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Immunology and Infection

सिस्टिक फाइब्रोसिस ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा संक्रमण का प्रतिकार करने के लिए फेज थेरेपी आवेदन

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61275
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3, 2
1Dipartimento di Scienze Cliniche e Comunità, Università degli Studi di Milano, 2Dipartimento di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, Università degli Studi di Milano, LITA, 3Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi di Milano

Summary

यहां प्रस्तुत सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) जेब्राफिश भ्रूण में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा संक्रमण और फेज थेरेपी आवेदन के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Abstract

रोगाणुरोधी प्रतिरोध, नैदानिक अनिश्चितता और रोगाणुरोधी अतिप्रिस्क्रिप्शन का एक प्रमुख परिणाम है, हमारे समाज और स्वास्थ्य प्रणाली पर एक बड़ा प्रभाव के साथ दुनिया भर में गंभीर संक्रमण, जटिलताओं और मृत्यु दर का एक तेजी से मान्यता प्राप्त कारण है। विशेष रूप से, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) जैसे छेड़छाड़ प्रतिरक्षा प्रणालियों या पूर्व-मौजूदा और पुरानी विकृतियों वाले रोगियों को मल्टीड्रग प्रतिरोधी आइसोले की उपस्थिति और प्रसार के साथ संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए लगातार एंटीबायोटिक उपचार के अधीन किया जाता है। इसलिए, जीवाणु संक्रमण का प्रतिकार करने के लिए वैकल्पिक उपचारों को संबोधित करने की तत्काल आवश्यकता है । बैक्टीरियोफेज का उपयोग, बैक्टीरिया के प्राकृतिक दुश्मन, एक संभावित समाधान हो सकता है। इस काम में विस्तृत प्रोटोकॉल सीएफ जेब्राफिश भ्रूण में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा संक्रमण के खिलाफ फाज थेरेपी के आवेदन का वर्णन करता है। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण पी एरुगिनोसा से संक्रमित थे ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि फेज थेरेपी पी एरुगिनोसा संक्रमणों के खिलाफ प्रभावी है क्योंकि यह सीएफ भ्रूण में घातकता, बैक्टीरियल बोझ और समर्थक भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करता है।

Introduction

फेज थेरेपी, बैक्टीरिया संक्रमण से लड़ने के लिए बैक्टीरिया के प्राकृतिक दुश्मनों का उपयोग, एंटीबायोटिक दवाओं के लिए जीवाणु प्रतिरोध के रूप में नए सिरे से रुचि जुटाने है1,,2। पूर्वी यूरोप में दशकों से उपयोग की जाने वाली इस चिकित्सा को सीएफ के रोगियों में फेफड़ों के संक्रमण के इलाज में एंटीबायोटिक दवाओं के लिए एक पूरक उपचार माना जा सकता है और बैक्टीरिया से संक्रमित रोगियों के लिए एक संभावित चिकित्सीय विकल्प माना जा सकता है जो वर्तमान में उपयोग एंटीबायोटिक दवाओं में सभी के लिए प्रतिरोधी हैं2,,3। एंटीबायोटिक थेरेपी के फायदे यह हैं कि बैक्टीरियोफेज संक्रमण स्थल पर गुणा करते हैं, जबकि एंटीबायोटिक्स मेटाबोलाइज्ड होते हैं और शरीर से समाप्त हो जाते हैं4,,5। दरअसल , विभिन्न प्रयोगशालाओं में अलग - थलग पड़े उग्र फैज के कॉकटेल का प्रशासन पशु मॉडलों में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा संक्रमण को कीटों और स्तनधारियोंके,7,रूप में अलग करने में कारगर साबित हुआहै। फेज थेरेपी को भी दिखाया गया कि पी एरुगिनोसा और एस्चेरिचिया कोलाई से संक्रमित जले घावों में बैक्टीरियल बोझ को कम करने में सक्षम होनाचाहिए।

जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)हाल ही में पी एरुगिनोसा10, 11, माइकोबैक्टीरियम फोड़ा और बर्कोल्डेरिया सेपैसिया,12,,13सहित कई रोगजनकों के साथ संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप मेंउभराहै। बैक्टीरिया को सीधे भ्रूण रक्त परिसंचरण में माइक्रोजेक्ट करके14 एक प्रणालीगत संक्रमण स्थापित करना आसान है जो जेब्राफिश जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा प्रतिकार किया जाता है, जो मानव समकक्ष के समान न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज पीढ़ी के साथ संरक्षित विकासवादी है। इसके अलावा, जीवन के पहले महीने के दौरान, जेब्राफिश भ्रूण में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की कमी होती है, जिससे उन्हें जन्मजात प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए आदर्श मॉडल बनाया जाता है, जो मानव फेफड़ों के संक्रमण15में महत्वपूर्ण रक्षा तंत्र है। जेब्राफिश हाल ही में सीएफ की शुरुआत को बेहतर ढंग से समझने और 10 , 16,17को नए औषधीय उपचार विकसित करने के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल प्रणाली के रूप में16,उभरा। जेब्राफिश में मॉर्फोलिनो इंजेक्शन के साथ उत्पन्न सीएफटीआर नॉक-डाउन के सीएफ जेब्राफिश मॉडल ने एक गीला श्वसन फट प्रतिक्रिया और कम न्यूट्रोफिल माइग्रेशन10प्रस्तुत किया, जबकि सीएफटीआर नॉक आउट से आंतरिक अंग की स्थिति बिगड़ी हुई होती है और एक्सोक्रिन अग्न्याशय का विनाश होता है, जो मानव रोग16,,17को प्रतिबिंबित करता है। सबसे बड़ी रुचि यह थी कि पी एरुगिनोसा बैक्टीरियल बोझ 8 घंटे बाद संक्रमण (एचपीआई) पर नियंत्रण की तुलना में cftr-हानि-कार्योंमें काफी अधिक था, जो चूहों और मानव ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं2,,18के साथ प्राप्त परिणामों को समानताएं देता है।

