इस प्रोटोकॉल का उपयोग हैचिंग से पहले अंडे के मामलों (ओथेके) को स्टरलाइज करके ग्लोटोबायोटिक अमेरिकी तिलचट्टे(पेरिप्लैनेटा अमेरिकाना)को स्थापित करने और बनाए रखने में किया जाता है। इन gnotobiotic कीड़ों में उनके खड़ी संचारित ब्लैटबैक्टीरियम एंडोसिम्बियन होते हैं लेकिन एक्सोनिक हिम्मत होती है।
Gnotobiotic जानवरों माइक्रोबायोम संरचना और समारोह पर नियंत्रण के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। यहां प्रस्तुत gnotobiotic अमेरिकी तिलचट्टे(Periplaneta अमेरिकाना)की स्थापना और रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल है । इस दृष्टिकोण में चल रहे गुणवत्ता नियंत्रण के लिए अंतर्निहित बंध्यता जांच शामिल है। Gnotobiotic कीड़े यहां तिलचट्टे के रूप में परिभाषित कर रहे हैं जो अभी भी उनके खड़ी संचारित एंडोसिम्बिओन्ट(ब्लैटबैक्टीरियम)होते हैं, लेकिन अन्य रोगाणुओं की कमी होती है जो आम तौर पर उनकी सतह पर और उनके पाचन तंत्र में रहते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, अंडे के मामलों (ओथेके) को एक (गैर बाँझ) स्टॉक कॉलोनी और सतह निष्फल से हटा दिया जाता है। एक बार एकत्र और निष्फल होने के बाद, ओथेक को मस्तिष्क-हृदय जलसेक (बीएचआई) आगर पर लगभग 4−6 सप्ताह के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया जाता है जब तक कि वे हैच न करें या संदूषण के कारण हटा दिए जाएं। रची नस्लों को एक एर्लेनमेयर फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया जाता है जिसमें एक बीएची मंजिल, बाँझ पानी और बाँझ चूहा भोजन होता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि नस्लें आवास रोगाणु नहीं हैं जो दिए गए परिस्थितियों में बीएचआई पर विकसित करने में असमर्थ हैं, एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण उपाय गैर-जन्म्यबायोटिक रोगाणुओं के लिए परीक्षण करने के लिए प्रतिबंध खंड-लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) का उपयोग करता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके उत्पन्न Gnotobiotic नस्लों को सरल या जटिल माइक्रोबियल समुदायों के साथ टीका लगाया जा सकता है और आंत माइक्रोबायोम अध्ययनों में एक उपकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
ग्नोटोबायोटिक पशु माइक्रोबायोम अध्ययन के लिए अमूल्य साधन साबितहुएहैं 1,2,3. रोगाणु मुक्त और परिभाषित-वनस्पति जानवरों ने मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन की स्पष्टता की अनुमति दी है, जिसमें मेजबान इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रियाएं, आंत एपिथेलियल परिपक्वता, और मेजबान मेटाबोलिज्म1,4,5,6, 7शामिल हैं। एक सरलीकृत समुदाय के साथ टीका लगाने वाले Gnotobiotic जानवरों ने भी एक आंत समुदाय में माइक्रोब-माइक्रोब इंटरैक्शन की अधिक पूरी समझ में सहायता की है, विशेष रूप से क्रॉस-फीडिंग और विरोधी संबंधों को सुलझाने में8,9,10, 11। स्तनधारी आंत माइक्रोबायोम में अध्ययन के लिए वर्तमान पसंदीदा मॉडल प्रणाली मुरीन मॉडल है। हालांकि इस प्रणाली के ऊपर उल्लिखित खोजों में महत्वपूर्ण रहा है, एक महत्वपूर्ण कमी शामिल लागत है । एक जनोटोबायोटिक सुविधा स्थापित करने और बनाए रखने के लिए विशेष उपकरण और उच्च प्रशिक्षित तकनीशियन आवश्यक हैं। यह, अतिरिक्त देखभाल के साथ संयोजन में जो जीनोटोबायोटिक पशु रखरखाव के हर पहलू को दिया जाना चाहिए, एक जीनोटोबायोटिक जानवर को एक मानक पशु मॉडल12की तुलना में नस्ल के लिए दस से बीस गुना अधिक खर्च करने का कारण बनता है। उच्च लागत के कारण, कई शोधकर्ताओं ने एक gnotobiotic murine मॉडल बर्दाश्त करने में असमर्थ हो सकता है । इसके अतिरिक्त, जबकि मुरीन मॉडल मानव स्वास्थ्य के लिए अनुवाद करने के लिए देख अध्ययन के लिए सबसे व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं, वहां अभी भी मानव और माउस हिंमत13के बीच कई शारीरिक और रूपात्मक मतभेद हैं । स्पष्ट रूप से कोई विलक्षण मॉडल आंत माइक्रोबायोम के कई पहलुओं के बारे में सवालों की बढ़ती संख्या का जवाब देने के लिए पर्याप्त है ।
कीट मॉडल स्तनधारी प्रजातियों की तुलना में उनकी कम लागत के रखरखाव के कारण एक सस्ता विकल्प है। विभिन्न प्रकार की कीट प्रजातियों में व्यापक रोगाणु मुक्त और gnotobiotic अनुसंधान ने कई आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मॉडलों का विकास किया है। मच्छर और ड्रोसोफिला वैश्विक रोगों और आनुवंशिक अनुरेखा14,15के लिए उनकी प्रासंगिकता के कारण रोगाणु मुक्त काम के लिए आम मॉडल हैं। एक अन्य उभरती हुई मॉडल प्रणाली शहद मधुमक्खी(एपीआईएस मेलिफारा)की है , जो परागण और सामाजिकता अनुसंधान में इसके महत्व को देखतेहुए 16 हालांकि, इनमें से कई आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली कीड़ों में स्तनधारी आंत समुदायों17में देखी गई वर्गीकरण जटिलता की कमी होती है, जो उच्च क्रम की बातचीत को मॉडल करने की उनकी क्षमता को सीमित करती है। न केवल अमेरिकी तिलचट्टे के पेट में पाए जाने वाले रोगाणुओं की कुल विविधता स्तनधारियों के समान है, बल्कि तिलचट्टे के पेट में मौजूद कई रोगाणु परिवारों और फायला से संबंधित हैं जो आमतौर पर स्तनधारियों और मनुष्यों के आंत माइक्रोबायोटा में पाए जाते हैं18। तिलचट्टा का हिंडगट स्तनधारियों की बड़ी आंत के अनुरूप भी है, क्योंकि यह पोषक तत्वों के निष्कर्षण में सहायता करने के लिए बैक्टीरिया से भरा एक किण्वन कक्ष है19,20। अंत में, तिलचट्टे की सर्वव्यापी प्रकृति आहार व्यवस्थाओं की विविधता के लिए अनुमति देती है जो आहार विशेषज्ञों के साथ संभव नहीं होगी।
अमेरिकी तिलचट्टे उच्च जीवों में आंत माइक्रोबियल समुदायों को समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली हो सकती है, लेकिन कीट के रूप में तिलचट्टे की स्थिति भी इस प्रणाली को कीट नियंत्रण21के लिए प्रासंगिक बनाती है। तिलचट्टा स्वास्थ्य और शरीर विज्ञान पर आंत समुदाय के प्रभाव के मौलिक ज्ञान का लाभ कीट प्रबंधन के लिए नई तकनीकों को विकसित करने में सहायता करता है।
इस विधि का लक्ष्य जनोटोबायोटिक अमेरिकी तिलचट्टे(पेरिप्लैनेटा अमेरिकाना)की स्थापना और रखरखाव का व्यापक विवरण तैयार करना है, लेकिन इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी अंडाशय तिलचट्टे की नस्लों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इसमें परिपक्व ओथेक के कुशल, गैर-विकासात्मक संग्रह के लिए एक विधि और कीड़ों की जनोटोबायोटिक स्थिति की निगरानी के लिए एक गैर-विनाशकारी तकनीक शामिल है22,23,24। जबकि gnotobiotic तिलचट्टे को प्राप्त करने और बनाए रखने के पिछले तरीकों में ओथेकासंग्रह23, 24,25,26,27, 27का वर्णन किया गया है, ऊथेका परिपक्वता या तो प्रजातियों के विशिष्ट संकेतों (ब्लैटेला जर्मनिका22, 24,25में) के संदर्भ में व्याख्या की जाती है, या स्पष्ट रूप से27,28वर्णित नहीं है, जो सिस्टम से अपरिचित लोगों के लिए कार्यान्वयन को मुश्किल बना देता है। चूंकि यहां वर्णित विधि स्वाभाविक रूप से गिराए गए ओथेक का उपयोग करती है, इसलिए समय से पहले अंडे हटाने की त्रुटि अनुपस्थित है। इस प्रोटोकॉल में गुणवत्ता नियंत्रण के संस्कृति-निर्भर और संस्कृति-स्वतंत्र तरीके दोनों शामिल हैं, और संस्कृति पर निर्भर विधि को कीड़ों का त्याग करने की आवश्यकता नहीं है। अंत में, यह विधि कई जनोटोबायोटिक तिलचट्टे अध्ययनों से जानकारी लाती है ताकि जनोटोबायोटिक तिलचट्टे को प्राप्त करने और बनाए रखने के लिए सभी आवश्यक जानकारी के साथ एक, व्यापक प्रोटोकॉल बनाया जा सके।
जनोटोबायोटिक तिलचट्टे के उत्पादन का वर्णन करने वाले अन्य तरीकों में या तो ओथेके संग्रह का वर्णन नहीं किया गया था या अन्य तिलचट्टे प्रजातियों के लिए विशिष्ट बेंचमार्क का उपयोग किया गया था ताकि यह इंगित किया जा सके कि ओथेके कोमां23, 25,26से हटाया जा सकता है। मूल रूप से, ओथेक को स्टॉक टैंकों में वुडचिप बिस्तर से एकत्र किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप बहुत कम हैच दरें (~ 10%) नॉनस्टेरिलाइज्ड ओथेके (47%)29की तुलना में . यह इस तथ्य के कारण होने की संभावना है कि स्टॉक पिंजरे में समय के साथ अनहैच्ड ओथेके जमा होता है, और ओथेका उम्र या व्यवहार्यता को सत्यापित करने का कोई तरीका नहीं है। “प्रसूति वार्ड” दृष्टिकोण के कार्यान्वयन से ज्ञात आयु के हौसले से जमा oothecae के संग्रह की अनुमति देता है। यह आगे प्रयोगात्मक योजना की सुविधा है, के रूप में शोधकर्ता व्यक्तिगत oothecae के लिए संभावित हैच समय की आशा कर सकते हैं । प्रारंभिक और प्रकाशित प्रोटोकॉल से एक और संशोधन में अर्ध-सीलबंद कक्षों में ओथेके और नस्लों की इनक्यूबेशन भी शामिल है जिसमें सुपरसैचुरेटेड सोडियम क्लोराइड समाधान होता है। समाधान की उपस्थिति लगभग 75%30की सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखती है। Oothecae नियमित रूप से 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड कर रहे हैं, जो इनक्यूबेशन के लिए आवश्यक दिनों की संख्या को कम करने के लिए दिखाया गया है, जबकि भी भ्रूण की व्यवहार्यता और ootheca31प्रति उत्पादित नस्लों की संख्या को अधिकतम । हैचिंग के बाद, ग्लोटोबायोटिक नस्लों को प्रयोगशाला कक्ष के तापमान और परिवेश की स्थितियों पर बेंचटॉप पर नियमित रूप से सुसंस्कृत किया जाता है, हालांकि आर्द्रता-नियंत्रित कक्षों का उपयोग महत्वपूर्ण प्रयोगों