) berücksichtigt. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den WT-Embryonen erzielt, wie in unserer vorherigen Publikation19berichtet.
Die bakterielle Belastung wurde durch phagentherapie bei MIT PAO1 infizierten CF-Embryonen verringert. Darüber hinaus haben wir die bakterielle Belastung bei 8 PSi durch Homogenisierung von Gruppen von 15 Embryonen bewertet: Die durchschnittliche Anzahl der Bakterien (cfu/embryo) in den PAO1-infizierten Embryonen wurde nach der Phagenbehandlung auf etwa 20 % reduziert und bestätigte damit eine weniger schwere Infektion in Gegenwart des Phagencocktails (Abbildung 2).
Die Letalität wurde durch Phagentherapie bei CF-Embryonen reduziert, die mit GFP+ Bakterien PAO1 infiziert waren. CF-Zebrafischembryonen mit 48 pspf wurden mit GFP+ Bakterien des PAO1-Stamms in einer Dosis injiziert, die 50% Letalität nach 20 PSi verursachte (30 cfu/embryo, Abbildung 3A). Die Injektionsstelle war das Eigelb oder der Kanal von Cuvier, um eine systemische Infektion zu erzeugen. Die Phage-Therapie gegen paO1-Infektionen wurde durch Injektion von 2 nL des ebenfalls gemischten Phagencocktails (300-500 pfu/embryo) getestet. Die Injektion wurde zu zwei verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt: 30 min (früh) und 7 Stunden (spät) nach bakterieller Injektion. In beiden Fällen wurde die Letalität mit 20 PSi reduziert, was darauf hindeutet, dass die Phagentherapie wirksam ist (Abbildung 3B).
Mit Live-Bildgebung, mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop, verfolgten wir auch das Fortschreiten der Infektion in CF-Embryonen, die mit GFP+ PAO1 injiziert wurden, und zeigten die Wirksamkeit der Phagentherapie bei der Verringerung der Ausbreitung fluoreszierender Bakterien über den Dottersack. Der CF+PAO1-injizierte Embryo mit GFP+-Bakterienmultiplikation bei 4, 9, 14 und 18 PSi ist in der oberen Seite von Abbildung 4dargestellt, während der CF+PAO1+phagen-Embryo mit reduzierter Fluoreszenz durch Phagenwirkung gegen Bakterien im unteren Teil dargestellt ist (Abbildung 4).
Die Phage-Therapie reduzierte die entzündliche Reaktion, die durch eine PAO1-Infektion bei CF-Embryonen erzeugt wurde. Wir haben auch die Immunantwort von PAO1 und PAO1 + Phagen-Injektion auf 8 PSi bewertet. Wie erwartet wurde die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine TNF-a und IL-1, die mit qPCR-Techniken analysiert wurden, nach der PAO1-Injektion im Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöht, während sie mit der Co-Injektion des Phagencocktails reduziert wurde (Abbildung 5A,B).
Abbildung 1: Erzeugung und Validierung von CF-Embryonen bei cftr morpholinos(cftr-MOs) Injektion. (A) Eingeschränkte Position und Schleifen des Herzens in CF-injizierten Embryonen im Vergleich zu Wildtyp-Embryonen (WT). Das Herz wird mit cmlc2-Ausdruck durch In-situ-Hybridisierungstechnikvisualisiert. (B) Eingeschränkte Position der Leber (Pfeile) und Bauchspeicheldrüse in CF-Embryonen im Vergleich zu WT. Leber und Bauchspeicheldrüse werden mit Prox1a-Expression durch In-situ-Hybridisierungstechniken visualisiert. Skalenbalken zeigen 100 m an. liv: Leber; p: Bauchspeicheldrüse. Die Abbildung wird von19nachgedruckt Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bakterielle Belastung in CF-Embryonen, die mit PAO1 oder PAO1+phagen infiziertsind. Der relative Prozentsatz von cfu/embryo in PAO1+phagen vs PAO1 Embryonen wird angegeben. Der Mittelwert und die SD von drei unabhängigen Experimenten werden berichtet. Die Figur wird ab19nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Tödlichkeit von CF-Zebrafischembryonen, die mit PAO1 und PAO1+phagen infiziert sind. (A) Bestimmung von LD50 in 48 hpf Zebrafischembryonen, die mit cftr-MO im 1-Zell-Stadium (CF-Embryonen) mikroinjiziert und bei 48 hpf mit 2 nL einer PAO1-Kultur mit einer zunehmenden Anzahl von Bakterien (cfu/embryo) infiziert wurden. Die Letalität der Embryonen wurde bei 20 PSi beobachtet. (B) Tödlichkeit bei 20 PSi CF-Embryonen, die mit PAO1 bei 48 hpf infiziert und mit dem Phagencocktail behandelt werden (PAO1+ ). Der Mittlere und SD berichtet werden aus sechs und vier Experimente, jeweils mit 25-40 Embryonen. Die Winkeltransformation wurde auf den Prozentsatz der Letalität angewendet und es wurde eine einseitige ANOVA verwendet, gefolgt von Duncans Test. Die Figur wird ab19nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Abbildung der Wirksamkeit der Phagentherapie bei Zebrafischen. Fortschreiten der Infektion in CF-Embryonen nach PAO1-Injektion (Oberembryon) und Wirksamkeit der Phagentherapie bei PAO1+phagen injizierten Embryonen (unterer Embryo) bei 4, 9, 14 und 18 PSi. Die Maßstabsleiste zeigt 100 Mikrometer an. Die Figur wird ab19nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Expression von pro- und entzündungshemmenden Zytokinen nach PAO1- und PAO+Phagen-Verabreichung. Expressionsniveaus der TNF-a (A) und IL-1"-Gene, gemessen mit RT-qPCR bei 8 PSi in CF-Embryonen, die mit PAO1 und PAO1+-0 bei 48 hpf injiziert und mit der Expression von rpl8normalisiert wurden. Der Mittelwert und die SD von vier Experimenten werden berichtet. Die statistische Signifikanz wurde von ANOVA bewertet, gefolgt von Duncans Test: für TNF- a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,015*; (CF) vs.(CF+PAO1+) p = 0,019*; (CF+PAO1) vs.(CF+PAO1+ ) p = 0,77 n.s.; für IL-1 (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,00014***; (CF) vs.(CF+PAO1+ ) p = 0,00068***; (CF+PAO1) vs.(CF+PAO1+ ) p = 0,031*. Die Figur wird ab19nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösungen | Vorbereitung |
| Anästhesie-Stammlösung 25X | 4 mg/ml Tricain in destilliertemH2O. |
| Anästhesie-Arbeitslösung 1X | in destilliertemH2O die Tricain-Stammlösung 25X-Präparat verdünnen, um die 1X-Konzentration (0,16 mg/ml) Tricain edestilliertH2O zu erreichen. |
| CsCl d=1,3 | 20,49 g in 50 ml TN |
| CsCl d=1,4 | 20,28 g in 50 ml TN |
| CsCl d=1,5 | 34,13 g in 50 ml TN |
| CsCl d=1,6 | 41,2 g in 50 ml TN |
| E3-Embryomedium für Zebrafisch-Embryo | 1 L 1von E3 (verdünnen Sie den 50X Vorrat mit destilliertem H2O) + 200 l von 0,05% Methylblau . Bei RT aufbewahren. |
| E3 Embryo Mittelstocklösung (50X) | 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl , 9,15 g CaCl2 und 9,95 g MgSO4 in 5 L destillierth H2O. Bei RT lagern. |
| LB-Agar | 10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 10 g/L Agar |
| LB-Brühe | für 1L: 950 mL H2O, 10 g Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt |
| PBST | PBS 1X + Triton X 1% |
| Physiologische Lösung | 0,9% NaCl |
| Pigmentierung sperrt Stammlösung 10X | 0,3 mg/ml Phenylthiourea (PTU) Pulver in E3-Embryomedium für Zebrafisch-Embryo |
| Pronase-Lagerlösung 5X | 5 mg/ml Pronasepulver im E3-Embryomedium für Zebrafisch-Embryo |
| TN-Puffer | 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl |
Tabelle 1: Vorbereitung von Lösungen.
| Genname | Primer-Sequenz |
| TNF-alpha Fw | 5'-TGCGCGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha Rev | 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAAGG-3' |
| IL1-beta Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCACAAAATG-3' |
| IL1-beta Rev | 5'-CGTTCACTTCACGCTCTTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 Rev | 5'-TCCTTCACGATCCCCTTGAT-3' |
Tabelle 2: Für RT-qPCR verwendete Primer.
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Discussion
In diesem Manuskript beschrieben wir das Protokoll zur Durchführung einer P. aeruginosa (PAO1) Infektion bei Zebrafischembryonen und wie man eine Phagentherapie mit einem Cocktail von Phagen anwenden kann, der zuvor als in der Lage identifiziert wurde, PAO1 zu infizieren, um es zu lösen. Die Verwendung von Bakteriophagen als Alternative zu Antibiotikabehandlungen ist seit einigen Jahren von wachsendem Interesse. Dies ist hauptsächlich auf die Verbreitung multiresistenter (MDR) bakterieller Infektionen zurückzuführen, die ein ernstes Problem für die öffentliche Gesundheit darstellen. Natürlich beschränkt sich der Umfang dieser Arbeit auf die Anwendung der Phagentherapie auf ein Tiermodell und nicht auf den Menschen. Wir haben jedoch ein Mukoviszidose-Zebrafischmodell mit der Injektion eines Morpholinos erzeugt, der auf das cftr-Gen abzielt, was die Wirksamkeit der Phagentherapie auch in einem pathogenetischen Modell demonstriert, das besonders anfällig für Eine P.aeruginosa-Infektion ist.
Es ist zu beachten, dass wir leicht phagentherapie erreichen könnten, wie in einer früheren Arbeit, isoliert und charakterisiert verschiedene Phagen in der Lage, P. aeruginosa sowohl in vitro und in vivo8zu infizieren. Dieser Schritt ist von grundlegender Bedeutung, um die antimikrobielle Aktivität der Phagen zu erhalten. Die Isolierung und Charakterisierung von Phagen, die in der Lage sind, einen bestimmten Bakterienstamm zu infizieren, sind kritische Schritte der PhagentherapieAnwendung. Um nachteilige Auswirkungen von Phagen auf den tierischen/menschlichen Wirt zu vermeiden, ist es notwendig, lytische Phagen anstelle dieser lysogene zu verwenden. Am wichtigsten ist, dass es notwendig ist, die Phagengenome auf das Vorhandensein schädlicher Gene wie die auf Antibiotikaresistenz, Virulenz und Gentransfer zu überprüfen.
Die Phage-Therapie wurde bereits erfolgreich in anderen Tiermodellen eingesetzt. Wir sind uns bewusst, dass Zebrafische kein Säugetiermodell sind und einige Auswirkungen von Phagen möglicherweise anders sind. Da Zebrafische jedoch ein angeborenes Immunsystem besitzen, das mit dem menschlichen mit einer konservierten Population von Neutrophilen und Makrophagen23vergleichbar ist, spekulieren wir, dass die Daten über die Immunantwort beim Menschen reproduzierbar sein könnten. Darüber hinaus ist Zebrafisch gut für bakterielle Infektionsstudien bewertet, seine Verwendung als Tester für Phagentherapie Wirksamkeit könnte vielversprechend für therapeutische Ansätze sein. Tatsächlich kann die Infektion systemisch sein, wenn Bakterien durch den Kanal von Cuvier in den Kreislauf injiziert oder lokalisiert werden, wie berichtet17. Wir führten sowohl systemische als auch lokalisierte Infektionen durch und zeigten, dass sie in ähnlicher Weise erhöhte Letalität und bakterielle Belastung erzeugten, die beide nach der Anwendung einer Phagentherapie verringert wurden. Da GFP+ fluoreszierende PAO1-Bakterien injiziert wurden, war es außerdem einfach, die Infektion zu verschiedenen Zeitpunkten der Embryoentwicklung zu verfolgen, was die Reduktion fluoreszierender Bakterien bei der Injektion von Phagen bestätigte.
Unserer Kenntnis nach ist dies die erste Beschreibung der Phagentherapie Anwendung bei Zebrafischen, mit dem Mehrwert für den Nachweis von Phagen antimikrobielle Aktivität gegen P. aeruginosa in einem CF-Hintergrund, die besonders anfällig für diese bakterielle Infektion ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der italienischen Cystic Fibrosis Foundation (FFC-22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo und FFC-23/2019; Un respiro in pié Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
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