प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए एक तेजी से, उच्च थ्रूपुट, विश्वसनीय, सस्ती, और निष्पक्ष परख का वर्णन करता है। यह परख विशेष रूप से उपयोगी है जब कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान पहुंचा है, जो अन्य परखों में हस्तक्षेप करता है। परख दो परमाणु रंगों के साथ दाग कोशिकाओं की स्वचालित गिनती का उपयोग करता है-Hoechst ३४२ और प्रोपिडियम आयोडाइड ।
ओंकोजेनिक परिवर्तन के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का योगदान व्यापक रुचि और सक्रिय अध्ययन का विषय है। चूंकि कैंसर चयापचय का क्षेत्र अधिक जटिल हो जाता है, इसलिए माइटोकॉन्ड्रिया को विभिन्न यौगिकों का उपयोग करके लक्षित करने का लक्ष्य जो माइटोकॉन्ड्रियल क्षति (तथाकथित माइटोकॉन) को दण्ड देते हैं, काफी लोकप्रिय हो रहा है। दुर्भाग्य से, कई मौजूदा साइटोटॉक्सीसिटी परख, जैसे टेट्राज़ोलियम साल्ट या रेसाज़ुरिन पर आधारित लोगों को अपने प्रदर्शन के लिए कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइमों की आवश्यकता होती है। माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित करने वाले यौगिकों द्वारा दिए गए नुकसान अक्सर इन परख की सटीकता से समझौता करते हैं। यहां, हम दो फ्लोरोसेंट रंगों के साथ अंतर धुंधला के आधार पर एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिनमें से एक सेल-परमीट (Hoechst 33342) है और दूसरा है (प्रोपिडियम आयोडाइड)। धुंधला में अंतर रहने और मृत कोशिकाओं के साथ भेदभाव करने की अनुमति देता है । परख स्वचालित माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है, जो थ्रूपुट को बढ़ाता है और पूर्वाग्रह को कम करता है। यह 96-अच्छी प्लेटों का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट फैशन में उपयोग करने की अनुमति देता है, जिससे यह दवा खोज प्रयासों के लिए एक व्यवहार्य विकल्प बन जाता है, खासकर जब प्रश्न में दवाओं में कुछ स्तर की माइटोटेक्सिकिटी होती है। महत्वपूर्ण बात, Hoechst द्वारा प्राप्त परिणाम/PI धुंधला परख में वृद्धि हुई निरंतरता दिखाने के लिए, दोनों trypan नीले बहिष्कार परिणामों के साथ और जैविक प्रतिकृति के बीच जब परख अंय तरीकों की तुलना में है ।
प्रभावी कैंसर उपचार की पहचान करने के लिए पहला कदम एक मजबूत, निष्पक्ष साइटोटॉक्सिकिटी परख का चयन है जिसका उपयोग उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है। कम थ्रूपुट प्रयोगों के लिए एक आम विकल्प जीवित कोशिकाओं से ट्राइपैन ब्लू डाई का बहिष्कार है। यह विधि इष्ट है क्योंकि यह सेल अस्तित्व की मात्रा निर्धारित करने के लिए अपेक्षाकृत निष्पक्ष विधि की अनुमति देता है। ट्राइपैन ब्लू निष्क्रिय रूप से कोशिकाओं में फैलता है जिनकी झिल्ली से समझौता किया जाता है, लेकिन यह प्रभावी रूप से स्वस्थ कोशिकाओं में प्रवेश करने से अवरुद्ध हो जाता है1. जीवित कोशिकाओं और कुल कोशिकाओं का भागफल प्रतिशत व्यवहार्यता का प्रतिनिधित्व करता है, जो उपचार की प्रभावकारिता को इंगित करता है। ट्राइपैन ब्लू परख का सबसे महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि यह उच्च-थ्रूपुट पद्धतियों के लिए खराब अनुकूल है। इसमें अपेक्षाकृत कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात है और लंबे समय तक धुंधला होने के परिणामस्वरूप व्यवहार्य कोशिकाओं के धुंधला होने के कारण कलाकृतियों में प्रवेश हो सकता है। नतीजतन, ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन आमतौर पर होता है, लेकिन हमेशा2नहीं, मैनुअल गिनती में चला जाता है। यह इसे बहुत धीमा बनाता है और शोधकर्ता के व्यक्तिपरक निर्णय के कारण पूर्वाग्रह की मजबूत संभावना का परिचय देता है (जब तक कि चकाचौंध या स्वतंत्र गिनती का उपयोग नहीं किया जाता है, जो प्रयोगशाला थ्रूपुट को और कम करता है)। सामान्य तौर पर, इस परख का थ्रूपुट आधुनिक दवा खोज के लिए अपर्याप्त है।
व्यवहार्यता परख, जिसमें आम तौर पर बहुत अधिक थ्रूपुट होता है, शोधकर्ताओं को इस सीमा को दरकिनार करने की अनुमति देता है, लेकिन महत्वपूर्ण चेतावनी के साथ आते हैं (तालिका 1देखें)। ये तरीके आम तौर पर दो समूहों में आते हैं। एक समूह में कोलोरिमेट्रिक परख शामिल है जो सेलुलर रेडॉक्स एंजाइमों के कार्य पर आधारित है। बेरंग या गैर-फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट्स जीवंत उत्पादों में परिवर्तित हो जाते हैं जिन्हें स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। क्लासिक उदाहरणों में टेट्राज़ोलियम साल्ट (एमटीटी, डब्ल्यूएसटी-1, एक्सटीटी, आदि) और रेसाज़ुरिन शामिल हैं। इस श्रेणी में ल्यूमिनेसेंट परख भी शामिल है जो एटीपी स्तर का मूल्यांकन करने के लिए लूसिफ़ेरिन का उपयोग करता है। इस प्रकार के परख में अंतर्निहित सीमा है कि वे सेलुलर चयापचय को माप रहे हैं, जो सेलुलर व्यवहार्यता प्रति से नहीं है। कोशिकाओं के लिए प्रतिकूल परिस्थितियों में शांत होना काफी आम है, लेकिन फिर भी3,4, 5को विभाजित करने की क्षमता को बनाएरखतेहैं। उदाहरण के लिए, कैंसर स्टेम सेल अक्सर अपेक्षाकृत चयापचय रूपसे शांत6,7,8,9होते हैं, और इन तकनीकों का उपयोग करके परख करना मुश्किल होने की संभावना होती है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को नुकसान पहुंचाने वाले उपचारों की प्रभावशीलता, जैसे कि अधिकांश माइटोकॉन्सन, भी काफी अधिक अनुमान लगाए जाने की संभावना है।
एक वैकल्पिक पद्धति विभिन्न पदार्थों के रासायनिक गुणों का लाभ उठाती है जो उन्हें या तो पार करने या जैविक झिल्ली को पार करने की अनुमति नहीं देती है। इसका एक उदाहरण परमाणु दाग जैसे SYTOX या प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) हैं। इस श्रेणी में परख भी शामिल है जो अवधारणा में समान हैं, लेकिन कार्य में अलग हैं, जैसे लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) परख, जो सेलुलर नेक्रोसिस(चित्र 1,तालिका 1)के संकेतक के रूप में एलडीएच की रिहाई को बाहेती परिवेश में मापता है। ये परख चयापचय रूप से निष्क्रिय और मृत कोशिकाओं के बीच भेद करने में अधिक सक्षम हैं।
परख/डाई | सेल डेथ के प्रकार (एस) का पता चला | आवश्यक उपकरण | मुख्य विशेषताएं |
MTT, CKK-8, अलामार ब्लू (resazurin) | एपोप्टोसिस/नेक्रोसिस | स्पेक्ट्रोफोटोमीटर | सस्ती, तेजी से; अंत बिंदु परख; एंजाइमों की गतिविधि पर निर्भर (एमटीटी के मामले में विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल) और सेल मृत्यु के तरीकों के बीच भेदभाव नहीं करता है1,10 |
एलडीएच रिलीज | नेक्रोसिस | स्पेक्ट्रोफोटोमीटर | तेजी से, माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइमों की गतिविधि से स्वतंत्र; उच्च थ्रूपुट परीक्षणों के लिए महंगा; कॉम्प्रोमाइज्ड प्लाज्मा झिल्ली के साथ गल-पर्कीय कोशिकाओं का पता लगाता है11,12 |
ट्राइपन ब्लू (टीबी) | एपोप्टोसिस/नेक्रोसिस | सूक्ष्मदर्शी | सेल-अभेद्य; सेल मृत्यु के तरीकों के बीच भेदभाव नहीं करता है; श्रमसतक और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है; अनुयायी कोशिकाओं के साथ उपयोग करना अधिक कठिन; उपयोगकर्ता के व्यक्तिपरक निर्णय से ग्रस्त है, लेकिन मानक सेल व्यवहार्यता माप विधि13 माना जाता है |
एक्रिडीन नारंगी (एओ) | एपोप्टोसिस/नेक्रोसिस/ | फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप | अद्वितीय स्पेक्ट्रल गुणों के साथ एक न्यूक्लिक एसिड डाई, एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस/नेक्रोप्टोसिस14 के बीच अंतर कर सकता है |
नेक्रोप्टोसिस | |||
होचस्ट 33342, डीएपीआई | एपोप्टोसिस | फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप या फ्लो साइटोमीटर | सेल-पारमीबल; सेल मौत की निगरानी करने के लिए अपने दम पर अनुचित; सह-धुंधला के लिए उपयोगी; जल्दी एपोप्टोसिस में क्रोमेटिन संघनन और नाभिक विखंडन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; एपोप्टोसिस को नेक्रोसिस15,16 से अलग करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ जोड़ा जा सकता है |
प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) | स्वर्गीय एपोप्टोसिस/नेक्रोसिस | फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप या फ्लो साइटोमीटर | सेल-अभेद्य इंटरकैलेटर; सेल डेथ17के दोनों लेट एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस मोड का पता लगाता है . विषाक्त और पारम करने योग्य लंबे समय के बाद18 इनक्यूबेशन बार |
तालिका 1. साइटोटॉक्सिकिटी परख की सूची। साइटोटॉक्सिकिटी परख, जिनमें से कुछ का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था, जो उनकी प्रमुख विशेषताओं के संक्षिप्त विवरण के साथ सूचीबद्ध थे।
हाल के अध्ययनों से पता चला है कि माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबॉलिज्म19, 20,21 , 22,23,24,25में बदल जाता है । उदाहरण के लिए, तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमियास (एएमएल) को उनकी ऊर्जा मांगों को पूरा करने के लिए अपने माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान, एमटीडीएनए सामग्री और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को अपरेग करने के लिए दिखाया गया है19,26,27। दूसरी ओर, कुछ ठोस ट्यूमर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, या बल्कि “मेटाबोलिक रीप्रोग्रामिंग” की विशेषता है, जैसे ऑक्सफोस में शामिल माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का डाउनरेगुलेशन या एमटीडीएनए सामग्री में कमी आई है, जो ट्यूमर इनवेसिवनेस, मेटास्टैटिक क्षमता और एकपॉपेटोसिस-उत्प्रेरण दवाओं के प्रतिरोध से जुड़ा हुआ है28,29। इसके अलावा, हाल ही में, विशेष कैंसर के लिए संभावित उपचारों के रूप में, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन (जिसे आमतौर पर माइटोकॉन्स30कहा जाता है) को प्रभावित करने वाले मशीनी विविध यौगिकों का उपयोग करने में रुचि बढ़ी है। ये दवाएं एटीपी संश्लेषण, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए, ऑक्सफोस और आरओएस उत्पादन के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रिया30, 31से जुड़े प्रो-एपोटोटिक और एंटी-एपोटोटिक प्रोटीन को लक्षित करती हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि इस दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण वायदा है19,32,33,34. हालांकि, कैंसर सेल जीव विज्ञान या माइटोकॉन्ड्रिया-टार्गेटिंग उपचारों में ये मेटाबॉलिक विचलन पारंपरिक व्यवहार्यता परख को काफी प्रभावित कर सकते हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल कार्यक्षमता पर आधारित हैं।
यहां, एक अंतर परमाणु धुंधला परख के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल वर्णित है । प्रोटोकॉल मिटोकान या अन्य यौगिकों के साथ उनके संयोजनों के साइटोटॉक्सिटी के तेज और सटीक निर्धारण की अनुमति देता है। Hoechst 33342 एक सेल-पारमी परमाणु डाई है जो आसानी से कोशिका झिल्ली को पार कर डीएनए दाग देता है, जिससे कुल सेल काउंट प्राप्त होता है। पीआई के साथ सह-धुंधला करके, जो केवल मृत कोशिकाओं के नाभिक में प्रवेश करता है, जीवित रहने का अनुपात (केवल Hoechst) और मृत (दोनों के साथ दाग) कोशिकाओं को सही ढंग से निर्धारित किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल डाई एकाग्रता के अनुकूलन के लिए एक कदम जोड़कर प्रकाशित परख35 को परिष्कृत करता है (ऑर्थोगोनल ट्राइपैन ब्लू विधि के साथ क्रॉस-रेफरेंसिंग परिणाम द्वारा) और इमेजिंग से पहले प्लेट का अपकेंद्री। चूंकि कई सेल लाइनें अर्ध-अनुयायी या निलंबित होती हैं, इसलिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाता है जो छवि वाले होते हैं और दृढ़ता से सटीकता में सुधार करते हैं। परख के कई फायदे हैं, जिनमें यह धुंधला भी शामिल है कि मीडिया या धोने को हटाने की आवश्यकता नहीं है। डाई मिश्रण भी सस्ती है, तैयार करने में आसान है, और मल्टीचैनल/रोबोट पिपटिंग सिस्टम के साथ संगत है ।
कोशिकाओं को दाग देने के बाद, उन्हें स्वचालित माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया जाता है। इसमें छवियों का एक स्थायी रिकॉर्ड बनाने का अतिरिक्त लाभ है जिसे बाद में फिर से विश्लेषण किया जा सकता है और विशेष यौगिकों के प्रभावों को कैप्चर की गई छवियों के दृश्य निरीक्षण द्वारा फिर से मूल्यांकन किया जा सकता है। एक बार छवियां प्राप्त हो जाने के बाद, कोशिकाओं को या तो मैन्युअल रूप से या कई सॉफ्टवेयर पैकेजों में से किसी का उपयोग करके गिना जा सकता है, जिसमें मुफ्त (जैसे, इमेजजे, सेलप्रोफिलर, आदि) और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (जैसे, कायापलट, जेन5, आदि) शामिल हैं। स्वचालित सेल गिनती आम तौर पर बेहतर है क्योंकि ठीक से विकसित स्वचालित सेल गिनती पाइपलाइन मैनुअल गिनती की तुलना में अधिक सटीक और कम पक्षपातपूर्ण हैं। वे सेल मलबे या अघुलनशील परिसरों की भी अधिक प्रभावी ढंग से उपेक्षा करते हैं। इन पाइपलाइनों का विकास आम तौर पर सीधा होता है और उपयोग किए जाने वाले दागों की दक्षता से सरल होता है। आउटपुट मात्रात्मक है क्योंकि मृत कोशिकाओं की वास्तविक संख्या की गणना कुल सेल संख्या के संबंध में स्वचालित रूप से की जाती है, और विभिन्न थ्रेसहोल्ड को पहचान35की स्ट्रिंगेंसी को बढ़ाने या कम करने के लिए लागू किया जा सकता है। सुविधा के लिए, Gen5 v. 3.00 सॉफ्टवेयर संगत साइटेशन 5 सेल इमेजिंग मल्टी-मोड रीडर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती के लिए अनुकूलित पैरामीटर शामिल हैं।
हालांकि Hoechst/PI साइटोटॉक्सिकिटी परख के लिए प्रोटोकॉल मजबूत है और तुलनात्मक रूप से कम हाथों की समय पर आवश्यकता है, वहां कई प्रयोगात्मक विवरण है कि सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं । स?…
The authors have nothing to disclose.
एनवीके, कैंसर रिसर्च में एक CPRIT विद्वान, कैंसर की रोकथाम और टेक्सास के अनुसंधान संस्थान (CPRIT) उनके उदार समर्थन के लिए धन्यवाद, CPRIT अनुदान RR150044. इस काम को वेल्च फाउंडेशन रिसर्च ग्रांट सी-1 9 30 द्वारा और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा एनवीके को सम्मानित किया गया था। फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।
2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Cell lines | |||
K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |