Protokollen beskriver en rask, høy gjennomstrømning, pålitelig, billig og objektiv analyse for effektivt å bestemme cellulær levedyktighet. Denne analysen er spesielt nyttig når cellenes mitokondrier har blitt skadet, noe som forstyrrer andre analyser. Analysen bruker automatisert telling av celler farget med to kjernefysiske fargestoffer – Hoechst 33342 og propidiumjodid.
Bidraget fra mitokondrier til onkogen transformasjon er gjenstand for bred interesse og aktiv studie. Etter hvert som feltet av kreftmetabolismen blir mer kompleks, blir målet om å målrette mitokondrier ved hjelp av ulike forbindelser som forårsaker mitokondrieskade (såkalte mitokaner) ganske populært. Dessverre krever mange eksisterende cytotoksisitetsanalyser, som de som er basert på tetrazoliumsalter eller resazurin funksjonelle mitokondrieenzymer for ytelsen. Skaden påført av forbindelser som retter seg mot mitokondrier, kompromitterer ofte nøyaktigheten av disse analysene. Her beskriver vi en modifisert protokoll basert på differensialfarging med to fluorescerende fargestoffer, hvorav den ene er cellepermeant (Hoechst 33342) og den andre som ikke er (propidiumjodid). Forskjellen i farging gjør at levende og døde celler kan diskrimineres. Analysen er mottagelig for automatisert mikroskopi og bildeanalyse, noe som øker gjennomstrømningen og reduserer skjevhet. Dette gjør det også mulig for analysen å bli brukt i høy gjennomstrømning mote ved hjelp av 96-brønnplater, noe som gjør det til et levedyktig alternativ for narkotika oppdagelse innsats, spesielt når de aktuelle stoffene har noen grad av mitotoxicity. Viktigere, resultatene oppnådd av Hoechst / PI farging analyse viser økt konsistens, både med trypan blå utelukkelse resultater og mellom biologiske replikere når analysen sammenlignes med andre metoder.
Det første trinnet for å identifisere effektive kreftbehandlinger er valg av en robust, objektiv cytotoksisitetsanalyse som kan brukes til å undersøke effekten av behandlingen. Et vanlig valg for eksperimenter med lav gjennomstrømning er utelukkelse av trypan blå fargestoff fra levende celler. Denne metoden favoriseres fordi den tillater en relativt objektiv metode for å kvantifisere celleoverlevelse. trypan blå passivt sprer seg i celler hvis membraner er kompromittert, men det er effektivt blokkert fra å komme inn i friske celler1. Kvotienten til de levende cellene og de totale cellene representerer prosentleveligheten, noe som indikerer effekten av behandlingen. Den viktigste ulempen med trypan blå analyse er at den er dårlig egnet for høy gjennomstrømningsmetoder. Den har et relativt lavt signal-til-støy-forhold, og langvarig farging kan resultere i artefakter på grunn av farging av levedyktige celler. Følgelig er trypan blå ekskludering vanligvis, men ikkealltid 2, henvist til manuell telling. Dette gjør det for sakte og introduserer den sterke muligheten for skjevhet på grunn av subjektiv dom fra forskeren (med mindre blending eller uavhengige tellinger brukes, noe som ytterligere reduserer laboratoriegjennomstrømningen). Generelt er gjennomstrømningen av denne analysen utilstrekkelig for moderne narkotikaoppdagelse.
Levedyktighetsanalyser, som vanligvis har en mye høyere gjennomstrømning, tillater forskere å omgå denne begrensningen, men kommer med betydelige advarsler (se tabell 1). Disse metodene faller vanligvis inn i to grupper. En gruppe består av kolorimetriske analyser som er basert på funksjonen til cellulære redoksenzymer. Fargeløse eller ikke-fluorescerende substrater omdannes til levende produkter som kan kvantifiseres ved hjelp av et spektrofotometer. Klassiske eksempler inkluderer tetrazoliumsalter (MTT, WST-1, XTT osv.) og resazurin. Denne kategorien inkluderer også selvlysende analyser som bruker luciferin for å evaluere ATP-nivå. Analyser av denne typen har den underliggende begrensningen at de måler cellulær metabolisme, som ikke er cellulær levedyktighet per se. Det er ganske vanlig for celler å bli quiescent under ugunstige forhold, men fortsatt beholde evnen til ådele 3,4,5. For eksempel er kreft stamceller ofte relativt metabolsk quiescent6,7,8,9, og er sannsynlig å være vanskelig å analysere ved hjelp av disse teknikkene. Effektiviteten av behandlinger som skader mitokondriefunksjonen, som de fleste mitokaner, er også sannsynlig å bli betydelig overvurdert.
En alternativ metodikk utnytter de kjemiske egenskapene til ulike stoffer som tillater dem å enten krysse eller ikke krysse biologiske membraner. Et eksempel er kjernefysiske flekker som SYTOX eller propidiumjodid (PI). Denne kategorien inkluderer også analyser som er like i konseptet, men forskjellige i funksjon, for eksempel laktatdehydrogenase (LDH) analyse, som måler utgivelsen av LDH i det ekstracellulære miljøet som en indikator på cellulær nekrose (figur 1, tabell 1). Disse analysene er mer i stand til å skille mellom metabolsk inaktive og døde celler.
Analyse/fargestoff | Type(er) av celledød oppdaget | Nødvendig utstyr | Viktige funksjoner |
MTT, CKK-8, Alamar Blå (resazurin) | Apoptose/nekrose | Spektrofotometer | Billig, rask; endepunktanalyse; avhengig av enzymers aktivitet (utelukkende mitokondrie i tilfelle MTT) og diskriminerer ikke mellom moduser forcelledød 1,10 |
LDH-utgivelse | Nekrose | Spektrofotometer | Rask, uavhengig av mitokondrieenzymers aktivitet; dyrt for høy gjennomstrømningstester; nekrotiske celler med kompromisert plasmamembran11,12 |
Trypan Blå (TB) | Apoptose/nekrose | Mikroskop | Celle-impermeant; diskriminerer ikke mellom moduser for celledød; arbeidskrevende og ikke egnet for screening med høy gjennomstrømming; vanskeligere å bruke med tiltalende celler; utsatt for subjektiv vurdering av brukeren, men regnes som standard celle levedyktighetsmålingsmetode13 |
Acridine oransje (AO) | Apoptose/nekrose/ | Fluorescensmikroskop | En nukleinsyre fargestoff med unike spektrale egenskaper, kan skille mellom apoptose og nekrose / necroptosis14 |
Nekroptose | |||
Hoechst 33342, DAPI | Apoptose | Fluorescensmikroskop eller strømningscytometer | Cellegjennomtrengelig; upassende alene for å overvåke celledød; nyttig for co-farging; kan brukes til å vurdere kromatinkondensasjon og kjernefragmentering tidlig apoptose; kan pares med propidiumjodid for å skille apoptose fra nekrose15,16 |
Propidiumjodid (PI) | Sen apoptose/nekrose | Fluorescensmikroskop eller strømningscytometer | Celleimpermeant intercalator; oppdager både sen apoptose og nekrose moduser av celledød17. Giftig og gjennomtrengelig etter lange inkubasjonstider18 |
Tabell 1. Liste over cytotoksisitetsanalyser. Cytotoksisitetsanalyser, hvorav noen ble brukt i denne studien, oppført sammen med den korte beskrivelsen av deres viktigste funksjoner.
Nyere studier har vist at mitokondriemetabolismen er endret hos noenkreftformer 19,20,21,22,23,24,25. For eksempel har akutt myelogen leukemi (AML) vist seg å oppregulere deres mitokondriemasse, mtDNA-innhold og mitokondrierespirasjon for å møte deres energibehov19,26,27. På den annen side er noen faste svulster preget av mitokondriedysfunksjon, eller rettere sagt “metabolsk omprogrammering”, for eksempel nedregulering av mitokondrieproteiner involvert i OXPHOS eller redusert mtDNA-innhold, som har vært forbundet med tumorinvasivitet, metastatisk potensial og motstand mot apoptosefremkallendelegemidler 28,29. Videre har det nylig vært en økt interesse for å bruke mekanistisk forskjellige forbindelser som påvirker mitokondriefunksjonen (vanligvis kalt mitokaner30),som potensielle behandlinger for bestemte kreftformer. Disse stoffene retter seg mot ATP-syntese, mitokondrie-DNA, OXPHOS og ROS-produksjon, samt pro-apoptotiske og antipoptotiske proteiner forbundet med mitokondrier30,31. Flere studier har vist at denne tilnærmingen har betydelig løfte19,32,33,34. Imidlertid kan disse metabolske avvikene i kreftcellebiologi eller mitokondrier-målretting behandlinger betydelig påvirke konvensjonelle levedyktighetsanalyser som er basert på mitokondriefunksjonalitet.
Her er en optimalisert protokoll for en differensial kjernefysisk farging analyse beskrevet. Protokollen tillater rask og nøyaktig bestemmelse av cytotoksisitet av mitokaner eller deres kombinasjoner med andre forbindelser. Hoechst 33342 er en celle-permeant kjernefysisk fargestoff som lett krysser cellemembraner å flekke DNA, slik at den totale celleantallet kan oppnås. Ved å sameksiere med PI, som bare kommer inn i kjernene av døde celler, kan andelen levende (kun Hoechst) og døde (farget med begge) celler bestemmes nøyaktig. Denne protokollen foredler den publiserte analysen35 ved å legge til et trinn for optimalisering av fargekonsentrasjonen (ved å kryssreferere resultater med ortogonal trypan blå metode) og sentrifugering av platen før avbildning. Siden mange cellelinjer er semi-tilhenger eller suspendert, øker sentrifugering andelen celler som er avbildet og forbedrer nøyaktigheten sterkt. Analysen har flere fordeler, inkludert at farging ikke krever fjerning av media eller vasking. Fargestoffblandingen er også billig, enkel å tilberede og kompatibel med flerkanals /robotpipetteringssystemer.
Etter at cellene er farget, blir de avbildet med et automatisert mikroskop. Dette har den ekstra fordelen av å opprette en permanent oversikt over bildene som kan analyseres på nytt senere, og effekten av bestemte forbindelser kan evalueres på nytt ved visuell inspeksjon av tatt bilder. Når bilder er innhentet, kan celler telles enten manuelt eller ved å bruke noen av flere programvarepakker, inkludert både gratis (f.eks. ImageJ, CellProfiler, etc) og kommersiell programvare (f.eks. Metamorph, Gen5, etc). Automatisert celletelling er generelt å foretrekke siden riktig utviklede automatiserte celletellingsrørledninger er mer nøyaktige og mindre partisk enn manuelle tellinger. De ser også mer effektivt bort fra celleavfall eller uoppløselige komplekser. Utviklingen av disse rørledningene er generelt enkel og forenkles av effektiviteten av flekkene som brukes. Utdataene er kvantitative siden det faktiske antallet døde celler beregnes automatisk med hensyn til totalt cellenummer, og ulike terskler kan brukes til å øke eller redusere strengen avdeteksjon 35. For enkelhets skyld er optimaliserte parametere for å telle celler ved hjelp av Gen5 v. 3.00 programvarekompatibel Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader inkludert.
Selv om protokollen for Hoechst/PI cytotoksisitetsanalyse er robust og krever relativt lite praktisk tid, er det flere eksperimentelle detaljer som er svært viktige for å sikre nøyaktige resultater. For det første er det viktig å sørge for at konsentrasjonen av DMSO forblir under 0,5% (v / v). Det er generelt avtalt at eksponering for selv lave doser av DMSO kan vesentlig endre morfologi og vedlegg av celler og betydelig forsinke celle syklusprogresjon 39,40</sup…
The authors have nothing to disclose.
NVK, en CPRIT forsker i kreftforskning, takker Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) for deres sjenerøse støtte, CPRIT-stipend RR150044. Dette arbeidet ble også støttet av Welch Foundation Research Grant C-1930, og av National Institutes of Health R35 GM129294 tildelt NVK. Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Cell lines | |||
K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |