Det aktuella protokollet visar en enkel metod för spårning av ventrala tegmental område (VTA) glutamat projektioner till hippocampus. Fotostimulering av VTA glutamat nervceller kombinerades med CA1 inspelning för att visa hur VTA glutamat terminaler modulerar CA1 förmodade pyramidal avfyrning hastighet in vivo.
Optogenetisk modulering av neuronunderpopulationer i hjärnan har gjort det möjligt för forskare att dissekera neurala kretsar in vivo och ex vivo. Detta ger en förutsättning för att bestämma neurontypers roll inom en neural krets och deras betydelse i informationskodning i förhållande till lärande. På samma sätt kan metoden användas för att testa den fysiologiska betydelsen av två eller flera anslutna hjärnregioner hos vakna och sövda djur. Den aktuella studien visar hur VTA glutamat neuroner modulerar avfyrningshastigheten av förmodade pyramidala nervceller i CA1 (hippocampus) av sövda möss. Detta protokoll använder adeno-associerade virus (AAV)-beroende märkning av VTA glutamat nervceller för spårning av VTA presynaptic glutamat terminaler i lagren av hippocampus. Uttryck av ljusstyrd opsin (channelrhodopsin; hChR2) och fluorescensprotein (eYFP) som hyss av AAV-vektorn tillåten anterograde spårning av VTA glutamatterminaler och fotostimulering av VTA glutamat neuroncellkroppar (i VTA). Hög impedans akut kisel elektroder var placerade i CA1 för att upptäcka multi-unit och en enhet svar på VTA fotostimulering in vivo. Resultaten av denna studie visar den lagerberoende fördelningen av presynaptiska VTA glutamat terminaler i hippocampus (CA1, CA3 och DG). Dessutom ökade fototimuleringen av VTA glutamatneuroner avfyrnings- och spränghastigheten för förmodade CA1-pyramidenheter in vivo.
Under det senaste decenniet utvecklades en rad genetiska verktyg för att öka specificiteten hos neuron-typ modulering, och kartläggning av komplexa neurala nätverk1. Särskilt neurotropa virus med en inneboende förmåga att infektera och replikera i neuronala celler har distribuerats för att uttrycka eller brinna specifika proteiner i neuron subtyper. När man hyser fluorescensproteiner eller genetiskt kodade synaptiska aktivitetsindikatorer, transfecterade AAV vektorer etikett och avgränsa neurala nätverk över hjärnregioner2,3. Valet av en promotor i AAV-konstruktionen styr uttrycket av vektorn i neurontyper med en viss specificitetsnivå(promotorberoende uttryck). Men genom Cre-lox rekombination, AAV konstruktioner distribueras med större specificitet för neuron märkning4,5,6,7. Observera, fotoaktiverade mikrobiella opsinsiner och fluorescensproteiner förpackade i AAV vektorer kan uttryckas i olika neuron subtyper8, och är idealiska för bildbehandling, neuron-typ kretsspårning och fotomodulering9,10.
AAV konstruerar stereotaktiskt injiceras i en hjärnregion (eller kärna) driver uttrycket av reporterproteinet i soma, dendrite och axons terminaler. Neuralt uttryck av AAV som hyser en reportergen (eYFP) underlättar märkning av neuroncellkroppar och anatomisk spårning av projektioner till och från andrahjärnregioner 11,12,13,14. AAV-eYFP-konstruktioner som bär ljusstyrd opsin (t.ex. hChR2), kan användas som ett verktyg föravbildning 6,15 och stimuleringsbaserad fysiologisk spårning av neurala projektioner för att rikta in sig på hjärnområden in vivo16. Beroende på AAV-serotypen kan neuronmärkningens riktning vara anterograde eller bakåtsträvande11,12. Tidigare studier har visat att AAV5 reser anterogradely i nervceller12. Således ger fotostimulering av cellkroppar som uttrycker hChR2 presynaptiska effekter någon annanstans i hjärnan (målet)17.
Här användes AAV (serotyp 5) med en CaMKIIα promotor för att uttrycka eYFP (reporter) och hChR2 (opsin) i VTA glutamat nervceller och axonal projektioner. Resultaten från denna studie visar den lagerberoende fördelningen av VTA-glutamat presynaptiska terminaler i CA1, CA3 och DG hippocampal regioner. Dessutom ökade fotostimuleringen av VTA glutamatneuroner CA1 multi-unit och en enhet eldningshastigheter in vivo jämfört med baslinjevärden. Detta protokoll använder prisvärda verktyg och kommersiellt tillgänglig programvara som kan öka kvaliteten på data som erhållits från neurala kretsspårningsexperiment.
Under det senaste decenniet har utformningen av AAV-konstruktioner utvecklats avsevärt. Som sådan har mer neuronspecifika promotors införlivats i en rad AAV serotyper för förbättrad transfection specificitet14. Genom att kombinera gener för fluorescensproteiner, transportörer, receptorer och jonkanaler finns nu bibliotek av AAV för avbildning, neuromodulering och synaptisk aktivitetsdetektering. I kommersiellt tillgängliga AAV-konstruktioner möjliggör en kombination av en genetiskt kod…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansieras av CBS Bridging Grant som tilldelas OOM. OOM, PAA och AS utformade studien och utförde experimenten. AS och PAA analyserade resultaten. OOM och PAA utarbetade manuskriptet. Vi tackar Dr. Karl Disseroth (Stanford University) för att ha gjort AAV tillgängligt för vår användning.
3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
BNC cable | Amazon | ||
BNC Splitter | Amazon | ||
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
Drill | Dremel | LR 39098 | |
Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
Ketamine | Spectrum | K1068 | |
LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
Urethane | Sigma | U2500 | |
Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
Software | Company | Version | |
Graphpad Prism | |||
Intan Recording Controller | |||
Neuroexplorer | |||
Plexon Offline Spike Sorter | |||
ACSF Composition: | |||
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |