Summary

Analyser for validering av histone acetyltransferasehemmere

Published: August 06, 2020
doi:

Summary

Hemmere av histone acetyltransferaser (HATs, også kjent som lysin acetyltransferaser), som CBP/p300, er potensielle terapeutiske midler for behandling av kreft. Imidlertid er det nødvendig med strenge metoder for å validere disse hemmerne. Tre in vitro metoder for validering inkluderer HAT-analyser med rekombinante acetyltransferaser, immunoblotting for histone acetylering i cellekultur, og ChIP-qPCR.

Abstract

Lysinacetyltransferaser (KATs) katalyser acetylering av lysinrester på histoner og andre proteiner for å regulere kromatindynamikk og genuttrykk. KATs, som CBP/p300, er under intens undersøkelse som terapeutiske mål på grunn av deres kritiske rolle i tumorigenesis av ulike kreftformer. Utviklingen av nye små molekylhemmere rettet mot histone acetyltransferase (HAT)-funksjonen til KATs er utfordrende og krever robuste analyser som kan validere spesifisiteten og styrken til potensielle hemmere.

Denne artikkelen skisserer en rørledning av tre metoder som gir streng in vitro validering for nye HAT-hemmere (HATi). Disse metodene inkluderer et testrør HAT analyse, Kromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analyse, og Chromatin Immunoprecipitation-kvantitativ PCR (ChIP-qPCR). I HAT-analysen inkuberes rekombinante HATs med histoner i en reagensrørreaksjon, noe som åpner for acetylering av spesifikke lysinrester på histonehalene. Denne reaksjonen kan blokkeres av en HATi, og de relative nivåene av stedsspesifikk histonesecetylering kan måles via immunoblotting. Hemmere identifisert i HAT-analysen må bekreftes i cellulært miljø.

ChHAI-analysen bruker immunoblotting til å screene for romanen HATi som demper den robuste hyperacetyleringen av histoner indusert av en histondeacetylasehemmer (HDACi). Tilsetning av en HDACi er nyttig fordi basale nivåer av histone acetylering kan være vanskelig å oppdage via immunoblotting.

HAT- og ChHAI-analysene måler globale endringer i histoneseedylering, men gir ikke informasjon om acetylering i bestemte genomiske regioner. Derfor brukes ChIP-qPCR til å undersøke effekten av HATi på histone acetyleringsnivåer ved genregulatoriske elementer. Dette oppnås gjennom selektiv immunforekomst av histone-DNA-komplekser og analyse av renset DNA gjennom qPCR. Sammen gir disse tre analysene mulighet for nøye validering av spesifisitet, styrke og virkningsmekanisme av romanen HATi.

Introduction

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyser acetylering av lysinrester på både histone og ikke-histonproteiner1,,2,,3,,4. Nyere forskning viser at KATs og deres acetyltransferase funksjon kan fremme solid tumorvekst4,5,6,7,8,9. For eksempel er CREB-bindende protein (CBP) / p300 to paraloge KATs som regulerer mange signalveier i kreft2,3. CBP/p300 har en godt karakterisert histone acetyltransferase (HAT) funksjon og katalysere Histone 3 Lysine 27 acetylering (H3K27ac)2,4,5,10,11, en viktig markør for aktive enhancers, promotor regioner og aktiv gentranskripsjon12,13,14. CBP/p300 fungerer som kritiske medaktivatorer for pro-vekst signalisering veier i faste svulster ved å aktivere transkripsjon av onkogener gjennom acetylering av histoner og andretranskripsjonsfaktorer 4,9,15,16,17,18. På grunn av deres rolle i tumorprogresjon, CBP/p300 og andre KATs er under etterforskning for utvikling av nye hemmere som blokkerer deres onkogenefunksjon 4,,5,,6,7,8,9,18,19,20. A-485 og GNE-049 representerer to vellykkede forsøk på å utvikle potente og spesifikke hemmere for CBP/p3004,,9. Ytterligere hemmere er under etterforskning for CBP/p300 og andre KATs.

Kvaliteten på tidligere beskrevne KAT-hemmere (KATi) blir stilt spørsmålstegn ved, med mange hemmere som viser frem måleffekter og dårlig karakterisering21. Derfor er streng karakterisering og validering av nye legemiddelkandidater avgjørende for utviklingen av kjemiske sonder av høy kvalitet. Skissert her er tre protokoller som danner en rørledning for screening og grundig validering av styrken og spesifisiteten til romanen KATi, med et spesielt fokus på å hemme HAT-funksjonen (HATi) av KATs. CBP/p300 og deres hemmere brukes som eksempler, men disse protokollene kan tilpasses for andre KATs som har en HAT-funksjon7.

Den første protokollen er en in vitro histone acetyltransferase (HAT) analyse som benytter renset rekombinant p300 og histoner i en kontrollert reagensrørreaksjon. Denne analysen er enkel å utføre, er kostnadseffektiv, kan brukes til å screene forbindelser i en lav gjennomstrømmingsinnstilling, og krever ikke radioaktive materialer. I denne protokollen, rekombinant p300 katalyser lysin acetylering på histone haler i løpet av en kort inkubasjonsperiode og nivåene av histone acetylering måles ved hjelp av standard immunoblotting prosedyrer. Den enzymatiske reaksjonen kan utføres i nærvær eller fravær av CBP/p300-hemmere for å screene for forbindelser som reduserer histonesecetylering. I tillegg kan HAT-analysen brukes til å kontrollere om nye forbindelser er selektive for CBP/p300 ved å vurdere deres aktivitet mot andre rensede KATs, for eksempel PCAF. HAT-analysen er et utmerket utgangspunkt for å undersøke nye inhibitorer på grunn av sin enkelhet, lave kostnader og evnen til å bestemme styrken / selektiviteten til en inhibitor. Faktisk er denne protokollen ofte brukt i litteraturen som en in vitro skjerm5,10. Imidlertid er inhibitorer identifisert i HAT-analysen ikke alltid effektive i cellekulturen fordi en testrørreaksjon er mye enklere enn et levende cellesystem. Derfor er det viktig å ytterligere karakterisere hemmere i cellekultureksperimenter22,23.

Den andre protokollen i rørledningen er Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI)-analysen. Denne cellebaserte analysen benytter histondeacetylasehemmere (HDACi) som et verktøy for å hyperacetylate histoner i kromatin før samtidig inkubasjon med en HATi24. Basal histone acetylering kan være lav i cellekultur, noe som gjør det vanskelig å sondere for via immunoblotting uten tilsetning av en HDACi for å øke acetylering. Formålet med ChHAI-analysen er å identifisere romanen HATi som kan dempe økningen i histone acetylering forårsaket av HDAC hemming. Fordelene med denne analysen inkluderer lave kostnader, relativ letthet å utføre, og bruk av celler i kultur, noe som gir mer fysiologisk relevans enn testrøret HAT analyse. I likhet med HAT-analysen bruker denne protokollen standard immunoblotting for datainnsamling.

HAT- og ChHAI-analysene gir data om styrken av nye forbindelser for å hemme global histone acetylering, men gir ikke innsikt i hvordan disse forbindelsene påvirker modifikasjoner på bestemte genomiske regioner. Derfor er den endelige protokollen, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) et cellekultureksperiment som undersøker DNA-proteininteraksjoner på bestemte områder av genomet. I ChIP-protokollen er kromatin krysskoblet for å bevare DNA-proteininteraksjoner. Kromatin ekstraheres deretter fra celler, og DNA-proteinkomplekset gjennomgår selektiv immunforekomst for protein av interesse (f.eks. ved hjelp av et antistoff som er spesifikt for H3K27ac). DNA blir deretter renset og analysert ved hjelp av qPCR. For eksempel kan ChIP-qPCR brukes til å avgjøre om en roman HATi nedregerer histonesecetylering ved individuelle onkogener, for eksempel Cyclin D125. Mens ChIP-qPCR er en vanlig teknikk som brukes i feltet, kan det være vanskelig åoptimalisere 4,,10,,26. Denne protokollen inneholder tips for å unngå potensielle fallgruver som kan oppstå mens du utfører ChIP-qPCR-prosedyren, og inkluderer kvalitetskontrollkontroller som skal utføres på dataene.

Når de brukes sammen, tillater disse tre protokollene streng karakterisering og validering av romanen HATi. I tillegg tilbyr disse metodene mange fordeler fordi de er enkle å utføre, relativt billige og gir data om global samt regional histone acetylering.

Protocol

1. In vitro HAT-analyse Klargjøring av bufferMERK: Se tabell 1 for bufferoppskrifter. Forbered 5x analysebuffer og 6x natrium dodecylsulfat (SDS) og oppbevar ved -20 °C. Aliquot SDS i 1 ml aliquots. Forbered 10x SDS gel kjører buffer og 10x TBST og lagre ved romtemperatur. Forbered 1x overføringsbuffer og oppbevar ved 4 °C.FORSIKTIG: Kontroller sikkerhetsdatabladet for alle kjemikalier som brukes i denne protokollen. SDS, DTT og bromo…

Representative Results

In vitro histone acetyltransferase (HAT)-analysen kan brukes til å sondere for forbindelser som hemmer p300 HAT-aktivitet mot et histoneunderstrat. Figur 1A gir en eksperimentell skjematisk for HAT-analysen. Anacardinsyre, en kjent HATi3,38, ble brukt i denne analysen i et konsentrasjonsområde fra 12,5-100 μM. Ved 100 μM nedregregerer anakarinsyre p300 histone acetylering ved Histone 3, Lysines 9 og 18 versus kontrollen DMSO beha…

Discussion

Lysin acetyltransferaser (KATs) acetylat flere lysin rester på histone haler og transkripsjon faktorer for å regulere gentranskripsjon2,3. Arbeid i de siste to tiårene har avslørt at KATs, som CBP/p300, PCAF og GCN5, samhandler med onkogene transkripsjonsfaktorer og bidrar til å drive tumorvekst i flere solide tumortyper4,,5,,9,,15,</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra James og Esther King Biomedical Research Program (6JK03 og 20K07), og Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 og 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation og UF Health Cancer Center. I tillegg vil vi takke Dr. Zachary Osking og Dr. Andrea Lin for deres støtte under publiseringsprosessen.

Materials

1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129 For all methods
10 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3902 For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips Fisher Scientific 02-707-454 For all Methods
1000 ul tips Corning 4846 For all Methods
10X Glycine buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate Corning 3513 For Method 2
15 cm dish Sarstedt AG & Co. 83.3903 For Method 3
15 ml conical tube Santa Cruz Biotechnology sc-200249 For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips Corning 4844 For all Methods
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel Thermo Fisher: Invitrogen XP04205BOX For Methods 1 and 2
5X Assay buffer For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485 MedChemExpress HY-107455 CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody Cell Signaling Technology 4771 For Method 1
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2056 for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) Cell Signaling Technology CST 8173 antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) Cell Signaling Technology CST 9675 antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody Millipore Sigma T5168 For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid Cayman Chemical 13144 For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody Cell Signaling Technology 7076 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody Jackson ImmunoResearch 711-035-152 For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film MIDSCI BX810 For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform Stovall Life Science Incorporated not available For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS) HyClone SH30072.03 cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 for buffer preparation
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for SDS sample buffer preparation
CDTA Spectrum Chemical 125572-95-4 For buffer preparation
cell scraper Millipore Sigma CLS3010 For Method 3
ChIP dilution buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE Covaris 520045 Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator Covaris S220 DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 41639 for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815 for SDS sample buffer preparation
DMEM Corning 10-013-CV cell culture media
EDTA Fisher Scientific BP120-1 for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus Bio-rad 1704070 For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit Millipore Sigma 17-10086 For Method 3
FK228 (Romidepsin) Cayman Chemical 128517-07-7 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8775 for cell fixation
glycerol Fisher Scientific BP229-1 For buffer preparation
glycine Sigma-Aldrich G7126 for buffer preparation
HEPES Sigma-Aldrich 54457 for buffer preparation
High salt wash buffer For Method 3
IGEPAL (NP-40) Sigma-Aldrich I3021 for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate Millipore Sigma WBKLS0500 For Methods 1 and 2
KCl Fisher Scientific BP366-500 for buffer preparation
LiCl Sigma-Aldrich L9650 For buffer preparation
LiCl wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator Promega Z5341 For use in Method 3
Methanol Sigma-Aldrich 494437 For buffer preparation
Mini gel tank Invitrogen A25977 For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat) Cayman Chemical 209783-80-2 HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl Fisher Scientific 7647-14-5 for buffer preparation
NaOH Fisher Scientific S318-100 for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG Bethyl Laboratories P120-101 Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit Qiagen 28104 For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X Corning 30-002-CI cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-040-CV For Methods 2 and 3
PIPES Sigma-Aldrich 80635 for buffer preparation
powdered milk Nestle Carnation For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer Bio-rad For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running Bio-rad For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder Thermo Fisher 26616 For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich PI8340 for use in Method 3
Protein A Magentic Beads New England BioLabs S1425S For use in Method 3
Proteinase K New England BioLabs P8107S For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research Inc. PTC-100 For Method 1
PVDF Transfer Membrane Millipore Sigma IEVH00005 For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1 New England BioLabs M2503S for use in Method 1
Recombinant p300 ENZO Life Sciences BML-SE451-0100 for use in Method 1
SAHA (Vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide Fisher Scientific 26628-22-8 For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500 for buffer preparation
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71725 for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock VWR Scientific Products MPN: 949030 For Methods 1 and 2
Table top centrifuge Eppendorf 5417R For all methods
TE buffer For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A Cayman Chemical 58880-19-6 HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris Fisher Scientific BP152-5 for buffer preparation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 for buffer preparation
Tween 20 Sigma-Aldrich 9005-64-5 for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. SRX-101A For Methods 1 and 2

References

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. . Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020)
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute – University of Queensland Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020)
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

Play Video

Cite This Article
Waddell, A. R., Liao, D. Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (162), e61289, doi:10.3791/61289 (2020).

View Video