इस काम में, हम प्रदर्शित करते हैं कि फेएज थेरेपी जेब्राफिश भ्रूण में पी एरुगिनोसा संक्रमण के खिलाफ प्रभावी है।

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Protocol

एबी स्ट्रेन (यूरोपीय ज़ेब्राफिश रिसोर्स सेंटर ईजेडआरसी) से वयस्क जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)को वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर अंतरराष्ट्रीय (यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/ईयू) और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों (इतालवी डिक्री4 मार्च 2014, एन 26) के अनुसार बनाए रखा जाता है। मछली की सुविधा में 14 घंटे की रोशनी/10 घंटे के अंधेरे चक्र और टैंक के पानी के तापमान के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर मानक स्थितियां निर्धारित की जाती हैं ।

1. समाधान और उपकरणों की तैयारी

  1. जेब्राफिश भ्रूण बढ़ने के लिए E3 भ्रूण माध्यम के लिए एक 50x स्टॉक समाधान और 1x काम समाधान तैयार (तालिका 1देखें) ।
  2. निषेचन (24 एचपीएफ) (तालिका 1देखें) के बाद 24 घंटे से भ्रूण पिगमेंटेशन को अवरुद्ध करने के लिए पिगमेंटेशन अवरुद्ध समाधान बनाएं।
  3. तालिका1 में वर्णित 25x स्टॉक और 1x वर्किंग ट्राइकेन एनेस्थेटिक समाधान तैयार करें।
    नोट: स्टॉक समाधान को नुकसान पहुंचाने वाले समाधान की बार-बार ठंड और विगलन से बचने के लिए, 25x ट्राइकेन के 2 एमएल के एलिकोट्स बनाएं और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एक माइक्रोवेटेबल फ्लास्क या बोतल में आसुत एच 2 ओ के 100 मिलीएल में1ग्राम एग्राडि़ए को भंग करके भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए ट्रैक तैयार करें। 1-3 मिनट के लिए माइक्रोवेव जब तक agarose पूरी तरह से भंग हो गया है ।
  5. स्थिति ज़ेब्राफ़िश माइक्रोइंजेक्शन मोल्ड्स (सामग्री की टेबलदेखें) एक पेट्री डिश (90 मिमी x 15 मिमी) में उल्टा हो गया और लगभग 10 मिमी की चौड़ाई के साथ तरल एगर उठे जेल को डालकर पूरी सतह को कवर करता है।
  6. एक बार एगर उठे जम जाने के बाद मोल्ड को हटा दें। पेट्री डिश को 1x E3 भ्रूण माध्यम से भरें। इसे लगभग एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। उपयोग से पहले, ट्राइकेन युक्त ताजा E3 माध्यम से बदलें।
    नोट: पुराने मोल्ड कवक या जीवाणु संदूषण विकसित कर सकते हैं।
  7. माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुई तैयार करने और हैंडल को कसकर उन्हें माइक्रोपिपेट खींचने के लिए सुरक्षित करने के लिए आग पॉलिश 10 सेमी बोरोसिलिकेट केशिकाओं का उपयोग करें। निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ पुलर सेट करें: हीट 500, वेग 100, समय 150, 150 खींचें।

2. पी एरुगिनोसा (PAO1) इनोकुलम तैयारी

  1. एलबी शोरबा के 5 मिलील में जीएफपी+ पीएरुगिनोसा स्ट्रेन PAO119 की 1 कॉलोनी टीका लगाएं (टेबल 1 देखें) और मिलाते हुए (200आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ते हैं।
  2. पौंड शोरबा के 10 मिलीएल में ओडी600 = 0.1 के लिए उपरोक्त रातोंरात संस्कृति को पतला करें और मिलातेहुए (200 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ओडी 600 = 0.5 तक बढ़ें।
  3. 16,100 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए संस्कृति का 2 एमसीएल और सेल पेलेट को ओडी600 = 1 तक, शारीरिक समाधान के 1 Table 1मिलील में लगभग 1 x10 9 9 एमएल/
  4. कोशिका निलंबन को शारीरिक समाधान में लगभग 5 x 107 7एमएल तक पतला करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. फेज स्टॉक की तैयारी

  1. पी एरुगिनोसा तनाव PAO1 की 1 कॉलोनी एलबी शोरबा के 5 मिलीलन में और मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट। एलबी शोरबा के 500 मिलीएल में ओडी600 = 0.01 के लिए रातोंरात संस्कृति को पतला करें और ओडी600 = 0.05 के बराबर, लगभग 2.5 x 107 7 7 7 7 7 एमएल के बराबर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
  2. पी एरुगिनोसाकी पतला संस्कृति के लिए, 10-3 के संक्रमण (M.O.I.) की बहुलता प्राप्त करने के लिए लगभग 1.25 x 107 फैज जोड़ें।-3 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए जब तक ओडी600 बूंदों के बारे में 0.1-0.3 (लगभग 3 से 5 घंटे में, उपयोग किए गए फाज के आधार पर) तक।
    नोट: इस प्रयोग के लिए चार फैज का चयन किया गया था जो PAO1 तनाव को संक्रमित करते हैं: दो पोडोविरिडी, जेनबैंक परिग्रहण संख्या vB_PaeP_PYO2, MF490236, और vB_PaeP_DEV, MF490238, और दो Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, और vB_PaeM_E217, MF490240 । प्रत्येक फेज के लिए नीचे दिए गए चरणों को व्यक्तिगत रूप से करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए DNase और RNase के 1 मिलीग्राम/ml के साथ lysate इनक्यूबेट । 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और ध्यान से सुपरनैंट (एसएन) को ठीक करें। एसएन को 0.8 माइक्रोन पोर व्यास वाले फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें।
  4. एसएन में एनएसीएल के 58 जी/एल और PEG6000 के 105 ग्राम/एल जोड़ें। आरटी 20 मिनट पर सरगर्मी के साथ भंग और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें । फेज वर्षा के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20, 000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। एसएन निकालें और ध्यान से टीएन बफर के 15 एमएल में फाज गोली भंग (तालिका 1देखें) ।
  5. नीचे दिए गए चरणों में वर्णित CsCl घनत्व ढाल के साथ फैज को शुद्ध करें।
    1. SW41 रोटर के लिए पॉलीएलोमर अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में, टेबल 1में वर्णित चार सीएससीएल समाधानों में से 2 एमएल को स्ट्रैटिफाइंग करके सीएससीएल चरण घनत्व ढाल तैयार करें।  4 ट्यूबों में से प्रत्येक में 3.5 एमएल फेज सस्पेंशन जोड़ें।
      नोट: CsCl विषाक्त है, इसे संभालने और त्यागने के लिए उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं को अपनाएं।
    2. रोटर में ट्यूबों का परिचय दें और यह सुनिश्चित करें कि ट्यूब संतुलित हैं (दो आमने-सामने की ट्यूबों के बीच वजन का अंतर 0.01 g ≤ होना चाहिए)।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस और 100, 000 x ग्राम (SW41 रोटर के लिए 25,000 आरपीएम) पर 2 घंटे के लिए सेंट्रलाइज।। अपकेंद्रित्र के बाद, धीरे-धीरे ट्यूबों को हटा दें और उन्हें ध्यान से समर्थन पर स्थिर करें। 19 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करना, सफेद/opalescent बैंड है कि आमतौर पर डी = 1.5 और डी = 1.4 घनत्व क्षेत्र के बीच स्थित है आकर्षित ।
    4. एसडब्ल्यू 60 रोटर के लिए सिरिंज से निलंबन को नए पॉलीएलोमर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और ट्यूबों को ठीक से संतुलित करने के लिए डी = 1.4 समाधान का उपयोग करें।
    5. कम से कम 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 150,000 x ग्राम (SW60 रोटर के लिए 38,000 आरपीएम) पर निलंबन को अपकेंद्रित्र करें।
    6. ऊपर के रूप में दृश्य बैंड ले लीजिए (चरण 3.3.3 देखें) और उन्हें 6,000 दा कट-ऑफ के साथ डायलिसिस ट्यूब में स्थानांतरित करें। 500 मिली पानी के मुकाबले 20 मिनट के लिए और टीएन बफर के 500 मिलील के खिलाफ रात भर प्राप्त दृश्यमान बैंड 2x को डायलाइज करें। 0.22 माइक्रोन पोर फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. फेज कॉकटेल तैयारी

  1. चार फैज का मिश्रण बनाएं जो तनाव PAO1 को संक्रमित करते हैं, पहले अलग औरविशेषता 8। मिश्रण से पहले, पट्टिका परख20द्वारा प्रत्येक फेज स्टॉक के टाइटर का अनुमान लगाएं।
  2. प्रत्येक प्रयोग से तुरंत पहले एक ही pfu/mL पर चार phage तैयारी मिश्रण द्वारा, 5 ×10 8 pfu/mL के एक समग्र टाइटर के साथ, phage कॉकटेल इकट्ठा, सटीक phage titers सुनिश्चित करने के लिए ।

5. सीएफटीआर मॉर्फोलिनोस माइक्रोइंजेक्शन के लिए जेब्राफिश भ्रूण का संग्रह और तैयारी

नोट: cftr morpholinos (cftr-MOs) माइक्रोइंजेक्शनcftrके लिए जंगली प्रकार जेब्राफिश से 1-2 सेल भ्रूण ले लीजिए ।

  1. बैक्टीरियल माइक्रोइंजेक्शन प्रयोग से दो दिन पहले, प्रजनन जोड़े की स्थापना की और भ्रूण एकत्र के रूप में पहले21वर्णित है । एबी स्ट्रेन के वयस्क जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)को यूरोपीय जेब्राफिश रिसोर्स सेंटर, ईजेआरसी से खरीदा गया था।
  2. दिन के बाद, एक प्लास्टिक पिपेट के साथ निषेचन के तुरंत बाद भ्रूण इकट्ठा या एक ठीक जाल छलनी का उपयोग कर । ई 3 भ्रूण माध्यम युक्त पेट्री डिश में एकत्र भ्रूण रखें और ध्यान से एक प्लास्टिक पिपेट के साथ मलबे को हटाने के लिए संदूषण है कि भ्रूण के विकास को नुकसान हो सकता है से बचने के लिए ।
  3. बाँझ पानी में दो मॉर्फोलिनो स्टॉक समाधान (1 m) को 0.25 पीएमओएल/भ्रूण एटीजी-मो + 0.25 पीएमओएल/भ्रूण स्प्लिस-एमओ की अंतिम एकाग्रता के लिए कमजोर करके मॉर्फोलिनो इंजेक्शन समाधान के 5 माइक्रोन तैयार करें। भ्रूण इंजेक्शन का पता लगाने के लिए, मॉर्फोलिनो इंजेक्शन समाधान मिश्रण करने के लिए फेनोल लाल के 0.5 माइक्रोन जोड़ें।
  4. एक 20 माइक्रोल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके मॉर्फोलिनो मिक्स सॉल्यूशन के लगभग 5 माइक्रोल के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करें। सुई को एक स्टैंड से जुड़े माइक्रोमैनीपुलेटर में सुरक्षित करें और इसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
    नोट: यह आवश्यक नहीं है कि समाधान सुई की नोक तक पहुंचता है क्योंकि माइक्रोइंजेक्टर पंप का दबाव इसे धक्का देगा।
  5. ठीक बाँझ चिमटी के साथ सुई टिप काटने से सुई की नोक से क्लिप। माइक्रोस्कोप के नेत्र में एक पैमाने पर बार का उपयोग कर ड्रॉप के व्यास को मापने। वैकल्पिक रूप से, एक माइक्रोमीटर स्लाइड पर खनिज तेल की एक बूंद बनाएं और बूंद के आकार का मूल्यांकन करने के लिए तेल-बूंद में समाधान इंजेक्शन द्वारा माइक्रोइंजेक्शन वॉल्यूम सेट करें। 2 एन एल की मात्रा इंजेक्ट करने के लिए 156 माइक्रोन व्यास के साथ एक बूंद का उपयोग करें।
  6. 15 एचपीए के लिए मुआवजा दबाव को समायोजित करके माइक्रोइंजेक्टर सेट, इंजेक्शन समय ०.५ एस के लिए, और इंजेक्शन दबाव ३०० और ६०० एचपीए के बीच सही इंजेक्शन की मात्रा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल सुई के आधार पर ।
  7. एक प्लास्टिक पिपेट के साथ एक 96 मिमी व्यास पेट्री डिश में तैनात ग्लास पर चरण 5.2 से भ्रूण की व्यवस्था करें।
    नोट: बहुत ज्यादा E3 माध्यम भ्रूण के कोरियोन में माइक्रोइंजेक्शन सुई के उचित प्रवेश को रोक देगा।
  8. तारे को भेदना और फिर सुई के साथ जर्दी को 2 nL को भ्रूण में इंजेक्ट करने के लिए जैसा कि पहले वर्णितहै 22.
  9. E3 माध्यम के साथ एक पेट्री डिश में इंजेक्शन भ्रूण प्लेस और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में डाल करने के लिए उन्हें दिन के बाद तक विकसित करते हैं।

6. बैक्टीरिया और फेज कॉकटेल के साथ जेब्राफिश भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन

नोट: एक प्रणालीगत संक्रमण प्रदर्शन करने के लिए, भ्रूण रक्त परिसंचरण है कि आम तौर पर 26 hpf के बाद शुरू होता है होना चाहिए ।

  1. 26 एचपीएफ के बाद (जेब्राफिश विकास के चरणों के लिए किमेल21को संदर्भित करता है) 2 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर E3 माध्यम में प्रोनेस पाउडर को भंग करके तैयार किए गए प्रोनेस समाधान के साथ डिकोरियोनेट भ्रूण। धीरे से कोरिक्शन को तोड़ने के लिए भ्रूण को पिपेट करें। प्रोनेज/ई3 मीडियम को छोड़ दें और सभी प्रोन्स को हटाने के लिए फ्रेश ई3 के साथ डिश को कई बार कुल्ला करें ।
  2. इंजेक्शन से लगभग 5 मिनट पहले ट्राइकेन युक्त E3 माध्यम में जेब्राफिश भ्रूण एनेस्थेटाइज करें।
  3. स्टेप 1 में तैयार ट्रैक में एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण को पिपेट करें। पार्श्व स्थिति में भ्रूण लाइन करने के लिए एक ठीक जेल लोडिंग टिप का प्रयोग करें।
  4. भाग 5 में वर्णित पी एरुगिनोसा तैयारी के लगभग 5 माइक्रोल के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करें।
  5. क्यूवियर की वाहिनी के शुरुआती बिंदु पर सुई को पृष्ठीय डालें जहां यह जर्दी थैली पर फैलना शुरू होता है। 1-3 एनएल की मात्रा इंजेक्ट करें और यह सुनिश्चित करें कि मात्रा सीधे वाहिनी के भीतर फैलती है और परिसंचरण में प्रवेश करती है।
  6. लगभग हर ५० इंजेक्शन-भ्रूण के बाद, बाँझ PBS के १०० माइक्रोन के साथ एक १.५ एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में बैक्टीरिया की एक बूंद सुई अगर इंजेक्शन की मात्रा ही रहता है की जांच करने के लिए । सीएलयू का आकलन करने के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी एगर (टेबल 1देखें) पर इनोकुलम प्लेट करें।
  7. माइक्रोजेक्टेड भ्रूण को ताजा ई3 माध्यम + पीटीयू के साथ दो साफ पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. दो चयनित समय बिंदुओं पर: बैक्टीरियल इंजेक्शन के बाद 30 मिनट या 3 घंटे, इनक्यूबेटर से बैक्टीरियल-इंजेक्शन वाले भ्रूण के साथ पेट्री व्यंजनों में से एक को बाहर निकालें और उन्हें ट्रैक में संरेखित करें जैसा कि फाग कॉकटेल इंजेक्शन के लिए 6.3 में वर्णित है।
  9. एक बारीक जेल लोडिंग टिप के साथ लगभग 5 माइक्रोल फेज कॉकटेल (स्टेप 4 में तैयार) के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करें और इसे माइक्रोइंजेक्टर (चरण 5 देखें) पर ठीक करें।
  10. पहले बैक्टीरिया के साथ इंजेक्शन भ्रूण के Cuvier की नलिका में phage कॉकटेल सुई ।
  11. माइक्रोजेक्टेड भ्रूण को ताजा ई3 माध्यम + पीटीयू के साथ दो साफ पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

7. PAO1 और phages के साथ इंजेक्शन भ्रूण के जीवाणु बोझ का मूल्यांकन

  1. 8 एचपीआई पर, पेट्री डिश से 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब तक 15 एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण।
  2. एनेस्थेटिक समाधान को पीबीएस (पीबीएसट्रिटनएक्स) में 1% ट्राइटन एक्स-100 के 300 माइक्रोन के साथ बदलें और एक बाँझ 27-जी सुई के साथ इंसुलिन सिरिंज के माध्यम से उन्हें कम से कम 15x पारित करके भ्रूण को समरूप करें।
  3. बाँझ पीबीएस के 900 माइक्रोन में पतला समरूप के 100 माइक्रोन स्थानांतरित करके बाँझ पीबीएस में समरूप के धारावाहिक कमजोर तैयार करें।
  4. स्वाभाविक रूप से amp-प्रतिरोधी PAO1 तनाव के लिए चयन करने के लिए, एलबी एगर पर कमजोर पड़ने की प्लेट 100 माइक्रोन एम्पिसिलिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ जोड़ा गया, और रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. दिन के बाद, कालोनियों की संख्या गिनती, कमजोर पड़ने कारक से गुणा करने के लिए CFU की कुल संख्या निर्धारित है, और भ्रूण की संख्या से विभाजित करने के लिए CFU/संक्रमित भ्रूण की औसत संख्या प्राप्त करने के लिए समरूप ।

8. PAO1 और phages के साथ इंजेक्शन भ्रूण की घातकता का मूल्यांकन

  1. PAO1 संक्रमण की घातकता का मूल्यांकन करने के लिए, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत 20 hpi पर इंजेक्शन भ्रूण स्कोर और मृत भ्रूण के लिए गिनती (सफेद/
  2. PAO1 की आधे अधिकतम घातक एकाग्रता 50 (LD50) खुराक की गणना करें जो 20 एचपीएफ में इंजेक्शन भ्रूण के 50% की मौत निर्धारित करता है।

9. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप समय के लिए भ्रूण की तैयारी-जीएफपी+ PAO1 संक्रमण की चूक इमेजिंग

  1. E3 समाधान के 100 मिलीएल में 1.5% कम पिघलने वाले एग्रास को भंग करके लाइव-भ्रूण इमेजिंग के लिए मोल्ड तैयार करें।
  2. भ्रूण को एनेस्थेटाइज करने के लिए 1% ट्राइकेन (टेबल 1देखें) जोड़ें।
  3. 4 एचपीआई में एक ग्लास बॉटम डिश में प्लास्टिक पिपेट के साथ एक भ्रूण को स्थानांतरित करें और गर्म कम पिघलने वाले बिंदु वाले समाधान को जोड़ें।
  4. ग्लास बॉटम डिश को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें और एक टिप के साथ वांछित अभिविन्यास में भ्रूण की स्थिति है। भ्रूण पर एगरे की एक बूंद को ध्यान से जोड़ने के लिए प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें।
  5. एगर उठे 5-10 मिनट के लिए शांत और धीरे से भ्रूण नम रखने के लिए संवेदनाहारी समाधान युक्त E3 के साथ ग्लास नीचे पकवान भरें ।
  6. जीएफपी+ बैक्टीरिया के लिए फ्लोरोसेंट फिल्टर (चैनल 488 एनएम) के साथ फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे भ्रूण के साथ ग्लास बॉटम डिश रखें। 9, 14 और 18 एचपीआई पर एक ही मापदंडों के साथ आगे अधिग्रहण तक पेट्री डिश को न हटाएं।

10. समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. 20 एचपीआई एनेस्थेटाइज में ट्राइकेन 1x समाधान के साथ भ्रूण को एनेस्थेटाइज करें और उन्हें पेट्री डिश से 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. एक धूम हुड के तहत एनेस्थेटिक समाधान को हटा दें और 200 माइक्रोन के साथ ग्वानिडियम हाइड्रोक्लोराइड रीएजेंट के साथ बदलें।
  3. भ्रूण को पहले 200 माइक्रोल पिपेट के माध्यम से दोहराकर और फिर एक बाँझ 27 जी सुई के साथ इंसुलिन सिरिंज के साथ कम से कम 15x द्वारा अनुकूलित करें।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्वानिडियम हाइड्रोक्लोराइड अभिकर्मक का उपयोग करके समरूप जेब्राफिश भ्रूण से कुल आरएनए निकालें।
  5. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, 1U/μL के 2 μL के साथ आरएनए के प्रत्येक नमूने के 1 माइक्रोन का इलाज करें।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 20 माइक्रोन की कुल मात्रा में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन (आरटी) के लिए आरएनए का इलाज करने वाले DNase के 1 माइक्रोन का उपयोग करें।
  7. आरटी प्रतिक्रिया के 1:6 कमजोर पड़ने के 1.5 माइक्रोन का उपयोग करके 10 माइक्रोन युक्त 10 माइक्रोन ग्रीन मास्टरमिक्स की कुल मात्रा में आरटी क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया करें। सामान्यीकरण उद्देश्यों के लिए, घर रखने वाले जीन आरपीएल 8 के लिए प्राइमर का उपयोग करें और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के लिए, टीएनएफ-α और आईएल-1 के लिए प्राइमर का उपयोग करें (तालिका 2देखें)। क्यूपीसीआर प्रोटोकॉल था: चक्र 1 चरण 1: 95 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट, एक बार दोहराएं; चक्र 2: चरण 1 95 डिग्री सेल्सियस, 10 एस, चरण 2 55 डिग्री सेल्सियस, 30 एस, 40x दोहराएं; चक्र 3: चरण 1 72 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट।

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Representative Results

परिणाम और यहां प्रस्तुत आंकड़े CF cftr morpholinos के इंजेक्शन के माध्यम से उत्पन्न भ्रूण के रूप में पहले10 और चरण 5 में वर्णित करने के लिए भेजा जाता है । CF फेनोटाइप को मान्य करने के लिए, हृदय, यकृत और अग्न्याशय जैसे आंतरिक अंगों की बिगड़ा स्थिति पर विचार किया गया था जैसा कि पहलेवर्णित 17 (चित्रा 1)माना जाता था।17 इसी प्रकार के परिणाम डब्ल्यूटी भ्रूण के मामले में प्राप्त किए गए थे जैसा कि हमारे पिछले प्रकाशन19में बताया गया है ।

PAO1 से संक्रमित सीएफ भ्रूण में फेज थेरेपी से बैक्टीरियल का बोझ कम हो गया था । इसके अलावा, हम 15 भ्रूण के समरूप समूहों द्वारा 8 hpi पर जीवाणु बोझ का मूल्यांकन: PAO1 संक्रमित भ्रूण में मौजूद बैक्टीरिया (cfu/भ्रूण) की औसत संख्या phage प्रशासन उपचार के बाद के बारे में 20% तक कम हो गया था, इस प्रकार phage कॉकटेल(चित्रा 2)की उपस्थिति में एक कम गंभीर संक्रमण की पुष्टि ।

घातकता GFP+ बैक्टीरिया PAO1 से संक्रमित CF भ्रूण में phage चिकित्सा द्वारा कम किया गया था । ४८ एचपीएफ में CF ज़ेब्राफिश भ्रूण एक खुराक है कि 20 hpi (30 cfu/भ्रूण, चित्रा 3A)के बाद ५०% घातकता का कारण बना पर PAO1 तनाव के GFP+ बैक्टीरिया के साथ इंजेक्शन थे । इंजेक्शन की साइट एक प्रणालीगत संक्रमण उत्पन्न करने के लिए क्यूवियर की जर्दी या डक्ट थी। PAO1 संक्रमण के खिलाफ Phage चिकित्सा समान रूप से मिश्रित phage कॉकटेल (300-500 pfu/भ्रूण) के 2 nL इंजेक्शन द्वारा परीक्षण किया गया था । इंजेक्शन दो अलग-अलग समय बिंदुओं पर किया गया था: बैक्टीरियल इंजेक्शन के बाद 30 मिनट (जल्दी) और 7 घंटे (देर से)। दोनों ही मामलों में, घातकता 20 एचपीआई पर कम हो गई थी, जो यह दर्शाती है कि फेज थेरेपी प्रभावी है(चित्रा 3 बी)।

लाइव इमेजिंग के साथ, फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके, हमने जीएफपी+ पाओ1 के साथ इंजेक्शन वाले सीएफ भ्रूण में संक्रमण की प्रगति का भी पालन किया और जर्दी थैली पर फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के प्रसार को कम करने में फाज थेरेपी की प्रभावकारिता दिखाई। सीएफ + PAO1 इंजेक्शन भ्रूण GFP + बैक्टीरिया के साथ 4, 9, 14 और 18 hpi पर गुणा चित्रा 4के ऊपरी हिस्से में दिखाया गया है, जबकि CF + PAO1 + phages बैक्टीरिया के खिलाफ phage कार्रवाई के कारण कम फ्लोरेसेंस के साथ भ्रूण नीचे भाग में दिखाया गया है(चित्रा 4)।

फेज थेरेपी ने सीएफ भ्रूण में PAO1 संक्रमण से उत्पन्न भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम कर दिया। हमने 8 एचपीआई पर PAO1 और PAO1 + phages इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का भी मूल्यांकन किया। जैसा कि उम्मीद थी, क्यूपीसीआर तकनीकों द्वारा विश्लेषण किए गए समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स टीएनएफ-ए और आईएल-1 की अभिव्यक्ति नियंत्रण की तुलना में PAO1 इंजेक्शन के बाद काफी बढ़ गई थी, जबकि इसे फाज कॉकटेल(चित्रा 5ए, बी)के सह-इंजेक्शन के साथ कम कर दिया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: सीएफटीआर मॉर्फोलिनोस (सीएफटीआर-एमओ) इंजेक्शन पर सीएफ भ्रूण की पीढ़ी और सत्यापन।cftr (क)सीएफ में हृदय की बिगड़ी स्थिति और लूपिंग ने जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) भ्रूणों की तुलना में भ्रूण को इंजेक्ट किया । सीटू संकरण तकनीक में हार्ट को cmlc2 अभिव्यक्ति के साथ कल्पना की जातीहै। (ख) डब्ल्यूटीई की तुलना में सीएफ भ्रूण में यकृत (तीर) और अग्न्याशय की बिगड़ा स्थिति। जिगर और अग्न्याशय को सीटू संकरण तकनीकों में प्रोक्स1ए अभिव्यक्ति के साथ कल्पना की जाती है । स्केल बार 100 माइक्रोन का संकेत देते हैं। लिव: जिगर; पी: अग्न्याशय। आंकड़ा19से फिर से मुद्रित है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: PAO1 या PAO1 + phages से संक्रमित CF भ्रूण में बैक्टीरियल बोझ। PAO1 + phages बनाम PAO1 भ्रूण में cfu/भ्रूण के सापेक्ष प्रतिशत दिया जाता है । तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब और एसडी बताया गया है। यह आंकड़ा19से पुन मुद्रित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: PAO1 से संक्रमित CF ज़ेब्राफ़िश भ्रूण की घातकता और PAO1 + phages के साथ ।  (क)48 एचपीएफ जेब्राफिश भ्रूण में एलडी50 का निर्धारण 1-सेल चरण (सीएफ भ्रूण) पर सीएफटीआर-एमओके साथ माइक्रोइंजेक्टेड और 48 एचपीएफ में संक्रमित है जिसमें पाओ1 की संस्कृति के 2 एनएल बैक्टीरिया (cfu/भ्रूण) की बढ़ती संख्या शामिल है। भ्रूण की घातकता 20 एचपीआई में देखी गई । (ख)48 एचपीएफ में PAO1 से संक्रमित सीएफ भ्रूण के 20 एचपीआई पर घातकता और फैज कॉकटेल (PAO1 + Φ)के साथ इलाज किया गया। मतलब और एसडी की रिपोर्ट क्रमशः छह और चार प्रयोगों से कर रहे हैं, 25-40 भ्रूण के साथ प्रत्येक । कोणीय परिवर्तन घातकता के प्रतिशत के लिए लागू किया गया था और एक तरह से ANOVA डंकर परीक्षण के बाद इस्तेमाल किया गया था । यह आंकड़ा19से पुन मुद्रित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: जेब्राफिश में फाज थेरेपी की प्रभावकारिता की इमेजिंग। PAO1 इंजेक्शन (ऊपरी भ्रूण) और PAO1 + phages में phage चिकित्सा की प्रभावकारिता के बाद CF भ्रूण में संक्रमण की प्रगति 4, 9, 14 और 18 hpi पर भ्रूण (नीचे भ्रूण) इंजेक्शन । स्केल बार 100 माइक्रोन इंगित करता है। यह आंकड़ा19से पुन मुद्रित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: PAO1 और PAO + phage प्रशासन के बाद समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति । टीएनएफ-ए (ए) और आईएल-1 के जीन का अभिव्यक्ति स्तर आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा सीएफ भ्रूण में 8 एचपीआई पर मापा जाता है, जिसमें 48 एचपीएफ में PAO1 और PAO1 + Φ के साथ इंजेक्ट किया गया है और आरपीएल8की अभिव्यक्ति का उपयोग करके सामान्य किया गया है। चार प्रयोगों का मतलब और एसडी बताया गया है। सांख्यिकीय महत्व का आकलन एनोवा द्वारा डंकर के परीक्षण के बाद किया गया था: टीएनएफ के लिए-ए (CF) बनाम (CF +PAO1) पी = 0.015 *; (CF) बनाम (CF+PAO1+Φ) पी = 0.019 *; (CF+PAO1) बनाम (CF+PAO1+ Φ) पी = 0.77 n.s; आईएल-1के लिए (CF) बनाम (CF+PAO1) पी = 0.00014 ***; (CF) बनाम (CF+PAO1+ Φ) पी = 0.00068 ***; (CF+PAO1) बनाम (CF+PAO1+ Φ) पी = 0.031 *। यह आंकड़ा19से पुन मुद्रित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

समाधान तैयारी
एनेस्थेटिक स्टॉक समाधान 25X आसुत एच 2 ओ में ट्राइकेन का4मिलीग्राम/एमएल।
एनेस्थेटिक वर्किंग सॉल्यूशन 1X आसुत एच2ओ में पतला एक्सील डिस्टल एच 2 ओ के 1X कंसंट्रेशन (0.16 मिलीग्राम/एमएल) ट्राइकेन तक पहुंचने के लिए ट्राइकेन स्टॉक सॉल्यूशन25Xतैयारी।
सीसीएल डी = 1.3 50 एमएल टीएन में 20.49 ग्राम
सीसीएल डी = 1.4 50 एमएल टीएन में 20.28 ग्राम
सीसीएल डी = 1.5 50 एमएल टीएन में 34.13 ग्राम
सीएससीएल डी = 1.6 50 एमएल में 41.2 ग्राम
जेब्राफिश भ्रूण के लिए E3 भ्रूण माध्यम 1 एल 1of E3 (आसुत एच2ओ के साथ 50X स्टॉक को पतला करें) + 0.05% मिथाइल ब्लू के 200 माइक्रोन। आरटी में स्टोर करें।
E3 भ्रूण मध्यम स्टॉक समाधान (50X) 73.0 ग्राम एनएसीएल, 3.15 ग्राम केसीएल, 9.15 ग्राम सीएसीएल2, और 9.95 ग्राम एमजीएसओ4 में 5 एल में आसुत एच2ओ स्टोर आरटी में।
पौंड आगर 10 ग्राम/एल ट्राइप्टोन, 5 ग्राम/एल यीस्ट एक्सट्रैक्ट, 5 जी/एल एनएसीएल, 10 ग्राम/एल एगर
पौंड शोरबा 1L के लिए: 950 एमएल एच2ओ, 10 ग्राम ट्राइप्टोन, 10 ग्राम एनएसीएल, 5 ग्राम खमीर निकालने
पीबीस्ट पीबीएस 1X + ट्राइटन एक्स 1%
शारीरिक समाधान 0.9% एनएसीएल
पिगमेंटेशन ब्लॉकिंग स्टॉक सॉल्यूशन 10X जेब्राफिश भ्रूण के लिए ई3 भ्रूण माध्यम में 0.3 मिलीग्राम/एमएल फिनाइल थिओरिया (पीटीयू) पाउडर
प्रोन स्टॉक समाधान 5X जेब्राफिश भ्रूण के लिए E3 भ्रूण माध्यम में 5 मिलीग्राम/mL pronase पाउडर
टीएन बफर 10 एमएम ट्रिस एचसीएल पीएच 8.0, 150 एमएम एनएसीएल

तालिका 1: समाधान की तैयारी।

जीन नाम प्राइमर सीक्वेंस
टीएनएफ-अल्फा एफडब्ल्यू 5'-TGCTTCACCTCCATAAGACC-3'
टीएनएफफा रेव 5'-CAAGCCACCTAGAAAAAGG-3'
IL1-बीटा Fw 5'-TGGACTTCGCACAAAAAATG-3'
IL1-बीटा रेव 5'-CGTTCACTTCCTCTCTCTCTTGGATG-3'
आरपीएल8 एफडब्ल्यू 5'-CTCCGTCCAAAGCCCAT-3'
आरपीएल8 रेव 5'-TCCTTCACGATCCCCTTGAT-3'

तालिका 2: आरटी-क्यूपीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हमने जेब्राफिश भ्रूण में पी एरुगिनोसा (PAO1) संक्रमण करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया और इसे हल करने के लिए PAO1 को संक्रमित करने में सक्षम के रूप में पहचाने गए पहले फेज के कॉकटेल के साथ फेज थेरेपी कैसे लागू की जाए। एंटीबायोटिक उपचार के लिए एक विकल्प के रूप में बैक्टीरियोफेज का उपयोग पिछले कुछ वर्षों के बाद से ब्याज में वृद्धि की गई है । यह मुख्य रूप से बहु-दवा प्रतिरोधी (एमडीआर) जीवाणु संक्रमणों के प्रसार के कारण होता है, जो सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर मुद्दा बनता है। बेशक, इस काम का दायरा एक पशु मॉडल के लिए फेज थेरेपी के आवेदन तक ही सीमित है न कि मनुष्यों के लिए। हालांकि, हमने सीएफटीआर जीन को लक्षित करने वाले मॉर्फोलिनो के इंजेक्शन के साथ एक सिस्टिक फाइब्रोसिस ज़ेब्राफ़िश मॉडल उत्पन्न किया, जो विशेष रूप से पी. एरगिनोसा संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील रोगजनक मॉडल में भी फाज थेरेपी की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करता है।

यह ध्यान दें कि हम आसानी से phage चिकित्सा प्राप्त कर सकता है, जैसा कि पिछले काम में, हम अलग और विभिन्न phages दोनों विट्रो में और वीवो8में पी aeruginosa संक्रमित करने में सक्षम विशेषता है । यह कदम phages की रोगाणुरोधी गतिविधि प्राप्त करने के लिए मौलिक है । एक विशिष्ट जीवाणु तनाव को संक्रमित करने में सक्षम फेज का अलगाव और लक्षण वर्णन फेज थेरेपी आवेदन के महत्वपूर्ण कदम हैं। दरअसल, पशु/मानव मेजबान पर फेज के प्रतिकूल प्रभावों से बचने के लिए उन लैसोजेनिक के बजाय lytic phages का उपयोग करना आवश्यक है । सबसे महत्वपूर्ण बात, एंटीबायोटिक प्रतिरोध, उग्रता और जीन हस्तांतरण के लिए उन लोगों के रूप में हानिकारक जीन की उपस्थिति के लिए phage जीनोम की जांच करना आवश्यक है।

फेज थेरेपी पहले से ही सफलतापूर्वक अन्य पशु मॉडलों में इस्तेमाल किया गया है। हम सचेत हैं कि जेब्राफिश एक स्तनधारी मॉडल नहीं है और फैज के कुछ प्रभाव अलग हो सकते हैं। हालांकि, चूंकि जेब्राफिश के पास न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज 23 कीसंरक्षित आबादीके साथ मानव के बराबर एक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली है, इसलिए हम अनुमान लगाते हैं कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर डेटा मनुष्यों में प्रजनन योग्य हो सकता है। इसके अलावा, ज़ेब्राफ़िश को बैक्टीरियल संक्रमण अध्ययनों के लिए अच्छी तरह से मूल्यांकन किया जाता है, फाज थेरेपी प्रभावकारिता के लिए परीक्षक के रूप में इसका उपयोग चिकित्सीय दृष्टिकोणों के लिए आशाजनक हो सकता है। दरअसल, संक्रमण प्रणालीगत हो सकता है यदि बैक्टीरिया को क्यूवियर की वाहिनी के माध्यम से परिसंचरण में इंजेक्ट किया जाता है, या17रिपोर्ट के रूप में स्थानीयकृत किया जाता है। हमने प्रणालीगत और स्थानीयकृत दोनों संक्रमणों का प्रदर्शन किया और यह प्रदर्शित किया कि उन्होंने इसी तरह बढ़ी हुई घातकता और बैक्टीरियल बोझ उत्पन्न किया जो दोनों फेज थेरेपी आवेदन के बाद कम हो गए थे। इसके अलावा, चूंकि जीएफपी+ फ्लोरोसेंट PAO1 बैक्टीरिया को इंजेक्ट किया गया था, इसलिए भ्रूण विकास के विभिन्न समय बिंदुओं पर संक्रमण का पालन करना आसान था, जब फैज इंजेक्शन दिए गए तो फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की कमी की पुष्टि होती थी।

हमारे ज्ञान के लिए, यह जेब्राफिश में फेज थेरेपी आवेदन का पहला विवरण है, जिसमें सीएफ पृष्ठभूमि में पी एरुगिनोसा के खिलाफ फैज एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि के प्रदर्शन के लिए जोड़ा गया मूल्य है, जो विशेष रूप से इस बैक्टीरियल संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को इतालवी सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (एफएफसी #22/2017) द्वारा समर्थित किया गया था; एसोसियाज़िओन "ग्ली एमिकी डेला रिट्टी" कैस्निगो और एफएफसी #23/2019; पियू ओनलस ला मनो टेसा ओनलस में संयुक्त राष्ट्र रेस्पेरो)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Agar BD 214010
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
CsCl Sigma-Aldrich 289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS Sigma-Aldrich D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich 886-86-2 common name tricaine
Femtojet Micromanipulator Eppendorf 5247
Fleming/brown P-97 Sutter Instrument Company P-97
LE-Agarose Sigma-Aldrich 11685660001
Low Melting Agarose Sigma-Aldrich CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Methyl Blue Sigma-Aldrich 28983-56-4
Microinjection needles Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98% Aldrich-P7629 103-85-5
Oligo Morpholino Gene Tools designed by the researcher
PEG6000 Calbiochem 528877
Phenol Red Solution Sigma-Aldrich CAS 143-74-B
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Pronase Sigma-Aldrich 9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% Sigma-Aldrich S9888
Stereomicroscope Leica S9I
Tris HCl Sigma-Aldrich T5941
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tryptone Oxoid LP0042B
Yeast extract Oxoid LP0021B
Z-MOLDS Microinjection Word Precision Instruments

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References

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सिस्टिक फाइब्रोसिस ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में <em>स्यूडोमोनास एरुगिनोसा</em> संक्रमण का प्रतिकार करने के लिए फेज थेरेपी आवेदन
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Cafora, M., Forti, F., Briani, F., Ghisotti, D., Pistocchi, A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61275, doi:10.3791/61275 (2020).

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