हिस्टोन एसिटिलट्रांसफेरेज अवरोधकों को मान्य करने के लिए परखें
Summary
हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेसिस (HATs, जिसे लिसाइन एसिटाइलट्रांसफेरेसिस के रूप में भी जाना जाता है) के अवरोधक, जैसे सीबीपी/पी300, कैंसर के इलाज के लिए संभावित चिकित्सीय हैं । हालांकि, इन अवरोधकों को मान्य करने के लिए कठोर तरीकों की आवश्यकता है। सत्यापन के लिए तीन इन विट्रो विधियों में रीकॉम्बिनेंट एसिटाइलट्रांसफेरेस के साथ हैट परख, सेल संस्कृति में हिस्टोन एसिटिलेशन के लिए इम्यूनोब्लोटिंग और सीआईपी-क्यूपीसीआर शामिल हैं।
Abstract
लिसाइन एसिटाइलट्रांसफेरेसेस (KATs) क्रोमेटिन गतिशीलता और जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए हिस्टन और अन्य प्रोटीन पर लिसाइन अवशेषों के एसीटिलेशन को उत्प्रेरित करता है। सीबीपी/पी300 जैसे KATs, विविध कैंसर के ट्यूमरजीनेसिस में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में गहन जांच के अधीन हैं । KATs के हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज (हैट) समारोह को लक्षित करने वाले उपन्यास छोटे अणु अवरोधकों का विकास चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए मजबूत परख की आवश्यकता है जो संभावित अवरोधकों की विशिष्टता और शक्ति को मान्य कर सकते हैं।
यह लेख तीन तरीकों की एक पाइपलाइन को रेखांकित करता है जो उपन्यास हैट अवरोधकों (HATI) के लिए कठोर इन विट्रो सत्यापन प्रदान करते हैं। इन तरीकों में एक टेस्ट ट्यूब हैट परख, क्रोमेटिन हाइपरसेटिलेशन अवरोध (सीएचएई) परख, और क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपेशन-मात्रात्मक पीसीआर (ChIP-qPCR) शामिल हैं। हैट परख में, एक टेस्ट ट्यूब प्रतिक्रिया में हिस्टोन के साथ फिर से संयोजन किया जाता है, जो हिस्टोन पूंछ पर विशिष्ट lysine अवशेषों के एसीटिलेशन के लिए अनुमति देता है। इस प्रतिक्रिया को एक HATI द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है और साइट-विशिष्ट हिस्टोन एसिटिलेशन के सापेक्ष स्तर को इम्यूनोब्लोटिंग के माध्यम से मापा जा सकता है। टोपी परख में पहचाने गए अवरोधकों को सेलुलर वातावरण में पुष्टि करने की आवश्यकता है।
ChHAI परख उपन्यास HATI के लिए स्क्रीन करने के लिए इम्यूनोब्लोटिंग का उपयोग करता है जो एक हिस्टोन डेसेटाइलेस अवरोधक (एचडीएसीआई) द्वारा प्रेरित हस्टटोन के मजबूत हाइपरसेटाइलेशन को कम करता है। एचडीएसीआई के अलावा सहायक है क्योंकि हिस्टोन एसिटिलेशन के बेसल स्तर इम्यूनोब्लोटिंग के माध्यम से पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है।
हैट और सीएचई का कहना है कि हिस्टोन एसिटिलेशन में वैश्विक परिवर्तनों को मापता है, लेकिन विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में एसीटिलेशन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। इसलिए, जीन नियामक तत्वों पर हिस्टोन एसिटिलेशन स्तरों पर एचएटीआई के प्रभावों की जांच करने के लिए छग-क्यूपीसीआर का उपयोग किया जाता है। यह हिस्टोन-डीएनए परिसरों के चयनात्मक इम्यूनोप्रिपिटेशन और क्यूपीसीआर के माध्यम से शुद्ध डीएनए के विश्लेषण के माध्यम से पूरा किया जाता है। साथ में, ये तीन परख उपन्यास हैटी की विशिष्टता, शक्ति और कार्रवाई के तंत्र के सावधानीपूर्वक सत्यापन की अनुमति देते हैं।
Introduction
लिसिन एसिटाइलट्रांसफेरेस (KATs) ने हिस्टोन और गैर-हिस्टोन,प्रोटीन1,2,,3,4दोनों पर लिसाइन अवशेषों के एसीटिलेशन को उत्प्रेरित किया ।, हाल के शोध से पता चलता है कि KATs और उनके एसिटिलट्रांसफरेज कार्य ठोस ट्यूमर विकास को बढ़ावा देने के4,,5,,6,,7,8,9 कर,सकतेहैं । उदाहरण के लिए, सीआरईबी-बाइंडिंग प्रोटीन (सीबीपी) /पी300 दो पैरालॉगस केट्स हैं जो कैंसर2,,3में कई सिग्नलिंग रास्तों को विनियमित करते हैं। सीबीपी/पी 300 में एक अच्छी तरह से विशेषता हाइस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज (हैट) फ़ंक्शन और उत्प्रेरक हिस्टोन 3 लिसाइन 27 एसिटिलेशन (एच 3के27एसी)2,,4,,5,10,,11,सक्रिय एन्मेंटेवर्स, प्रमोटर क्षेत्रों और सक्रिय जीन ट्रांसक्रिप्शन12,13,,14के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर है।,, सीबीपी/पी 300 ने हिटोन और,अन्य ट्रांसक्रिप्शन कारकों,16,4,9,15, 16, 17, 18के एसिटिलेशन के माध्यम से ऑन्कोजीन के प्रतिलेखन को सक्रिय करके ठोस ट्यूमर में प्रो-ग्रोथ सिग्नलिंग रास्तों के लिए महत्वपूर्ण सह-सक्रियकों के रूप में काम किया।,,1718 ट्यूमर की प्रगति में उनकी भूमिका के कारण, सीबीपी/पी300 और अन्य KATs उपन्यास अवरोधकों के विकास के लिए जांच की जा रही है जो उनके ऑन्कोजेनिक कार्य,4, 5,6,,6,7,,8,9, 19,,,19,,20को अवरुद्ध करते हैं ।19 ए-485 और जीएनई-049 सीबीपी/पी3004, 9,के लिए शक्तिशाली और विशिष्ट अवरोधकों को विकसित करने के दो सफल प्रयासों का प्रतिनिधित्वकरतेहैं । फिलहाल सीबीपी/पी300 और अन्य KATs के लिए अतिरिक्त अवरोधकों की जांच की जा रही है ।
पहले वर्णित कैट अवरोधकों (KATI) की गुणवत्ता को प्रश्न में बुलाया जा रहा है, जिसमें कई अवरोधकों को लक्ष्य प्रभाव और खराब लक्षण वर्णन21दिखाया गया है । इसलिए, उच्च गुणवत्ता वाले रासायनिक जांच के विकास के लिए उपन्यास दवा उम्मीदवारों का कठोर लक्षण वर्णन और सत्यापन आवश्यक है। यहां उल्लिखित तीन प्रोटोकॉल हैं जो स्क्रीनिंग के लिए एक पाइपलाइन बनाते हैं और उपन्यास KATI की शक्ति और विशिष्टता को कड़ाई से मान्य करते हैं, जिसमें KATs के हैट फ़ंक्शन (HATI) को बाधित करने पर विशेष ध्यान दिया जाता है। सीबीपी/पी 300 और उनके अवरोधकों का उपयोग उदाहरण के रूप में कियाजाताहै, लेकिन इन प्रोटोकॉलों को अन्य KATs के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जिनमें हैट फ़ंक्शन 7 है।
पहला प्रोटोकॉल एक इन विट्रो हिस्टोन एसीटिलट्रांसफरेज (हैट) परख है जो नियंत्रित टेस्ट ट्यूब प्रतिक्रिया में शुद्ध पुनर्संयोजन p300 और हिस्टोन का उपयोग करता है। यह परख प्रदर्शन करने के लिए सरल है, लागत प्रभावी है, एक कम थ्रूपुट सेटिंग में यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और रेडियोधर्मी सामग्री की आवश्यकता नहीं है। इस प्रोटोकॉल में, संक्षिप्त इनक्यूबेशन अवधि के दौरान हिस्टोन पूंछ पर लिसाइन एसिटिलेशन को पुनः संयोजन पी 300 उत्प्रेरक और हिप्थर एसिटिलेशन के स्तर को मानक इम्यूनोब्लोटिंग प्रक्रियाओं का उपयोग करके मापा जाता है। हाइस्टोन एसिटिलेशन को कम करने वाले यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए सीबीपी/पी300 अवरोधकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हैट परख का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या पीसीएएफ जैसे अन्य शुद्ध KATs के खिलाफ उनकी गतिविधि का आकलन करके उपन्यास यौगिक सीबीपी/पी300 के लिए चयनात्मक हैं या नहीं। टोपी परख अपनी सादगी, कम लागत के कारण उपन्यास अवरोधकों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट प्रारंभिक बिंदु है, और एक अवरोधक की शक्ति/चयनशीलता का निर्धारण करने की क्षमता है । दरअसल , इस प्रोटोकॉल का उपयोग साहित्य में अक्सर इन विट्रो स्क्रीन5,10के रूप में किया जाता है । हालांकि, टोपी परख में पहचाने गए अवरोधक सेल संस्कृति में हमेशा प्रभावी नहीं होते हैं क्योंकि एक टेस्ट ट्यूब प्रतिक्रिया एक जीवित कोशिका प्रणाली की तुलना में बहुत सरल होती है। इसलिए, सेल कल्चर प्रयोगों में अवरोधकों को आगे बढ़ाना आवश्यक है22,23.
पाइपलाइन में दूसरा प्रोटोकॉल क्रोमेटिन हाइपरसेटाइलेशन अवरोध (सीएचएई) परख है। यह कोशिका आधारित परख एचएटीआई24के साथ सह-इनक्यूबेशन से पहले क्रोमेटिन में हिस्टोन डेसेटाइलीज अवरोधकों (एचडीएसीआई) को हाइपरसेटिलेट करने के लिए एक उपकरण के रूप में उपयोग करती है। बेसल हिस्टोन एसिटिलेशन सेल कल्चर में कम हो सकता है, जिससे एसीटिलेशन बढ़ाने के लिए एचडीएसीआई के अलावा इम्यूनोब्लोटिंग के जरिए जांच करना मुश्किल हो जाता है । CHHAI परख का उद्देश्य उपन्यास HATI की पहचान करना है जो एचडीएसी अवरोध के कारण हिस्टोन एसिटिलेशन में वृद्धि को कम कर सकता है। इस परख के फायदे में इसकी कम लागत, प्रदर्शन करने में सापेक्ष आसानी और संस्कृति में कोशिकाओं का उपयोग शामिल है, जो परीक्षण ट्यूब हैट परख की तुलना में अधिक शारीरिक प्रासंगिकता प्रदान करता है। हैट परख के समान, यह प्रोटोकॉल डेटा संग्रह के लिए मानक इम्यूनोब्लोटिंग का उपयोग करता है।
हैट और सीएचई का कहना है कि वैश्विक हिस्टोन एसिटिलेशन को बाधित करने के लिए उपन्यास यौगिकों की शक्ति के बारे में डेटा प्रदान करता है, लेकिन यह अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है कि ये यौगिक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में संशोधनों को कैसे प्रभावित करते हैं। इसलिए, अंतिम प्रोटोकॉल, क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन-मात्रात्मक पॉलीमेरेज चेन रिएक्शन (ChIP-qPCR) एक सेल संस्कृति प्रयोग है जो जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों में डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच करता है। सीआईपी प्रोटोकॉल में, डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन को संरक्षित करने के लिए क्रोमेटिन को क्रॉसलिंक किया जाता है। क्रोमेटिन को तब कोशिकाओं से निकाला जाता है और डीएनए-प्रोटीन परिसर ब्याज के प्रोटीन के लिए चयनात्मक इम्यूनोप्रिपिटेशन से गुजरता है (उदाहरण के लिए, H3K27ac के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करना)। इसके बाद डीएनए को शुद्ध किया जाता है और क्यूपीसीआर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है । उदाहरण के लिए, यह निर्धारित करने के लिए ChIP-qPCR का उपयोग किया जा सकता है कि क्या एक उपन्यास HATi अलग-अलग ऑन्कोजीन पर हिस्टोन एसिटिलेशन को डाउनरेगुलेट करता है, जैसे साइक्लिन डी1 25। जबकि सीआईपी-क्यूपीसीआर एक सामान्य तकनीक है जो क्षेत्र में,उपयोग की जाती है,4,10,26को अनुकूलित करना मुश्किल हो सकता है।, यह प्रोटोकॉल छग-क्यूपीसीआर प्रक्रिया का प्रदर्शन करते समय होने वाले संभावित नुकसान से बचने के लिए सुझाव प्रदान करता है और इसमें गुणवत्ता नियंत्रण जांच शामिल है जो डेटा पर की जानी चाहिए।
जब एक साथ उपयोग किया जाता है, तो ये तीन प्रोटोकॉल उपन्यास HATI के कठोर लक्षण वर्णन और सत्यापन के लिए अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, ये विधियां कई फायदे प्रदान करती हैं क्योंकि वे प्रदर्शन करने में आसान हैं, अपेक्षाकृत सस्ते हैं और वैश्विक और क्षेत्रीय हिस्टोन एसीटिलेशन पर डेटा प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीन ट्रांसक्रिप्शन2,3को विनियमित करने के लिए लिसाइन एसिटाइलट्रांसफेरेसेस (KATs) हाइस्टोन पूंछ और ट्रांसक्रिप्शन कारकों पर कई लिसाइन अवशेषों का इस्टल करें। पिछले दो दशकों में किए ग…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जेम्स और एस्तेर किंग बायोमेडिकल रिसर्च प्रोग्राम (6JK03 और 20K07), और बैंकहेड-कोले कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (4BF02 और 6BC03), फ्लोरिडा डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ, फ्लोरिडा ब्रेस्ट कैंसर फाउंडेशन और यूएफ हेल्थ कैंसर सेंटर के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अतिरिक्त, हम प्रकाशन प्रक्रिया के दौरान उनके समर्थन के लिए डॉ जचारी ओस्किंग और डॉ एंड्रिया लिन को धन्यवाद देना चाहते हैं ।
Materials
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
- Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
- Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
- Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
- Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
- Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
- Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
- Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
- Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
- Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
- Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
- Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
- Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
- Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
- Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), 054702 (2019).
- Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
- Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2020).
- Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , (2004).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
- Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
- Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
- Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
- Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
- ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020)
- Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
- Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute – University of Queensland Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020)
- Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
- Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
- Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
- Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
- Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
- Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
- Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
- Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).
