Analyser til validering af Histone Acetyltransferase hæmmere

Summary

Hæmmere af histone acetyltransferaser (HATs, også kendt som lysin acetyltransferases), såsom CBP/p300, er potentielle terapeutiske til behandling af kræft. Men, strenge metoder til validering af disse hæmmere er nødvendige. Tre in vitro metoder til validering omfatter HAT assays med rekombinant acetyltransferaser, immunoblotting for histone acetylation i cellekultur, og ChIP-qPCR.

Abstract

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyse acetylation af lysinrester på histoner og andre proteiner til regulering af kromatindynamik og genekspression. KATs, såsom CBP/p300, er under intens undersøgelse som terapeutiske mål på grund af deres kritiske rolle i tumorigenesis af forskellige kræftformer. Udviklingen af nye små molekylehæmmere rettet mod histone acetyltransferase (HAT) funktion af KATs er udfordrende og kræver robuste analyser, der kan validere specificitet og styrken af potentielle hæmmere.

Denne artikel skitserer en pipeline af tre metoder, der giver streng in vitro validering for nye HAT-hæmmere (HATi). Disse metoder omfatter et reagensglas HAT-analyse, Chromatin Hyperacetylation Hæmning (ChHAI) analyse, og Chromatin Immunoprecipitation-kvantitative PCR (ChIP-qPCR). I HAT-analysen inkuberes rekombinant HAT’er med histoner i et reagensglas, hvilket giver mulighed for acetylation af specifikke lysinrester på histonehalerne. Denne reaktion kan blokeres af en HATi, og de relative niveauer af stedsspecifikke histoneacetylation kan måles via immunblotting. Inhibitorer identificeret i HAT-analysen skal bekræftes i cellemiljøet.

ChHAI-analysen bruger immunoblotting til at screene for nye HATi, der dæmper den robuste hyperacetylation af histoner fremkaldt af en histone deacetylasehæmmer (HDACi). Tilføjelsen af en HDACi er nyttigt, fordi basale niveauer af histon acetylation kan være svært at opdage via immunoblotting.

HAT- og ChHAI-analyserne måler globale ændringer i histonacetylation, men giver ikke oplysninger om acetylation i specifikke genomiske regioner. Derfor anvendes ChIP-qPCR til at undersøge virkningerne af HATi på histonacetylationsniveauer ved genregulerende elementer. Dette opnås gennem selektiv immunudfrielse af histone-DNA-komplekser og analyse af det rensede DNA gennem qPCR. Tilsammen giver disse tre analyser mulighed for omhyggelig validering af specifikke forhold, styrke og virkningsmekanisme af nye HATi.

Introduction

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyser acetylation af lysinrester på både histone og ikke-histonproteiner^1,2,3,4. Nyere forskning viser, at KATs og deres acetyltransferase funktion kan fremme solid tumor vækst^{4,,5,,6,,7,,8,9}. For eksempel er CREB-bindende protein (CBP)/p300 to paraloge KATs, der regulerer mange signalveje i kræft^2,3. CBP/p300 har en vel karakteriseret histon acetyltransferase (HAT) funktion og katalysse Histone 3 Lysin 27 acetylation (H3K27ac)^2,4,5,10,11, en vigtig markør for aktive smagsforstærkere, promotor regioner og aktiv gen transskription^12,13,14. CBP/p300 fungerer som kritiske co-aktivatorer for pro-vækst signalering veje i faste tumorer ved at aktivere transskription af onkogener gennem acetylation af histoner^ogandre transskription faktorer⁴,^{9,15,16,17,18}. På grund af deres rolle i tumor progression, CBP/p300 og andre KATs er under efterforskning for udvikling af nye^hæmmere,der blokerer deres onkogen funktion⁴,^{5, 6,6,7,,8,9,18,19,20}. A-485 og GNE-049 repræsenterer to vellykkede forsøg på at udvikle potente og specifikke hæmmere til CBP/p300^4,9. Yderligere inhibitorer er i øjeblikket ved at blive undersøgt for CBP/p300 og andre kats.

Kvaliteten af tidligere beskrevne KAT-hæmmere (KATi) sættes spørgsmålstegn ved, med mange inhibitorer viser off måleffekter og dårlig karakterisering²¹. Derfor er streng karakterisering og validering af nye lægemiddelkandidater afgørende for udviklingen af kemiske sonder af høj kvalitet. Skitseret her er tre protokoller, der danner en pipeline til screening og strengt validere styrken og specificiteten af nye KATi, med særligt fokus på at hæmme HAT funktion (HATi) af KATs. CBP/p300 og deres hæmmere bruges som eksempler, men disse protokoller kan tilpasses til andre KAT’er, der har hat-funktion⁷.

Den første protokol er en in vitro histone acetyltransferase (HAT) assay, der udnytter renset rekombinant p300 og histoner i et kontrolleret reagensglas reaktion. Denne analyse er enkel at udføre, er omkostningseffektiv, kan bruges til at screene forbindelser i en lav gennemløb indstilling, og kræver ikke radioaktive materialer. I denne protokol katalyserer rekombinant p300 lysinacetylation på histonehaler i løbet af en kort inkubationstid, og niveauerne af histonacetylation måles ved hjælp af standardimmunoblottingprocedurer. Den enzymatiske reaktion kan udføres i nærvær eller fravær af CBP/p300-hæmmere til at screene for forbindelser, der reducerer histonacetylation. Derudover kan HAT-analysen bruges til at kontrollere, om nye forbindelser er selektive for CBP/p300 ved at vurdere deres aktivitet i forhold til andre rensede KAT’er, såsom PCAF. HAT-analysen er et glimrende udgangspunkt for at undersøge nye hæmmere på grund af sin enkelhed, lave omkostninger, og evnen til at bestemme styrken / selektiviteten af en hæmmer. Faktisk er denne protokol ofte bruges i litteraturen som en in vitro skærm^5,10. Men, inhibitorer identificeret i HAT analysen er ikke altid effektive i cellekultur, fordi et reagensglas reaktion er meget enklere end en levende celle system. Det er derfor vigtigt yderligere at karakterisere hæmmere i cellekultureksperimenter^22,23.

Den anden protokol i rørledningen er Chromatin Hyperacetylation Hæmning (ChHAI) assay. Denne cellebaserede analyse anvender histone deacetylasehæmmere (HDACi) som et værktøj til at hyperacetylate histoner i kromatin før co-inkubation med en HATi²⁴. Basal histonacetylation kan være lav i cellekultur, hvilket gør det vanskeligt at sonde for via immunoblotting uden tilsætning af en HDACi at øge acetylation. Formålet med ChHAI-analysen er at identificere nye HATi, der kan dæmpe stigningen i histonacetylation forårsaget af HDAC-hæmning. Fordelene ved denne analyse omfatter dens lave omkostninger, relativ lethed at udføre, og brugen af celler i kultur, som giver mere fysiologisk relevans end reagensglas HAT assay. I lighed med HAT-analysen bruger denne protokol standardimmunisering til dataindsamling.

HAT og ChHAI-analyserne giver data om styrken af nye forbindelser til at hæmme global histonacetylation, men giver ikke indsigt i, hvordan disse forbindelser påvirker modifikationer i specifikke genomiske regioner. Derfor er den endelige protokol, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) et cellekultureksperiment, der undersøger DNA-protein interaktioner i bestemte områder af genomet. I ChIP-protokollen krydslinkes kromatin for at bevare DNA-proteininteraktioner. Kromatin udvindes derefter fra celler, og DNA-proteinkomplekset gennemgår selektiv immunoprecipation for det pågældende protein (f.eks. ved hjælp af et antistof, der er specifikt for H3K27ac). DNA’et renses og analyseres derefter ved hjælp af qPCR. For eksempel kan ChIP-qPCR bruges til at afgøre, om en ny HATi nedregulerer histonacetylation på individuelle oncogenes, såsom Cyclin D1²⁵. Mens ChIP-qPCR er en almindelig teknik, der anvendes i marken, kan det være svært at optimere^4,10,26. Denne protokol indeholder tip til at undgå potentielle faldgruber, der kan opstå under udførelse af ChIP-qPCR-proceduren, og omfatter kvalitetskontrolkontroller, der skal udføres på dataene.

Når disse tre protokoller bruges sammen, giver de mulighed for streng karakterisering og validering af nye HATi. Derudover tilbyder disse metoder mange fordele, fordi de er nemme at udføre, relativt billige og levere data om globale såvel som regionale histon acetylation.

Protocol

1. In vitro HAT-analyse Forberedelse af bufferBEMÆRK: Se tabel 1 for bufferopskrifter. Der tilberedes 5x analysebuffer og 6x natriumdycylsulfat (SDS), og opbevares ved -20 °C. Aliquot SDS i 1 ml aliquots. Forbered 10x SDS gel løbebuffer og 10x TBST og opbevares ved stuetemperatur. Der klargørs 1x overførselsbuffer og opbevares ved 4 °C.FORSIGTIG: Kontroller sikkerhedsdatabladet for alle kemikalier, der anvendes i denne protokol. SDS,…

Representative Results

In vitro histone acetyltransferase (HAT) assay kan bruges til at sonde for forbindelser, der hæmmer p300 HAT aktivitet mod en histone substrat. Figur 1A giver et eksperimentelt skematisk for HAT-analysen. Anakarinsyre, en kendt HATi3,38, blev udnyttet i denne analyse i en koncentration spænder fra 12.5-100 μM. Ved 100 μM nedregulerer anacardinsyre p300 histonacetylation ved Histone 3, Lysines 9 og 18 versus kontrol-DMSO-behandlin…

Discussion

Lysin acetyltransferaser (KATs) acetylate flere lysinrester på histonehaler og transskriptionsfaktorer til regulering af gentranskription^2,3. Arbejde i de sidste to årtier har afsløret, at KNG’er, såsom CBP/p300, PCAF^ogGCN5, interagere med onkogen transskription faktorer og bidrage til at drive tumorvækst i flere solide tumortyper^4,,5,9,<sup cl…

Materials

1.5 ml tube	Fisher Scientific	05-408-129	For all methods
10 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3902	For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips	Fisher Scientific	02-707-454	For all Methods
1000 ul tips	Corning	4846	For all Methods
10X Glycine buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate	Corning	3513	For Method 2
15 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3903	For Method 3
15 ml conical tube	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide			For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk			For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips	Corning	4844	For all Methods
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	For Methods 1 and 2
5X Assay buffer			For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer			For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody	Cell Signaling Technology	4771	For Method 1
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)	Cell Signaling Technology	CST 8173	antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)	Cell Signaling Technology	CST 9675	antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody	Millipore Sigma	T5168	For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid	Cayman Chemical	13144	For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody	Cell Signaling Technology	7076	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film	MIDSCI	BX810	For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform	Stovall Life Science Incorporated	not available	For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)	HyClone	SH30072.03	cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	for buffer preparation
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for SDS sample buffer preparation
CDTA	Spectrum Chemical	125572-95-4	For buffer preparation
cell scraper	Millipore Sigma	CLS3010	For Method 3
ChIP dilution buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells			For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE	Covaris	520045	Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator	Covaris	S220	DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	for SDS sample buffer preparation
DMEM	Corning	10-013-CV	cell culture media
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus	Bio-rad	1704070	For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	Millipore Sigma	17-10086	For Method 3
FK228 (Romidepsin)	Cayman Chemical	128517-07-7	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8775	for cell fixation
glycerol	Fisher Scientific	BP229-1	For buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	G7126	for buffer preparation
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	for buffer preparation
High salt wash buffer			For Method 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore Sigma	WBKLS0500	For Methods 1 and 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	for buffer preparation
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	For buffer preparation
LiCl wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator	Promega	Z5341	For use in Method 3
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	For buffer preparation
Mini gel tank	Invitrogen	A25977	For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	for buffer preparation
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit	Qiagen	28104	For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X	Corning	30-002-CI	cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV	For Methods 2 and 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	for buffer preparation
powdered milk	Nestle Carnation		For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher	26616	For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	PI8340	for use in Method 3
Protein A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	For use in Method 3
Proteinase K	New England BioLabs	P8107S	For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller	MJ Research Inc.	PTC-100	For Method 1
PVDF Transfer Membrane	Millipore Sigma	IEVH00005	For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1	New England BioLabs	M2503S	for use in Method 1
Recombinant p300	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide	Fisher Scientific	26628-22-8	For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500	for buffer preparation
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock	VWR Scientific Products	MPN: 949030	For Methods 1 and 2
Table top centrifuge	Eppendorf	5417R	For all methods
TE buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A	Cayman Chemical	58880-19-6	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	for buffer preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	for buffer preparation
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor	Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.	SRX-101A	For Methods 1 and 2