Analyser for validering av histone acetyltransferasehemmere

Summary

Hemmere av histone acetyltransferaser (HATs, også kjent som lysin acetyltransferaser), som CBP/p300, er potensielle terapeutiske midler for behandling av kreft. Imidlertid er det nødvendig med strenge metoder for å validere disse hemmerne. Tre in vitro metoder for validering inkluderer HAT-analyser med rekombinante acetyltransferaser, immunoblotting for histone acetylering i cellekultur, og ChIP-qPCR.

Abstract

Lysinacetyltransferaser (KATs) katalyser acetylering av lysinrester på histoner og andre proteiner for å regulere kromatindynamikk og genuttrykk. KATs, som CBP/p300, er under intens undersøkelse som terapeutiske mål på grunn av deres kritiske rolle i tumorigenesis av ulike kreftformer. Utviklingen av nye små molekylhemmere rettet mot histone acetyltransferase (HAT)-funksjonen til KATs er utfordrende og krever robuste analyser som kan validere spesifisiteten og styrken til potensielle hemmere.

Denne artikkelen skisserer en rørledning av tre metoder som gir streng in vitro validering for nye HAT-hemmere (HATi). Disse metodene inkluderer et testrør HAT analyse, Kromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analyse, og Chromatin Immunoprecipitation-kvantitativ PCR (ChIP-qPCR). I HAT-analysen inkuberes rekombinante HATs med histoner i en reagensrørreaksjon, noe som åpner for acetylering av spesifikke lysinrester på histonehalene. Denne reaksjonen kan blokkeres av en HATi, og de relative nivåene av stedsspesifikk histonesecetylering kan måles via immunoblotting. Hemmere identifisert i HAT-analysen må bekreftes i cellulært miljø.

ChHAI-analysen bruker immunoblotting til å screene for romanen HATi som demper den robuste hyperacetyleringen av histoner indusert av en histondeacetylasehemmer (HDACi). Tilsetning av en HDACi er nyttig fordi basale nivåer av histone acetylering kan være vanskelig å oppdage via immunoblotting.

HAT- og ChHAI-analysene måler globale endringer i histoneseedylering, men gir ikke informasjon om acetylering i bestemte genomiske regioner. Derfor brukes ChIP-qPCR til å undersøke effekten av HATi på histone acetyleringsnivåer ved genregulatoriske elementer. Dette oppnås gjennom selektiv immunforekomst av histone-DNA-komplekser og analyse av renset DNA gjennom qPCR. Sammen gir disse tre analysene mulighet for nøye validering av spesifisitet, styrke og virkningsmekanisme av romanen HATi.

Introduction

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyser acetylering av lysinrester på både histone og ikke-histonproteiner^1,,2,,3,,4. Nyere forskning viser at KATs og deres acetyltransferase funksjon kan fremme solid tumorvekst^4,5,6,7,8,9. For eksempel er CREB-bindende protein (CBP) / p300 to paraloge KATs som regulerer mange signalveier i kreft^2,3. CBP/p300 har en godt karakterisert histone acetyltransferase (HAT) funksjon og katalysere Histone 3 Lysine 27 acetylering (H3K27ac)^2,4,5,10,11, en viktig markør for aktive enhancers, promotor regioner og aktiv gentranskripsjon^12,13,14. CBP/p300 fungerer som kritiske medaktivatorer for pro-vekst signalisering veier i faste svulster ved å aktivere transkripsjon av onkogener gjennom acetylering av histoner og andre^{transkripsjonsfaktorer 4,9,15,16,17,18}. På grunn av deres rolle i tumorprogresjon, CBP/p300 og andre KATs er under etterforskning for utvikling av nye hemmere som blokkerer deres onkogene^{funksjon 4,,5,,6,7,8,9,18,19,20}. A-485 og GNE-049 representerer to vellykkede forsøk på å utvikle potente og spesifikke hemmere for CBP/p300^4,,9. Ytterligere hemmere er under etterforskning for CBP/p300 og andre KATs.

Kvaliteten på tidligere beskrevne KAT-hemmere (KATi) blir stilt spørsmålstegn ved, med mange hemmere som viser frem måleffekter og dårlig karakterisering²¹. Derfor er streng karakterisering og validering av nye legemiddelkandidater avgjørende for utviklingen av kjemiske sonder av høy kvalitet. Skissert her er tre protokoller som danner en rørledning for screening og grundig validering av styrken og spesifisiteten til romanen KATi, med et spesielt fokus på å hemme HAT-funksjonen (HATi) av KATs. CBP/p300 og deres hemmere brukes som eksempler, men disse protokollene kan tilpasses for andre KATs som har en HAT-funksjon⁷.

Den første protokollen er en in vitro histone acetyltransferase (HAT) analyse som benytter renset rekombinant p300 og histoner i en kontrollert reagensrørreaksjon. Denne analysen er enkel å utføre, er kostnadseffektiv, kan brukes til å screene forbindelser i en lav gjennomstrømmingsinnstilling, og krever ikke radioaktive materialer. I denne protokollen, rekombinant p300 katalyser lysin acetylering på histone haler i løpet av en kort inkubasjonsperiode og nivåene av histone acetylering måles ved hjelp av standard immunoblotting prosedyrer. Den enzymatiske reaksjonen kan utføres i nærvær eller fravær av CBP/p300-hemmere for å screene for forbindelser som reduserer histonesecetylering. I tillegg kan HAT-analysen brukes til å kontrollere om nye forbindelser er selektive for CBP/p300 ved å vurdere deres aktivitet mot andre rensede KATs, for eksempel PCAF. HAT-analysen er et utmerket utgangspunkt for å undersøke nye inhibitorer på grunn av sin enkelhet, lave kostnader og evnen til å bestemme styrken / selektiviteten til en inhibitor. Faktisk er denne protokollen ofte brukt i litteraturen som en in vitro skjerm^5,10. Imidlertid er inhibitorer identifisert i HAT-analysen ikke alltid effektive i cellekulturen fordi en testrørreaksjon er mye enklere enn et levende cellesystem. Derfor er det viktig å ytterligere karakterisere hemmere i cellekultureksperimenter^22,23.

Den andre protokollen i rørledningen er Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI)-analysen. Denne cellebaserte analysen benytter histondeacetylasehemmere (HDACi) som et verktøy for å hyperacetylate histoner i kromatin før samtidig inkubasjon med en HATi²⁴. Basal histone acetylering kan være lav i cellekultur, noe som gjør det vanskelig å sondere for via immunoblotting uten tilsetning av en HDACi for å øke acetylering. Formålet med ChHAI-analysen er å identifisere romanen HATi som kan dempe økningen i histone acetylering forårsaket av HDAC hemming. Fordelene med denne analysen inkluderer lave kostnader, relativ letthet å utføre, og bruk av celler i kultur, noe som gir mer fysiologisk relevans enn testrøret HAT analyse. I likhet med HAT-analysen bruker denne protokollen standard immunoblotting for datainnsamling.

HAT- og ChHAI-analysene gir data om styrken av nye forbindelser for å hemme global histone acetylering, men gir ikke innsikt i hvordan disse forbindelsene påvirker modifikasjoner på bestemte genomiske regioner. Derfor er den endelige protokollen, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) et cellekultureksperiment som undersøker DNA-proteininteraksjoner på bestemte områder av genomet. I ChIP-protokollen er kromatin krysskoblet for å bevare DNA-proteininteraksjoner. Kromatin ekstraheres deretter fra celler, og DNA-proteinkomplekset gjennomgår selektiv immunforekomst for protein av interesse (f.eks. ved hjelp av et antistoff som er spesifikt for H3K27ac). DNA blir deretter renset og analysert ved hjelp av qPCR. For eksempel kan ChIP-qPCR brukes til å avgjøre om en roman HATi nedregerer histonesecetylering ved individuelle onkogener, for eksempel Cyclin D1²⁵. Mens ChIP-qPCR er en vanlig teknikk som brukes i feltet, kan det være vanskelig å^{optimalisere 4,,10,,26}. Denne protokollen inneholder tips for å unngå potensielle fallgruver som kan oppstå mens du utfører ChIP-qPCR-prosedyren, og inkluderer kvalitetskontrollkontroller som skal utføres på dataene.

Når de brukes sammen, tillater disse tre protokollene streng karakterisering og validering av romanen HATi. I tillegg tilbyr disse metodene mange fordeler fordi de er enkle å utføre, relativt billige og gir data om global samt regional histone acetylering.

Protocol

1. In vitro HAT-analyse Klargjøring av bufferMERK: Se tabell 1 for bufferoppskrifter. Forbered 5x analysebuffer og 6x natrium dodecylsulfat (SDS) og oppbevar ved -20 °C. Aliquot SDS i 1 ml aliquots. Forbered 10x SDS gel kjører buffer og 10x TBST og lagre ved romtemperatur. Forbered 1x overføringsbuffer og oppbevar ved 4 °C.FORSIKTIG: Kontroller sikkerhetsdatabladet for alle kjemikalier som brukes i denne protokollen. SDS, DTT og bromo…

Representative Results

In vitro histone acetyltransferase (HAT)-analysen kan brukes til å sondere for forbindelser som hemmer p300 HAT-aktivitet mot et histoneunderstrat. Figur 1A gir en eksperimentell skjematisk for HAT-analysen. Anacardinsyre, en kjent HATi3,38, ble brukt i denne analysen i et konsentrasjonsområde fra 12,5-100 μM. Ved 100 μM nedregregerer anakarinsyre p300 histone acetylering ved Histone 3, Lysines 9 og 18 versus kontrollen DMSO beha…

Discussion

Lysin acetyltransferaser (KATs) acetylat flere lysin rester på histone haler og transkripsjon faktorer for å regulere gentranskripsjon^2,3. Arbeid i de siste to tiårene har avslørt at KATs, som CBP/p300, PCAF og GCN5, samhandler med onkogene transkripsjonsfaktorer og bidrar til å drive tumorvekst i flere solide tumortyper^{4,,5,,9,,15,</sup…}

Materials

1.5 ml tube	Fisher Scientific	05-408-129	For all methods
10 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3902	For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips	Fisher Scientific	02-707-454	For all Methods
1000 ul tips	Corning	4846	For all Methods
10X Glycine buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate	Corning	3513	For Method 2
15 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3903	For Method 3
15 ml conical tube	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide			For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk			For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips	Corning	4844	For all Methods
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	For Methods 1 and 2
5X Assay buffer			For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer			For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody	Cell Signaling Technology	4771	For Method 1
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)	Cell Signaling Technology	CST 8173	antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)	Cell Signaling Technology	CST 9675	antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody	Millipore Sigma	T5168	For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid	Cayman Chemical	13144	For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody	Cell Signaling Technology	7076	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film	MIDSCI	BX810	For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform	Stovall Life Science Incorporated	not available	For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)	HyClone	SH30072.03	cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	for buffer preparation
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for SDS sample buffer preparation
CDTA	Spectrum Chemical	125572-95-4	For buffer preparation
cell scraper	Millipore Sigma	CLS3010	For Method 3
ChIP dilution buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells			For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE	Covaris	520045	Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator	Covaris	S220	DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	for SDS sample buffer preparation
DMEM	Corning	10-013-CV	cell culture media
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus	Bio-rad	1704070	For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	Millipore Sigma	17-10086	For Method 3
FK228 (Romidepsin)	Cayman Chemical	128517-07-7	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8775	for cell fixation
glycerol	Fisher Scientific	BP229-1	For buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	G7126	for buffer preparation
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	for buffer preparation
High salt wash buffer			For Method 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore Sigma	WBKLS0500	For Methods 1 and 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	for buffer preparation
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	For buffer preparation
LiCl wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator	Promega	Z5341	For use in Method 3
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	For buffer preparation
Mini gel tank	Invitrogen	A25977	For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	for buffer preparation
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit	Qiagen	28104	For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X	Corning	30-002-CI	cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV	For Methods 2 and 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	for buffer preparation
powdered milk	Nestle Carnation		For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher	26616	For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	PI8340	for use in Method 3
Protein A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	For use in Method 3
Proteinase K	New England BioLabs	P8107S	For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller	MJ Research Inc.	PTC-100	For Method 1
PVDF Transfer Membrane	Millipore Sigma	IEVH00005	For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1	New England BioLabs	M2503S	for use in Method 1
Recombinant p300	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide	Fisher Scientific	26628-22-8	For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500	for buffer preparation
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock	VWR Scientific Products	MPN: 949030	For Methods 1 and 2
Table top centrifuge	Eppendorf	5417R	For all methods
TE buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A	Cayman Chemical	58880-19-6	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	for buffer preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	for buffer preparation
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor	Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.	SRX-101A	For Methods 1 and 2