के लिए फिर से किया जाता है। ootheca संग्रह और इनक्यूबेशन में इन परिवर्तनों की स्थापना के बाद, हैच दरों में लगभग 41% (एन = 51) की वृद्धि हुई, जिसमें संदूषण के कारण हटाया गया ओथेके शामिल नहीं है। हैच दरों के आगे अनुकूलन के लिए एक संभावित मार्ग में ओथेका संग्रह और नसबंदी के बीच समय का विस्तार शामिल हो सकता है। अंडे के मामले की क्यूटिकल को प्रारंभिक रिलीज32पर पूरी तरह से टैन नहीं किया जा सकता है, और इसलिए 24 घंटे के भीतर नसबंदी के दौरान उपयोग किए जाने वाले समाधानों के लिए पारम किया जा सकता है।
0.1% पेरासेटिक एसिड का उपयोग करने वाले नसबंदी प्रोटोकॉल को गुड़िया एट अल25से अनुकूलित किया गया था। अन्य अध्ययनों में23 , 26की नसबंदी के लिए वैकल्पिकतकनीकोंका दस्तावेजीकरण किया गया है . संदूषण दरें बीएचयू तिरछा पर ओथेक को इनक्यूबेटिंग करने की गैर-विनाशकारी विधि पर आधारित हैं। यह दृष्टिकोण अत्यधिक लाभप्रद है क्योंकि यह त्वरित पहचान और दूषित ओथेके को हटाने की अनुमति देता है। पिछले अधिकांश प्रोटोकॉल जीवाणु ओं के मीडिया पर मल या अप्सरा समरूपता चढ़ाना और 22 , 23 ,25,27,27,33 , 33के विकास के लिए जांच करके कृषि योग्य जीवों के लिए परीक्षण करते हैं । कम से कम एक मामले में, gnotobiotic स्थिति के परीक्षण के लिए विधि पूरी तरह से26वर्णित नहीं किया गया था। क्लेटन को छोड़कर जिन्होंने बोतलों को पालने के लिए स्टरलिटी परीक्षण माध्यम का एक छोटा स्लैब जोड़ा24,पिछले तरीके22,23 ने केवल कम समय के लिए जीवाणु मीडिया पर gnotobiotic कीड़े रखे थे ताकि शुरू में नसबंदी प्रोटोकॉल का मूल्यांकन किया जा सके ।
एक अंतर्निहित गुणवत्ता नियंत्रण उपाय के रूप में बीएचआई माध्यम पर परिणामी नस्लों के निरंतर आवास उनके gnotobiotic स्थिति अर्द्ध वास्तविक समय में निगरानी करने के लिए अनुमति देता है-एक तकनीक सबसे पिछले तरीकों में नहींदेखा 22,23। यह दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जिन्हें gnotobiotic नस्लों तक पहुंचने की आवश्यकता होती है। यदि नस्लों के नीचे बीएचआई मंजिल बैक्टीरियल या फंगल विकास से दूषित दिखाई देती है, तो फ्लास्क को त्याग दिया जाना चाहिए। इस प्रकार का संदूषण आमतौर पर पानी के नस्लों के लिए फ्लास्क को अनकवर करते समय होता है, लेकिन यह अपर्याप्त रूप से निष्फल ओथेके या भोजन के मामले में मल से भी उत्पन्न हो सकता है। पानी भरने पर लेमिनार फ्लो हुड का उपयोग फ्लास्क को अनकवर करने के कारण होने वाली संदूषण दर में सुधार करता है।
चूंकि सभी दूषित जीव बीएचआई माध्यम पर एरोबिक रूप से विकसित नहीं हो सकते हैं, इसलिए बंध्यता परीक्षण की एक अतिरिक्त संस्कृति-स्वतंत्र विधि की आवश्यकता है । एक संभावित दृष्टिकोण माइक्रोस्कोपी27है, लेकिन यह दृष्टिकोण श्रम-प्रधान हो सकता है। अन्य प्रोटोकॉल ऐसे जीवों का पता लगाने के लिए अनुक्रम आधारित तकनीकों का उपयोग करते हैं जोसंस्कृति14, 23,27,28से बच सकते हैं । हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण अक्सर महंगे होते हैं और व्याख्या करना कठिन होता है, क्योंकि उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोणों के परिणाम आसानी से अभिकर् ती34 और बारकोड हॉपिंग35के निम्न स्तर के संदूषण से प्रभावित हो सकते हैं। इसके बजाय, एक नया दृष्टिकोण विकसित किया गया है जो प्रतिबंध खंड-लंबाई बहुरूपता के साथ संयोजन में 16S rRNA जीन के पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग करता है दोनों एंडोसिम्बियोनट और किसी भी दूषित आंत सहजीवी की कल्पना करने के लिए । इस तकनीक में एक आंतरिक पीसीआर नियंत्रण शामिल है, क्योंकि ब्लैटबैक्टीरियमके 16S जीन को अनुक्रमित किया गया है, और इसका बैंडिंग पैटर्न जीनोओबायोटिक और गैर-बाँझ दोनों कीड़ों में मौजूद होना चाहिए। चूंकि एंडोसिम्बिओनट के प्रतिबंध पैटर्न की भविष्यवाणी इसके जीनोम अनुक्रम36से की जा सकती है, इसलिए एम्प्लिकोन्स या प्रतिबंध के टुकड़ों को अनुक्रमित करने की कोई आवश्यकता नहीं है, जब तक कि किसी भी संदूषक की पहचान वांछित न हो। इस प्रोटोकॉल के वर्तमान संस्करण में पीसीआर/आरएफएलपी के लिए एक अप्सरा का बलिदान करने का आह्वान किया गया है, लेकिन इस तकनीक का उपयोग मल पर एक गैर-विनाशकारी उपाय के रूप में भी किया जा सकता है । हालांकि, इसमें बिल्ट-इन कंट्रोल शामिल नहीं होगा, क्योंकि मल में ज्यादा ब्लैटबैक्टीरियमनहीं होना चाहिए।
gnotobiotic जानवरों के पालन का एक अतिरिक्त आसानी से संशोधित अभी तक महत्वपूर्ण घटक आहार है । जबकि बीएचआई एगर कीड़ों के लिए एक अस्थायी खाद्य स्रोत के रूप में काम कर सकता है, यह पाया गया है कि इसके परिणामस्वरूप विस्तारित अवधि के लिए एकमात्र खाद्य स्रोत के रूप में उपयोग किए जाने पर नस्लों के बीच पर्याप्त विकास घाटा होता है। जबकि विविध आहार की कोशिश की गई है, ऑटोक्लेवेबल चूहा चाउ को gnotobiotic कीड़ों के रखरखाव के लिए एक नियमित आहार के रूप में सिफारिश की जाती है। विशेष रूप से नसबंदी के लिए तैयार नहीं किए गए आहार अक्सर पूरी तरह से बाँझ प्रदान करना मुश्किल होते थे, और कई बाँझ या ऑटोक्लेवेबल प्रयोगशाला पशु आहार गैर बाँझ परिस्थितियों में तेजी से कवक विकास प्रदर्शित करने के लिए पाए गए थे। गैर-बाँझ परिस्थितियों में नीचा दिखाने की इस प्रवृत्ति ने उन्हें सीधे gnotobiotic और nongnotobiotic कीड़ों की तुलना में प्रयोगों में उपयोग के लिए अनुपयुक्त प्रदान किया। अनुशंसित आहार दो समूहों के बीच विकास दर जैसी विशेषताओं की तुलना को सुविधाजनक बनाने के लिए gnotobiotic और मानक नस्लों के बीच एक सुसंगत आहार के उपयोग के लिए अनुमति देता है।
जैसा कि अन्य लोगों ने27देखा है, gnotobiotic नस्लों अपने गैर बाँझ समकक्षों की तुलना में अधिक धीरे से बढ़ता है । gnotobiotic (n = 105) और गैर बाँझ नस्लों (n = 50) के शरीर की लंबाई के बीच एक तुलना ही खिलाया, ऑटोक्लेव कृंतक आहार और कमरे के तापमान पर रखा पता चलता है कि गैर बाँझ नस्लों ०.०५९ मिमी/दिन के एक औसत हो जाना है, जबकि gnotobiotic नस्लों ०.०२८ मिमी/दिन (पी < ०.०००१)(चित्रा 5)बढ़ता है । पी अमेरिकाना में आंत माइक्रोबायोटा की उपस्थिति को कीड़ों की मेटाबोलिक दर37को बदलने के लिए दिखाया गया है, और सामान्य रूप से आंत समुदायों को पोषक तत्वों के अवशोषण38, 39को प्रभावित करने के लिए सोचाजाताहै। ये कारण gnotobiotic और गैर बाँझ नस्लों की वृद्धि दर में मनाया मतभेदों का समर्थन करते हैं ।
इस तकनीक के लिए एक संभावित सीमा यह है कि gnotobiotic नस्लों यौन परिपक्वता तक नहीं पहुंच सकता है, के रूप में सबसे पुराने बाँझ साथियों से अधिक 10 महीने पुराने है और केवल सातवें instar तक पहुंच गए है (10 में से; 11 वयस्कता जा रहा है) के रूप में शरीर की लंबाई४०द्वारा अनुमानित । ये सबसे पुराने साथियों ऑटोक्लेवेड चूहा आहार पर नहीं हैं, बल्कि इसके बजाय विकिरणित चूहा चाउ खाते हैं, एक आहार जिसमें अत्यधिक मोल्ड विकास के बिना गैर-बाँझ साथियों को खिलाने के लिए बहुत अधिक नमी होती है। प्रयोगशाला की स्थिति (कमरे के तापमान और आर्द्रता) के तहत 9−10 महीनों के बाद वयस्कता तक पहुंचने के लिए एक गैर बाँझ कुत्ते खाद्य आहार पर गैर बाँझ नस्लों पाया गया। साझा, ऑटोक्लेवेड चूहा चाउ पर gnotobiotic और nonsterile नस्लों के पलटन वर्तमान में 7 महीने से भी कम पुराने हैं, गैर बाँझ कीड़े सातवें इंस्टार (औसत: 16.7 मिमी) होने का अनुमान है, जबकि बाँझ कीड़े पांचवें स्टार (औसत: 11.2 मिमी) होने का अनुमान है। नतीजतन, हम अभी तक यह सत्यापित नहीं कर सकते कि हमारे gnotobiotic तिलचट्टे सफलतापूर्वक पुन: पेश कर सकते हैं या नहीं। हालांकि, इस दृष्टिकोण का उपयोग करके नए gnotobiotic साथियों को स्थापित किया जा सकता है, यह देखते हुए, यह विधि gnotobiotic कीड़ों के सिद्ध प्रजनन के अभाव में भी महान वादा दिखाती है।
अंत में, यह प्रोटोकॉल एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करता है जो माइक्रोबायोम शोधकर्ताओं को आम प्रयोगशाला सामग्री का उपयोग करके अपने स्वयं के, कम लागत वाले जनोटोबायोटिक “सुविधा” को संचालित करने की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग मेजबान व्यवहार, प्रतिरक्षा, विकास और तनाव प्रतिक्रियाओं को आकार देने में माइक्रोबायोटा की भूमिका की जांच करने वाले प्रयोगों के लिए जनोटोबायोटिक तिलचट्टे उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है21,26,27। इन ग्नोटोबायोटिक कीटों को सिंथेटिक या ज़ेनोबायोटिक समुदायों के साथ भी टीका लगाया जा सकता है और बाद में आंत माइक्रोबायोम अध्ययन23,28के विषयों के रूप में उपयोग किया जाता है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण के तत्व, जिनमें बैक्टीरियोलॉजिकल मीडिया-लाइन वाले इनक्यूबेशन कक्षों को अंतर्निहित बंध्यता जांच के रूप में शामिल किया गया है, अन्य मॉडल प्रणालियों के लिए सामान्य हैं और छोटे पैमाने पर सुविधाओं में gnotobiotic जानवरों के नियमित रखरखाव की सुविधा प्रदान कर सकते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
इस प्रकाशन को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या R35GM133789 के तहत समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है । लेखक नसबंदी दरों, हैच दरों और gnotobiotic तिलचट्टे की विकास दर पर नज़र रखने के लिए जोसी डायर को स्वीकार करना चाहते हैं।
2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |