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Biology

गिनाओबायोटिक अमेरिकन कॉकरोच(पेरिप्लैनेटा अमेरिकाना)की स्थापना और रखरखाव

doi: 10.3791/61316 Published: May 28, 2021

Summary

इस प्रोटोकॉल का उपयोग हैचिंग से पहले अंडे के मामलों (ओथेके) को स्टरलाइज करके ग्लोटोबायोटिक अमेरिकी तिलचट्टे(पेरिप्लैनेटा अमेरिकाना)को स्थापित करने और बनाए रखने में किया जाता है। इन gnotobiotic कीड़ों में उनके खड़ी संचारित ब्लैटबैक्टीरियम एंडोसिम्बियन होते हैं लेकिन एक्सोनिक हिम्मत होती है।

Abstract

Gnotobiotic जानवरों माइक्रोबायोम संरचना और समारोह पर नियंत्रण के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। यहां प्रस्तुत gnotobiotic अमेरिकी तिलचट्टे(Periplaneta अमेरिकाना)की स्थापना और रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल है । इस दृष्टिकोण में चल रहे गुणवत्ता नियंत्रण के लिए अंतर्निहित बंध्यता जांच शामिल है। Gnotobiotic कीड़े यहां तिलचट्टे के रूप में परिभाषित कर रहे हैं जो अभी भी उनके खड़ी संचारित एंडोसिम्बिओन्ट(ब्लैटबैक्टीरियम)होते हैं, लेकिन अन्य रोगाणुओं की कमी होती है जो आम तौर पर उनकी सतह पर और उनके पाचन तंत्र में रहते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, अंडे के मामलों (ओथेके) को एक (गैर बाँझ) स्टॉक कॉलोनी और सतह निष्फल से हटा दिया जाता है। एक बार एकत्र और निष्फल होने के बाद, ओथेक को मस्तिष्क-हृदय जलसेक (बीएचआई) आगर पर लगभग 4−6 सप्ताह के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया जाता है जब तक कि वे हैच न करें या संदूषण के कारण हटा दिए जाएं। रची नस्लों को एक एर्लेनमेयर फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया जाता है जिसमें एक बीएची मंजिल, बाँझ पानी और बाँझ चूहा भोजन होता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि नस्लें आवास रोगाणु नहीं हैं जो दिए गए परिस्थितियों में बीएचआई पर विकसित करने में असमर्थ हैं, एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण उपाय गैर-जन्म्यबायोटिक रोगाणुओं के लिए परीक्षण करने के लिए प्रतिबंध खंड-लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) का उपयोग करता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके उत्पन्न Gnotobiotic नस्लों को सरल या जटिल माइक्रोबियल समुदायों के साथ टीका लगाया जा सकता है और आंत माइक्रोबायोम अध्ययनों में एक उपकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

ग्नोटोबायोटिक पशु माइक्रोबायोम अध्ययन के लिए अमूल्य साधन साबितहुएहैं 1,2,3. रोगाणु मुक्त और परिभाषित-वनस्पति जानवरों ने मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन की स्पष्टता की अनुमति दी है, जिसमें मेजबान इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रियाएं, आंत एपिथेलियल परिपक्वता, और मेजबान मेटाबोलिज्म1,4,5,6, 7शामिल हैं। एक सरलीकृत समुदाय के साथ टीका लगाने वाले Gnotobiotic जानवरों ने भी एक आंत समुदाय में माइक्रोब-माइक्रोब इंटरैक्शन की अधिक पूरी समझ में सहायता की है, विशेष रूप से क्रॉस-फीडिंग और विरोधी संबंधों को सुलझाने में8,9,10, 11 स्तनधारी आंत माइक्रोबायोम में अध्ययन के लिए वर्तमान पसंदीदा मॉडल प्रणाली मुरीन मॉडल है। हालांकि इस प्रणाली के ऊपर उल्लिखित खोजों में महत्वपूर्ण रहा है, एक महत्वपूर्ण कमी शामिल लागत है । एक जनोटोबायोटिक सुविधा स्थापित करने और बनाए रखने के लिए विशेष उपकरण और उच्च प्रशिक्षित तकनीशियन आवश्यक हैं। यह, अतिरिक्त देखभाल के साथ संयोजन में जो जीनोटोबायोटिक पशु रखरखाव के हर पहलू को दिया जाना चाहिए, एक जीनोटोबायोटिक जानवर को एक मानक पशु मॉडल12की तुलना में नस्ल के लिए दस से बीस गुना अधिक खर्च करने का कारण बनता है। उच्च लागत के कारण, कई शोधकर्ताओं ने एक gnotobiotic murine मॉडल बर्दाश्त करने में असमर्थ हो सकता है । इसके अतिरिक्त, जबकि मुरीन मॉडल मानव स्वास्थ्य के लिए अनुवाद करने के लिए देख अध्ययन के लिए सबसे व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं, वहां अभी भी मानव और माउस हिंमत13के बीच कई शारीरिक और रूपात्मक मतभेद हैं । स्पष्ट रूप से कोई विलक्षण मॉडल आंत माइक्रोबायोम के कई पहलुओं के बारे में सवालों की बढ़ती संख्या का जवाब देने के लिए पर्याप्त है ।

कीट मॉडल स्तनधारी प्रजातियों की तुलना में उनकी कम लागत के रखरखाव के कारण एक सस्ता विकल्प है। विभिन्न प्रकार की कीट प्रजातियों में व्यापक रोगाणु मुक्त और gnotobiotic अनुसंधान ने कई आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मॉडलों का विकास किया है। मच्छर और ड्रोसोफिला वैश्विक रोगों और आनुवंशिक अनुरेखा14,15के लिए उनकी प्रासंगिकता के कारण रोगाणु मुक्त काम के लिए आम मॉडल हैं। एक अन्य उभरती हुई मॉडल प्रणाली शहद मधुमक्खी(एपीआईएस मेलिफारा)की है , जो परागण और सामाजिकता अनुसंधान में इसके महत्व को देखतेहुए 16 हालांकि, इनमें से कई आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली कीड़ों में स्तनधारी आंत समुदायों17में देखी गई वर्गीकरण जटिलता की कमी होती है, जो उच्च क्रम की बातचीत को मॉडल करने की उनकी क्षमता को सीमित करती है। न केवल अमेरिकी तिलचट्टे के पेट में पाए जाने वाले रोगाणुओं की कुल विविधता स्तनधारियों के समान है, बल्कि तिलचट्टे के पेट में मौजूद कई रोगाणु परिवारों और फायला से संबंधित हैं जो आमतौर पर स्तनधारियों और मनुष्यों के आंत माइक्रोबायोटा में पाए जाते हैं18। तिलचट्टा का हिंडगट स्तनधारियों की बड़ी आंत के अनुरूप भी है, क्योंकि यह पोषक तत्वों के निष्कर्षण में सहायता करने के लिए बैक्टीरिया से भरा एक किण्वन कक्ष है19,20। अंत में, तिलचट्टे की सर्वव्यापी प्रकृति आहार व्यवस्थाओं की विविधता के लिए अनुमति देती है जो आहार विशेषज्ञों के साथ संभव नहीं होगी।

अमेरिकी तिलचट्टे उच्च जीवों में आंत माइक्रोबियल समुदायों को समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली हो सकती है, लेकिन कीट के रूप में तिलचट्टे की स्थिति भी इस प्रणाली को कीट नियंत्रण21के लिए प्रासंगिक बनाती है। तिलचट्टा स्वास्थ्य और शरीर विज्ञान पर आंत समुदाय के प्रभाव के मौलिक ज्ञान का लाभ कीट प्रबंधन के लिए नई तकनीकों को विकसित करने में सहायता करता है।

इस विधि का लक्ष्य जनोटोबायोटिक अमेरिकी तिलचट्टे(पेरिप्लैनेटा अमेरिकाना)की स्थापना और रखरखाव का व्यापक विवरण तैयार करना है, लेकिन इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी अंडाशय तिलचट्टे की नस्लों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इसमें परिपक्व ओथेक के कुशल, गैर-विकासात्मक संग्रह के लिए एक विधि और कीड़ों की जनोटोबायोटिक स्थिति की निगरानी के लिए एक गैर-विनाशकारी तकनीक शामिल है22,23,24। जबकि gnotobiotic तिलचट्टे को प्राप्त करने और बनाए रखने के पिछले तरीकों में ओथेकासंग्रह23, 24,25,26,27, 27का वर्णन किया गया है, ऊथेका परिपक्वता या तो प्रजातियों के विशिष्ट संकेतों (ब्लैटेला जर्मनिका22, 24,25में) के संदर्भ में व्याख्या की जाती है, या स्पष्ट रूप से27,28वर्णित नहीं है, जो सिस्टम से अपरिचित लोगों के लिए कार्यान्वयन को मुश्किल बना देता है। चूंकि यहां वर्णित विधि स्वाभाविक रूप से गिराए गए ओथेक का उपयोग करती है, इसलिए समय से पहले अंडे हटाने की त्रुटि अनुपस्थित है। इस प्रोटोकॉल में गुणवत्ता नियंत्रण के संस्कृति-निर्भर और संस्कृति-स्वतंत्र तरीके दोनों शामिल हैं, और संस्कृति पर निर्भर विधि को कीड़ों का त्याग करने की आवश्यकता नहीं है। अंत में, यह विधि कई जनोटोबायोटिक तिलचट्टे अध्ययनों से जानकारी लाती है ताकि जनोटोबायोटिक तिलचट्टे को प्राप्त करने और बनाए रखने के लिए सभी आवश्यक जानकारी के साथ एक, व्यापक प्रोटोकॉल बनाया जा सके।

Protocol

1. सामग्री की तैयारी

  1. स्टॉक तिलचट्टा संस्कृतियों का रखरखाव
    नोट: इन मजबूत कीड़ों को पीछे करने के कई तरीके हैं। आश्रय और पानी प्रदान करने पर विशेष सुलभ सामग्री (यानी, गत्ते ट्यूबों के बजाय अंडे के डिब्बों) के आधार पर अलग हो सकता है। निम्नलिखित नसबंदी प्रोटोकॉल किसी भी स्टॉक टैंक सेटअप के लिए काम करेगा।
    1. बिस्तर के लगभग 1 इंच के साथ टैंक के नीचे को कवर करने के लिए एक 37.85 एल (10 गैलन) मछली टैंक में पर्याप्त वुडचिप बिस्तर फैलाएं। टुकड़ों में x 4 में 2 को काटने (फ्लैट) गत्ते द्वारा आवास तैयार करें। कार्डबोर्ड ट्यूबों (जैसे, टॉयलेट पेपर ट्यूब) और टैंक के एक छोर पर ढेर ट्यूबों में कार्डबोर्ड टुकड़े डालें(चित्रा 1)।
    2. कीट से बचने को रोकने के लिए टैंक के अंदर के शीर्ष दो इंच पर पेट्रोलियम जेली की एक पतली परत को धुंधला करें।
      नोट: टैंक के कोनों के अंदर ठीक से कोट करना सुनिश्चित करें।
    3. पिछले स्टॉक टैंक से कार्डबोर्ड ट्यूबों को स्थानांतरित करके तिलचट्टे जोड़ें, उन्हें अपने निवासियों को छोड़ने के लिए मिलाते हुए। प्रत्येक हस्तांतरण के लिए, 100−200 मिश्रित आयु, मिश्रित सेक्स तिलचट्टे ले जाएं। कुत्ते के भोजन (20−30 टुकड़े) जोड़ें, टैंक में कुत्ते के भोजन की मात्रा की निगरानी करें और कम होने पर फिर से भरें।
    4. एक पानी पकवान स्थापित करें।
      1. डबल-आसुत पानी (डीडीएच2ओ) के साथ एक छोटे प्लास्टिक पुन: प्रयोज्य खाद्य कंटेनर भरें। लगभग एक ही आकार के लिए खाद्य कंटेनर के ढक्कन में सेल्यूलोज स्पंज और छेद काटें।
        नोट: सेल्यूलोज स्पंज तिलचट्टे को पानी के पकवान में डूबने से रोकते हैं।
    5. ढक्कन में छेद में स्पंज डालें और भरे हुए कंटेनर पर ढक्कन रखें। कंटेनर को टैंक में रखें और कम होने पर फिर से भरें। टैंक को सूती कपड़े से ढक कर लोचदार बैंड के साथ जगह में सुरक्षित करें।
    6. जैसे-जैसे टैंक फ्रास और कीट शवों की अत्यधिक मात्रा जमा करना शुरू करते हैं, नए टैंक स्थापित करते हैं और तिलचट्टे स्थानांतरित करते हैं।
      नोट: टैंक आम तौर पर हर 6 महीने में स्थानांतरित कर रहे हैं । कार्यमुक्त स्टॉक टैंकों में किसी भी शेष तिलचट्टे/अंडे को 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंड से इच्छामृत्यु दी जाती है और स्टॉक टैंक की सामग्री को निपटान से पहले एक ऑटोक्लेव बैग और ऑटोक्लेव (1 एच, गुरुत्वाकर्षण चक्र) में स्थानांतरित कर दिया जाता है। स्टॉक टैंक उपयोगों के बीच 2% ब्लीच के साथ निष्फल हैं।
  2. एक माध्यमिक कंटेनर कीटाणुरहित करें।
    नोट: इस कंटेनर में फ़िल्टर शामिल नहीं है, बल्कि इसके बजाय मुफ्त एयर एक्सचेंज की अनुमति देता है।
    1. ढक्कन और नीचे दोनों के अंदर 2% ब्लीच के साथ स्प्रे करें और उन्हें 10 मिनट के लिए भिगोने की अनुमति दें। ब्लीच को साफ कागज के तौलिये से पोंछ लें।
    2. ढक्कन के अंदर और नीचे 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और एक साफ पेपर तौलिया के साथ सूखी पोंछें। उपयोग होने तक ढक्कन को बदलें।
  3. अंडे और आवास नस्लों को इनक्यूबेटिंग करने के लिए बीएचआई स्लेंट और फ्लास्क बनाएं।
    1. पैकेज निर्देशों के अनुसार बीएचआई तैयार करें, 2% एगर जोड़ें। स्पष्ट होने तक भी-आगर समाधान उबाल लें।
    2. स्लेंट के लिए, 5 एमएल एलिकॉट को 18 एमएम x 150 एमएम ग्लास टेस्ट ट्यूब और कैप में ट्रांसफर करें। ऑटोक्लेव (नसबंदी समय = 20 मिनट, तरल चक्र) के माध्यम से बंध्याकरण करें। स्लोंट्स में ठंडा करने के लिए 45 डिग्री कोण पर ऑटोक्लेव ट्यूब रखें। एक बार जम जाने के बाद, सूखने से रोकने के लिए उपयोग तक ठंडा करें।
    3. फ्लास्क के लिए, फ्लास्क के नीचे पूरी तरह से कवर करने के लिए उबले हुए बीएचआई-एगर समाधान के 10 एमएल एलिकोट्स को 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में स्थानांतरित करें। फ्लास्क को पन्नी से ढकें और ऑटोक्लेव (20 मिनट, तरल चक्र) के माध्यम से निष्फल करें। ऑटोक्लेवेड फ्लास्क को ठंडा करने और ठंडा करने की अनुमति दें जब तक कि सूखने से रोकने के लिए उपयोग न हो।
      नोट: इस सेटअप के लिए किसी एयर फिल्टर की आवश्यकता नहीं है। खुली हवा के प्रवाह से प्रदूषण को रोकने के दौरान गैस एक्सचेंज की अनुमति देने के लिए फॉइल कवर पर्याप्त है।
  4. ऑटोक्लेव के माध्यम से स्टरलाइज करें: एक पन्नी से ढके बीकर (नसबंदी समय = 1 घंटे, गुरुत्वाकर्षण चक्र), एक कैप्ड बोतल में डीडीएच 2 ओ (नसबंदी समय =20मिनट, तरल चक्र) में आधे आकार (~ 1/2 इंच के टुकड़े) में ऑटोक्लेवेबल चूहा चाउ टूट गया, और एक पन्नी में संदंश-कवर बीकर (नसबंदी समय = 20 मिनट, गुरुत्वाकर्षण चक्र)।
    नोट: चूहा चाउ बीकर ओवरफिल न करें। ऑटोक्लेव में छर्रों प्रफुल्लित हो जाएगा।
  5. एक "प्रसूति वार्ड" टैंक की स्थापना की ।
    नोट: इस टैंक में स्टॉक टैंक (कार्डबोर्ड ट्यूब, स्पंज के साथ पानी के व्यंजन, कुत्ते के भोजन, वुडचिप बिस्तर; चित्रा 1देखें) के रूप में एक ही सामग्री शामिल है और तिलचट्टे से खाली होना चाहिए जब तक कि ओथेक संग्रह के लिए स्थानांतरित न हो (धारा 2 देखें)।
  6. सुपरसैचुरेटेड सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) समाधान से भरा बीकर तैयार करके एक इनक्यूबेटर को ह्यूमिडिफाई करें। डीएच2ओ के प्रति 100 एमएल एनएसीएल के 37 ग्राम जोड़कर और भंग होने तक सरगर्मी करके इस समाधान को तैयार करें।
    नोट: आमतौर पर, संतृप्त नमक समाधान के 500 मिलीएल आम तौर पर कक्ष आयामों के साथ एक इनक्यूबेटर को ह्यूमिडिफायर करता है 51 सेमी x 46 सेमी x 46 सेमी (एच एक्स डब्ल्यू एक्स डी) लगभग एक महीने पहले अधिक पानी जोड़ा जाना चाहिए।

2. ओथेके का संग्रह

  1. महिलाओं को स्थानांतरित करें (नियोजित प्रयोगों के लिए उपयुक्त किसी भी संख्या में) स्टॉक टैंक से "मैटरनिटी वार्ड" तक oothecae(चित्रा 2)ले जाने के लिए कार्डबोर्ड ट्यूबों कि ग्रेविड महिलाओं को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करके ।
    1. यदि एक कारबोर्ड ट्यूब में ग्रेविड मादा के अलावा कई कीड़े होते हैं, तो पहले ट्यूब को पेट्रोलियम जेली के साथ बजने वाले एक अतिरिक्त प्लास्टिक कंटेनर में हिलाएं, और फिर लक्ष्य कीट को अकेले कार्डबोर्ड ट्यूब में वापस चढ़ने के लिए प्रोत्साहित करें।
  2. महिलाओं को वापस स्टॉक टैंक में स्थानांतरित करने के बाद वे अपने oothecae गिरा दिया है । संदंश के साथ टैंक में कूड़े से oothecae पुनः प्राप्त करें।
    नोट: Oothecae अक्सर महिला के 24 घंटे के भीतर गिरा दिया जा रहा है स्थानांतरित किया जा रहा है ।

3. ओथेके की सफाई

  1. सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 3 एमएल युक्त 5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में ओथेकेज जोड़ें। 10 एस के लिए भंवर । ताजा एसडीएस युक्त एक अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ एक दूसरे धोने के कदम के लिए दोहराएं।
    नोट: एसडीएस के 3 एमएल में पांच ओथेकै का उपयोग किया जा सकता है।
  2. एक नाजुक कार्य पोंछ का उपयोग करना, धीरे से किसी भी मलबे को हटाने के लिए प्रत्येक ootheca की सतह साफ़ । पूरी तरह से सफाई में सहायता करने के लिए अधिक एसडीएस जोड़ा जा सकता है। नसबंदी के लिए तैयार होने तक एक वजनी नाव में साफ oothecae रखें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रुका जा सकता है, लेकिन समय की विस्तारित अवधि (सप्ताह के लिए दिन) के लिए कम आर्द्रता वातावरण में oothecae छोड़ने के कारण उन्हें निर्जलीकरण और व्यवहार्यता खो देंगे ।

4. नसबंदी और oothecae के इनक्यूबेशन

  1. नसबंदी के बाद कुल्ला के लिए अलीकोट बाँझ पानी । निष्फल होने के लिए, बाँझ पानी के 1 एमएल के साथ दो 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब भरें।
  2. केंद्रित के 10 माइक्रोल जोड़ें (32%) नसबंदी के लिए 0.1% समाधान बनाने के लिए 5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में डीडीएच2ओ के 3.2 एमएल पर पर्सेकेटिक एसिड स्टॉक समाधान। कैप और उलटा कई बार मिश्रण करने के लिए।
    सावधानी: त्वचा या फेफड़ों के संपर्क में पर्सेटिक एसिड हानिकारक है। एक धूम हुड में पतला।
    नोट: यह नसबंदी के रूप में एक ही दिन किया जाना चाहिए । यदि पहले से पतला हो जाता है, तो समाधान जल्दी से विघटित हो जाएगा और इसलिए ठीक से बंध्याकरण नहीं करेगा। तनु एसिड के 3.2 मिलीलन में पांच साफ ओथेके को निष्फल किया जा सकता है।
  3. प्लेस (पांच तक) 5 मिनट के लिए 0.1% पेरासेटिक एसिड समाधान में oothecae साफ किया। ट्यूब को हर 60 एस पर कई बार उलटा करें।
  4. एक लैमिनार प्रवाह हुड में, प्रत्येक ओथेका को अपनी अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें, जिसमें अलीकोटित बाँझ कुल्ला पानी (चरण 4.1)। कई बार मिलाने के लिए उलटा। एक दूसरे कुल्ला के लिए दोहराएं, फिर बाँझ संदंश का उपयोग करके प्रत्येक कुल्ला ओथेका को अपने स्वयं के बीएचई तिरछा में स्थानांतरित करें।
  5. निष्फल माध्यमिक कंटेनर में स्लेंट रखें। कंटेनर को 4−5 सप्ताह तक 30 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में ले जाएं जब तक कि रची न जाए।
    नोट: Slants एक छोटे से परीक्षण ट्यूब रैक या एक मध्यम/छोटे बीकर द्वारा सीधे आयोजित किया जा सकता है ।
  6. नियमित रूप से slants की जांच करें (1−2x प्रति सप्ताह)। अगर एगर पर फंगल या बैक्टीरियल कॉलोनी ग्रोथ दिखाई दे तो दूषित तिरछा को हटा दें। जब चार सप्ताह का समय बिंदु पहुंचता है, तो हर दिन slants की जांच करें।
    नोट: एक बार रची, नस्लों अकेले BHI पर कई हफ्तों तक जीवित रह सकते हैं, लेकिन बेहतर विकसित नहीं होगा ।

5. ग्नोटोबायोटिक नस्लों का रखरखाव

  1. एक लैमिनार फ्लो हुड में, बाँझ संदंश के साथ एक तैयार बीएचआई फ्लास्क (चरण 1.3.3 से) में निष्फल चूहे चाउ के एक गोली को स्थानांतरित करें। एक बंध्यता की जांच के रूप में, 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में माध्यमिक कंटेनर में फ्लास्क रखें, और विकास दिखाई देने पर उपयोग न करें।
  2. बाँझ भोजन गोली के साथ बीएचआई फ्लास्क में नस्लों जोड़ें। उन्हें अपने बीएची तिरछा से बाहर हिला और उन्हें एक laminar प्रवाह हुड में कुप्पी में गिर जाते हैं।
    नोट: नस्लों परीक्षण ट्यूब के कांच की दीवारों पर कर्षण नहीं है। उन्हें तिरछा से दूर दस्तक और फिर उन्हें फ्लास्क में गिलास नीचे स्लाइड करने के लिए अनुमति देने के लिए ट्यूब टिपिंग ट्यूब मिलाते हुए प्रभावी है। जबकि नस्लों को संदंश का उपयोग करके स्थानांतरित किया जा सकता है, घातक चोट का खतरा अधिक है।
  3. फ्लास्क के बीएचआई मंजिल पर सीधे पाइपिंग करके एक लेमिनार फ्लो हुड में प्रति सप्ताह एक बार बाँझ पानी के 300 माइक्रोन के साथ पानी की नस्लें।
  4. जैसे ही नीलम मल बीएचआई मंजिल को कवर करना शुरू करते हैं, एक नए बीएचआई फ्लास्क में स्थानांतरित हो जाते हैं, पहले से निष्फल चूहा चाउ 24 एच जोड़ते हैं (बंध्यता को सत्यापित करने के लिए) चरण 5.1 में।

6. बंध्यता का गुणवत्ता नियंत्रण

  1. प्रतिबंध खंड-लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) के माध्यम से gnotobiotic स्थिति की संस्कृति-स्वतंत्र गुणवत्ता नियंत्रण जांच के लिए बलिदान करने के लिए बीएचआई फ्लास्क से एक अप्सरा निकालें। ऐसा करने के लिए, अप्सरा को बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में डालें (चरण 5.1 से नीलम हस्तांतरण के समान) या एक बाँझ लकड़ी के एप्लिकेटर को फ्लास्क में रखें और इसे चढ़ने के लिए एक अप्सरा की प्रतीक्षा करें, फिर इसे अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. अपकेंद्रित्र ट्यूब में अप्सरा में अप्सरा में 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 0.5 एमएल जोड़ें और सभी बड़े टुकड़े टूट जाने तक बाँझ माइक्रोपेस्टल के साथ समरूप हों। भंवर अच्छी तरह से।
  3. एक जीवाणु डीएनए निष्कर्षण किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके अप्सरा समरूप से डीएनए निकालें इस प्रकार है।
    1. 5,000 x g पर 10 मिनट के लिए समरूप अप्सरा को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को हटा दें। थर्मल शेकर को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
    2. 1x ट्रिस-ईडीटीए के 100 माइक्रोन जोड़ें, और पेट को पूरी तरह से फिर से व्यापित करने के लिए भंवर। lysozyme और मिश्रण के 10 μL जोड़ें, एक 30 मिनट (कोई मिलाते हुए) पूर्व गरम ३७ डिग्री सेल्सियस थर्मल शेखर में इनक्यूबेशन के बाद ।
    3. नमूनों में 25 मिलीग्राम ग्लास मोतियों को जोड़ें, और 5 मिनट के लिए अधिकतम गति से भंवर। थर्मल शेकर को 55 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
    4. मोतियों को सुपरनेट को एक नए 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले व्यवस्थित करने दें जिसमें 100 माइक्रोन प्रोटीन के बफर और 20 माइक्रोन प्रोटीन के भंवर को अच्छी तरह से मिलाएं।
    5. 600 आरपीएम पर मिलाते हुए, 60 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस थर्मल शेकर में। 2 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, और एक नई 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में सुपरनैंट स्थानांतरित करें। थर्मल शेकर को 65 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें। 65 डिग्री सेल्सियस संकरण ओवन में एल्यूशन बफर को प्रीहीटिंग करना शुरू करें।
    6. 100% इथेनॉल के 220 माइक्रोन जोड़ें। 20 एस के लिए अधिकतम गति से भंवर। 10x ऊपर और नीचे पाइपिंग करके किसी भी दृश्यमान तेज़ को तोड़ें।
    7. एक डीएनए कॉलम को 2 एमएल संग्रह ट्यूब में डालें, और नमूने को कॉलम में स्थानांतरित करें, जिसमें किसी भी तेज़ी शामिल है जो बन सकते हैं। 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, संग्रह ट्यूब से फिल्ट्रेट त्यागें, और संग्रह ट्यूब को बदलें।
    8. कॉलम में बाध्यकारी बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें, और 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। संग्रह ट्यूब से फिल्ट्रेट को त्यागें और संग्रह ट्यूब को बदल दें।
    9. कॉलम में डीएनए वॉश बफर के 700 माइक्रोन जोड़ें, और 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। संग्रह ट्यूब से फिल्ट्रेट को त्यागें और संग्रह ट्यूब को बदल दें। दूसरे वॉश स्टेप के लिए दोहराएं।
    10. 2 मिनट के लिए सेंट्रलाइज खाली कॉलम इसे सुखाने के लिए, कॉलम को बाद में एक नए 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करता है। डीएनए कॉलम मैट्रिक्स में सीधे प्रीहीटेड एल्यूशन बफर का 50 माइक्रोन जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    11. 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज एल्यूट करने के लिए। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री या फ्लोरोमेट्री के माध्यम से फिलट्रेन में निकाले गए डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
  4. पूरे 16S जीन को बढ़ाना और पचाना। जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके टुकड़ों की कल्पना करें।
    1. 2x मास्टर मिक्स के 12.5 माइक्रोन, प्रत्येक प्राइमर 1492R (5′-GGTTACCTTTTTACGACTT) और 27F (5'-AGAGTTTGATCCCCTGGCTCAG), डीएनए के 5 एनजी, और आणविक ग्रेड पानी के 0.5 माइक्रोन का उपयोग करें 25 माइक्रोन की कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए।
    2. निम्नलिखित थर्मोसाइकिलर कार्यक्रम चलाएं: 60 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; इसके बाद 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 45 एस के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 90 एस के लिए 68 डिग्री सेल्सियस; इसके बाद 5 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस।
    3. डीएनए शुद्धिकरण किट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) उत्पाद को शुद्ध करें।
      1. मिश्रण करने के लिए पीसीआर उत्पाद और भंवर में बफर को शुद्ध करने के 120 माइक्रोन जोड़ें। ढक्कन के अंदर बूंदों को इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र। एक डीएनए कॉलम को 2 एमएल संग्रह ट्यूब में डालें, तैयार कॉलम में तरल स्थानांतरित करें और 1 मिनट के लिए ≥13,000 एक्स जी पर सेंट्रलाइज करें।
      2. फिल्ट्रेट को त्यागें और संग्रह ट्यूब को बदल दें। 1 मिनट के लिए ≥13,000 x g पर डीएनए वॉश बफर और अपकेंद्रित्र के 700 माइक्रोन जोड़ें। फिल्ट्रेट को त्यागें और संग्रह ट्यूब को बदल दें। दूसरे वॉश स्टेप के लिए दोहराएं।
      3. 2 मिनट के लिए खाली कॉलम को सूखने और कॉलम को एक नए 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए अपकेंद्रित्र करें। डीएनए कॉलम मैट्रिक्स में सीधे प्रीहीटेड एल्यूशन बफर का 50 माइक्रोन जोड़ें, और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      4. 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज एल्यूट करने के लिए। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री या फ्लोरोमेट्री के माध्यम से फिलट्रेट में निकाले गए डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
    4. पाचन बफर के 5 माइक्रोन में शुद्ध पीसीआर उत्पाद का 1 माइक्रोन जोड़ें, 10 इकाइयों आरएसएआई, और आणविक ग्रेड पानी 50 माइक्रोन की कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए। 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊपर और नीचे और इनक्यूबेट करके मिलाएं।
    5. 2% एगर उठे जेल पर पचा डीएनए के 20 माइक्रोन चलाकर जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के माध्यम से पचाने वाले उत्पाद को अलग करें। gnotobiotic स्थिति की पुष्टि करने के लिए जेल की कल्पना करें।
      नोट: Gnotobiotic कीड़े केवल ४०२ बीपी, २०१ बीपी पर बैंड में परिणाम चाहिए, और १६३ से १४८ बीपी के लिए एक धब्बा, एंडोसिम्बियोनट, Blattabacteriumके 16S rDNA अनुक्रम के आधार पर । जेल में देखे गए किसी भी अतिरिक्त बैंड माइक्रोबियल प्रजातियों को दूषित करने का संकेत हैं।

7. निम्फल विकास की Aseptic ट्रैकिंग

  1. फ्लास्क के पारदर्शी बीएचआई मंजिल के माध्यम से कीड़ों को मापने के द्वारा नस्ल के विकास को ट्रैक करने के लिए शरीर की लंबाई रिकॉर्ड करें।
    नोट: नस्लों को उनके आंदोलन को धीमा करने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है, जिससे उन्हें मापने में आसानी होती है।

Representative Results

स्टॉक टैंक ों की स्थापना चित्र 1में दर्शाए गए हैं . "गर्भवती" महिलाओं को पीछे के पेट से जुड़े ओथेका द्वारा पहचाना जाता है, जैसा कि चित्र 2में चित्र है। बीएचआई एगर पर ओथेके का इनक्यूबेशन एक गैर-रचनात्मक फैशन में जनोटोबायोटिक गुणवत्ता नियंत्रण की अनुमति देता है। कुछ मामलों में, नसबंदी असफल है, और विकास आकृति 3Bके रूप में oothecae के आसपास दिखाई देता है । इन ऊथेसे को हटाकर छोड़ देना चाहिए। हमारे हाथों में, नसबंदी (एन = 51) के लिए 10% औसत विफलता दर देखी गई थी। oothecae माध्यम पर विकास के बिना नसबंदी के बाद ३४ दिनों के एक औसत हैच, के रूप में चित्रा 3Aमें देखा । हमने प्रति ओथेका प्रति 11 नस्लों के औसत के साथ निष्फल, गैर-नियंत्रित ओथेके के लिए 41% (एन = 46) की विशिष्ट हैच दरों का अवलोकन किया है। बड़ी नस्लों को पन्नी से ढके बीएचआई फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया जाता है,जैसा कि चित्र 4 में है। पन्नी संदूषण को रोकती है, और नस्लों के पास बढ़ने के लिए कमरे होते हैं। एक समरूप नस्ल से 16S rDNA के आरएफएलपी का उपयोग gnotobiotic स्थिति की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। Gnotobiotic नस्लों को उनके गैर-बाँझ समकक्षों की तुलना में धीमी दर से बढ़ने के लिए देखा गया है, जैसा कि चित्र 5का प्रतिनिधित्व किया गया है। चित्रा 6 सफलतापूर्वक gnotobiotic कीड़ों के साथ ही मानक (गैर बाँझ) नस्लों से परिणाम प्रदर्शित करता है।

हालांकि इस परीक्षण ने अभी तक सकारात्मक संस्कृति परिणाम के अभाव में संदूषण की पहचान नहीं की है, लेकिन ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील या दुराग्रही रोगाणुओं की उपस्थिति से इंकार करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयोगों के दौरान नियमित रूप से यह कदम उठाया गया है । मानक/गैर बाँझ कीड़ों की तुलना में जब gnotobiotic तिलचट्टे में धीमी वृद्धि देखी गई है ।

Figure 1
चित्रा 1: कॉकरोच स्टॉक कल्चर सेटअप।
गत्ता ट्यूब टैंक के दूर अंत में खड़ी देखा जा सकता है । भोजन और पानी दोनों टैंक के सामने के पास हैं। दृश्यता के लिए सूती कपड़े का कवर और लोचदार बैंड हटा दिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक "गर्भवती" अमेरिकी तिलचट्टा।
तीर ओथेका को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सफलतापूर्वक gnotobiotic नस्लों की छवियां रची और असफल बंध्याकरण ऊथेके बीएचआई slants पर ।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में Oothecae निष्फल और इनक्यूबेटेड थे। (क)बीएचआई तिरछा पर माइक्रोबियल विकास की कमी यह दर्शाती है कि कीड़े कृषि योग्य जीवों से मुक्त हैं । (ख)कॉलोनी गठन में परिणाम देने वाले slants पर Oothecae को दूषित के रूप में त्याग दिया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: Gnotobiotic पालन उपकरण।
कीड़ों को संदूषण को रोकने के लिए पन्नी के ढक्कन से ढके बाँझ फ्लास्क में रखा जाता है। माध्यमिक कंटेनर (हरे ढक्कन) को 2% ब्लीच के साथ निष्फल किया जाता है और इसके बाद 70% इथेनॉल होता है। द्वितीयक कंटेनर में वायु प्रवाह प्रतिबंधित नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि विकास दर डेटा gnotobiotic और गैर बाँझ नस्लों के शरीर की लंबाई की तुलना । कीड़ों के दोनों समूहों को ऑटोक्लेव कृंतक आहार खिलाया गया था। Gnotobiotic कीड़े (यहां: n = 105) के रूप में वर्णित बीएचआई पर रखा जाता है। गैर बाँझ कीड़े (यहां: एन = 50) पानी के लिए छोटे व्यंजनों के साथ ऑटोक्लेवेड वुडचिप बिस्तर के साथ फ्लास्क में रहते हैं। नॉनस्टेरल नस्लों की औसत दर 0.059 मिमी/दिन बढ़ती है, जबकि gnotobiotic नस्लों ०.०२८ मिमी/दिन (पी < ०.०००१) से बढ़ता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: गुणवत्ता नियंत्रण के लिए आरएफएलपी परिणामों की एक प्रतिनिधि जेल छवि।
पूरे-16S जीन एम्प्लिकॉन आरएसईआई के साथ पचा रहे थे। पीसीआर के लिए डीएनए 1x पीबीएस में समरूप नस्लों से निकाला गया था । "जी अप्सरा" लेन gnotobiotic नस्लों के अनुरूप है, जबकि "संवहन अप्सरा" लेन पारंपरिक, गैर बाँझ समकक्षों के अनुरूप है । वर्चुअल प्रतिबंध डाइजेस्ट के आधार पर, एंडोसिम्बियोन(ब्लैटबैक्टीरियम)में ४०२ बीपी, २०६ बीपी और १६३ बीपी के आकार में बैंड होने की उम्मीद है, जिसमें १६३ बीपी और १४८ बीपी के बीच बैंड का धब्बा है । एक ग्नोटोबायोटिक कीट को केवल ब्लैटबैक्टीरियम बैंडिंग पैटर्न दिखाना चाहिए। एक मिश्रित जीवाणु समुदाय में अलग-अलग आकारों वाले बैंड का एक धब्बा होने की उम्मीद है, जो यहां "अन्य बैक्टीरियल 16S टुकड़े" लेबल किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

जनोटोबायोटिक तिलचट्टे के उत्पादन का वर्णन करने वाले अन्य तरीकों में या तो ओथेके संग्रह का वर्णन नहीं किया गया था या अन्य तिलचट्टे प्रजातियों के लिए विशिष्ट बेंचमार्क का उपयोग किया गया था ताकि यह इंगित किया जा सके कि ओथेके कोमां23, 25,26से हटाया जा सकता है। मूल रूप से, ओथेक को स्टॉक टैंकों में वुडचिप बिस्तर से एकत्र किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप बहुत कम हैच दरें (~ 10%) नॉनस्टेरिलाइज्ड ओथेके (47%)29की तुलना में . यह इस तथ्य के कारण होने की संभावना है कि स्टॉक पिंजरे में समय के साथ अनहैच्ड ओथेके जमा होता है, और ओथेका उम्र या व्यवहार्यता को सत्यापित करने का कोई तरीका नहीं है। "प्रसूति वार्ड" दृष्टिकोण के कार्यान्वयन से ज्ञात आयु के हौसले से जमा oothecae के संग्रह की अनुमति देता है। यह आगे प्रयोगात्मक योजना की सुविधा है, के रूप में शोधकर्ता व्यक्तिगत oothecae के लिए संभावित हैच समय की आशा कर सकते हैं । प्रारंभिक और प्रकाशित प्रोटोकॉल से एक और संशोधन में अर्ध-सीलबंद कक्षों में ओथेके और नस्लों की इनक्यूबेशन भी शामिल है जिसमें सुपरसैचुरेटेड सोडियम क्लोराइड समाधान होता है। समाधान की उपस्थिति लगभग 75%30की सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखती है। Oothecae नियमित रूप से 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड कर रहे हैं, जो इनक्यूबेशन के लिए आवश्यक दिनों की संख्या को कम करने के लिए दिखाया गया है, जबकि भी भ्रूण की व्यवहार्यता और ootheca31प्रति उत्पादित नस्लों की संख्या को अधिकतम । हैचिंग के बाद, ग्लोटोबायोटिक नस्लों को प्रयोगशाला कक्ष के तापमान और परिवेश की स्थितियों पर बेंचटॉप पर नियमित रूप से सुसंस्कृत किया जाता है, हालांकि आर्द्रता-नियंत्रित कक्षों का उपयोग महत्वपूर्ण प्रयोगों के लिए फिर से किया जाता है। ootheca संग्रह और इनक्यूबेशन में इन परिवर्तनों की स्थापना के बाद, हैच दरों में लगभग 41% (एन = 51) की वृद्धि हुई, जिसमें संदूषण के कारण हटाया गया ओथेके शामिल नहीं है। हैच दरों के आगे अनुकूलन के लिए एक संभावित मार्ग में ओथेका संग्रह और नसबंदी के बीच समय का विस्तार शामिल हो सकता है। अंडे के मामले की क्यूटिकल को प्रारंभिक रिलीज32पर पूरी तरह से टैन नहीं किया जा सकता है, और इसलिए 24 घंटे के भीतर नसबंदी के दौरान उपयोग किए जाने वाले समाधानों के लिए पारम किया जा सकता है।

0.1% पेरासेटिक एसिड का उपयोग करने वाले नसबंदी प्रोटोकॉल को गुड़िया एट अल25से अनुकूलित किया गया था। अन्य अध्ययनों में23 , 26की नसबंदी के लिए वैकल्पिकतकनीकोंका दस्तावेजीकरण किया गया है . संदूषण दरें बीएचयू तिरछा पर ओथेक को इनक्यूबेटिंग करने की गैर-विनाशकारी विधि पर आधारित हैं। यह दृष्टिकोण अत्यधिक लाभप्रद है क्योंकि यह त्वरित पहचान और दूषित ओथेके को हटाने की अनुमति देता है। पिछले अधिकांश प्रोटोकॉल जीवाणु ओं के मीडिया पर मल या अप्सरा समरूपता चढ़ाना और 22 , 23 ,25,27,27,33 , 33के विकास के लिए जांच करके कृषि योग्य जीवों के लिए परीक्षण करते हैं । कम से कम एक मामले में, gnotobiotic स्थिति के परीक्षण के लिए विधि पूरी तरह से26वर्णित नहीं किया गया था। क्लेटन को छोड़कर जिन्होंने बोतलों को पालने के लिए स्टरलिटी परीक्षण माध्यम का एक छोटा स्लैब जोड़ा24,पिछले तरीके22,23 ने केवल कम समय के लिए जीवाणु मीडिया पर gnotobiotic कीड़े रखे थे ताकि शुरू में नसबंदी प्रोटोकॉल का मूल्यांकन किया जा सके ।

एक अंतर्निहित गुणवत्ता नियंत्रण उपाय के रूप में बीएचआई माध्यम पर परिणामी नस्लों के निरंतर आवास उनके gnotobiotic स्थिति अर्द्ध वास्तविक समय में निगरानी करने के लिए अनुमति देता है-एक तकनीक सबसे पिछले तरीकों में नहींदेखा 22,23। यह दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जिन्हें gnotobiotic नस्लों तक पहुंचने की आवश्यकता होती है। यदि नस्लों के नीचे बीएचआई मंजिल बैक्टीरियल या फंगल विकास से दूषित दिखाई देती है, तो फ्लास्क को त्याग दिया जाना चाहिए। इस प्रकार का संदूषण आमतौर पर पानी के नस्लों के लिए फ्लास्क को अनकवर करते समय होता है, लेकिन यह अपर्याप्त रूप से निष्फल ओथेके या भोजन के मामले में मल से भी उत्पन्न हो सकता है। पानी भरने पर लेमिनार फ्लो हुड का उपयोग फ्लास्क को अनकवर करने के कारण होने वाली संदूषण दर में सुधार करता है।

चूंकि सभी दूषित जीव बीएचआई माध्यम पर एरोबिक रूप से विकसित नहीं हो सकते हैं, इसलिए बंध्यता परीक्षण की एक अतिरिक्त संस्कृति-स्वतंत्र विधि की आवश्यकता है । एक संभावित दृष्टिकोण माइक्रोस्कोपी27है, लेकिन यह दृष्टिकोण श्रम-प्रधान हो सकता है। अन्य प्रोटोकॉल ऐसे जीवों का पता लगाने के लिए अनुक्रम आधारित तकनीकों का उपयोग करते हैं जोसंस्कृति14, 23,27,28से बच सकते हैं । हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण अक्सर महंगे होते हैं और व्याख्या करना कठिन होता है, क्योंकि उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोणों के परिणाम आसानी से अभिकर् ती34 और बारकोड हॉपिंग35के निम्न स्तर के संदूषण से प्रभावित हो सकते हैं। इसके बजाय, एक नया दृष्टिकोण विकसित किया गया है जो प्रतिबंध खंड-लंबाई बहुरूपता के साथ संयोजन में 16S rRNA जीन के पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग करता है दोनों एंडोसिम्बियोनट और किसी भी दूषित आंत सहजीवी की कल्पना करने के लिए । इस तकनीक में एक आंतरिक पीसीआर नियंत्रण शामिल है, क्योंकि ब्लैटबैक्टीरियमके 16S जीन को अनुक्रमित किया गया है, और इसका बैंडिंग पैटर्न जीनोओबायोटिक और गैर-बाँझ दोनों कीड़ों में मौजूद होना चाहिए। चूंकि एंडोसिम्बिओनट के प्रतिबंध पैटर्न की भविष्यवाणी इसके जीनोम अनुक्रम36से की जा सकती है, इसलिए एम्प्लिकोन्स या प्रतिबंध के टुकड़ों को अनुक्रमित करने की कोई आवश्यकता नहीं है, जब तक कि किसी भी संदूषक की पहचान वांछित न हो। इस प्रोटोकॉल के वर्तमान संस्करण में पीसीआर/आरएफएलपी के लिए एक अप्सरा का बलिदान करने का आह्वान किया गया है, लेकिन इस तकनीक का उपयोग मल पर एक गैर-विनाशकारी उपाय के रूप में भी किया जा सकता है । हालांकि, इसमें बिल्ट-इन कंट्रोल शामिल नहीं होगा, क्योंकि मल में ज्यादा ब्लैटबैक्टीरियमनहीं होना चाहिए।

gnotobiotic जानवरों के पालन का एक अतिरिक्त आसानी से संशोधित अभी तक महत्वपूर्ण घटक आहार है । जबकि बीएचआई एगर कीड़ों के लिए एक अस्थायी खाद्य स्रोत के रूप में काम कर सकता है, यह पाया गया है कि इसके परिणामस्वरूप विस्तारित अवधि के लिए एकमात्र खाद्य स्रोत के रूप में उपयोग किए जाने पर नस्लों के बीच पर्याप्त विकास घाटा होता है। जबकि विविध आहार की कोशिश की गई है, ऑटोक्लेवेबल चूहा चाउ को gnotobiotic कीड़ों के रखरखाव के लिए एक नियमित आहार के रूप में सिफारिश की जाती है। विशेष रूप से नसबंदी के लिए तैयार नहीं किए गए आहार अक्सर पूरी तरह से बाँझ प्रदान करना मुश्किल होते थे, और कई बाँझ या ऑटोक्लेवेबल प्रयोगशाला पशु आहार गैर बाँझ परिस्थितियों में तेजी से कवक विकास प्रदर्शित करने के लिए पाए गए थे। गैर-बाँझ परिस्थितियों में नीचा दिखाने की इस प्रवृत्ति ने उन्हें सीधे gnotobiotic और nongnotobiotic कीड़ों की तुलना में प्रयोगों में उपयोग के लिए अनुपयुक्त प्रदान किया। अनुशंसित आहार दो समूहों के बीच विकास दर जैसी विशेषताओं की तुलना को सुविधाजनक बनाने के लिए gnotobiotic और मानक नस्लों के बीच एक सुसंगत आहार के उपयोग के लिए अनुमति देता है।

जैसा कि अन्य लोगों ने27देखा है, gnotobiotic नस्लों अपने गैर बाँझ समकक्षों की तुलना में अधिक धीरे से बढ़ता है । gnotobiotic (n = 105) और गैर बाँझ नस्लों (n = 50) के शरीर की लंबाई के बीच एक तुलना ही खिलाया, ऑटोक्लेव कृंतक आहार और कमरे के तापमान पर रखा पता चलता है कि गैर बाँझ नस्लों ०.०५९ मिमी/दिन के एक औसत हो जाना है, जबकि gnotobiotic नस्लों ०.०२८ मिमी/दिन (पी < ०.०००१)(चित्रा 5)बढ़ता है । पी अमेरिकाना में आंत माइक्रोबायोटा की उपस्थिति को कीड़ों की मेटाबोलिक दर37को बदलने के लिए दिखाया गया है, और सामान्य रूप से आंत समुदायों को पोषक तत्वों के अवशोषण38, 39को प्रभावित करने के लिए सोचाजाताहै। ये कारण gnotobiotic और गैर बाँझ नस्लों की वृद्धि दर में मनाया मतभेदों का समर्थन करते हैं ।

इस तकनीक के लिए एक संभावित सीमा यह है कि gnotobiotic नस्लों यौन परिपक्वता तक नहीं पहुंच सकता है, के रूप में सबसे पुराने बाँझ साथियों से अधिक 10 महीने पुराने है और केवल सातवें instar तक पहुंच गए है (10 में से; 11 वयस्कता जा रहा है) के रूप में शरीर की लंबाई४०द्वारा अनुमानित । ये सबसे पुराने साथियों ऑटोक्लेवेड चूहा आहार पर नहीं हैं, बल्कि इसके बजाय विकिरणित चूहा चाउ खाते हैं, एक आहार जिसमें अत्यधिक मोल्ड विकास के बिना गैर-बाँझ साथियों को खिलाने के लिए बहुत अधिक नमी होती है। प्रयोगशाला की स्थिति (कमरे के तापमान और आर्द्रता) के तहत 9−10 महीनों के बाद वयस्कता तक पहुंचने के लिए एक गैर बाँझ कुत्ते खाद्य आहार पर गैर बाँझ नस्लों पाया गया। साझा, ऑटोक्लेवेड चूहा चाउ पर gnotobiotic और nonsterile नस्लों के पलटन वर्तमान में 7 महीने से भी कम पुराने हैं, गैर बाँझ कीड़े सातवें इंस्टार (औसत: 16.7 मिमी) होने का अनुमान है, जबकि बाँझ कीड़े पांचवें स्टार (औसत: 11.2 मिमी) होने का अनुमान है। नतीजतन, हम अभी तक यह सत्यापित नहीं कर सकते कि हमारे gnotobiotic तिलचट्टे सफलतापूर्वक पुन: पेश कर सकते हैं या नहीं। हालांकि, इस दृष्टिकोण का उपयोग करके नए gnotobiotic साथियों को स्थापित किया जा सकता है, यह देखते हुए, यह विधि gnotobiotic कीड़ों के सिद्ध प्रजनन के अभाव में भी महान वादा दिखाती है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करता है जो माइक्रोबायोम शोधकर्ताओं को आम प्रयोगशाला सामग्री का उपयोग करके अपने स्वयं के, कम लागत वाले जनोटोबायोटिक "सुविधा" को संचालित करने की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग मेजबान व्यवहार, प्रतिरक्षा, विकास और तनाव प्रतिक्रियाओं को आकार देने में माइक्रोबायोटा की भूमिका की जांच करने वाले प्रयोगों के लिए जनोटोबायोटिक तिलचट्टे उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है21,26,27। इन ग्नोटोबायोटिक कीटों को सिंथेटिक या ज़ेनोबायोटिक समुदायों के साथ भी टीका लगाया जा सकता है और बाद में आंत माइक्रोबायोम अध्ययन23,28के विषयों के रूप में उपयोग किया जाता है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण के तत्व, जिनमें बैक्टीरियोलॉजिकल मीडिया-लाइन वाले इनक्यूबेशन कक्षों को अंतर्निहित बंध्यता जांच के रूप में शामिल किया गया है, अन्य मॉडल प्रणालियों के लिए सामान्य हैं और छोटे पैमाने पर सुविधाओं में gnotobiotic जानवरों के नियमित रखरखाव की सुविधा प्रदान कर सकते हैं ।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस प्रकाशन को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या R35GM133789 के तहत समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है । लेखक नसबंदी दरों, हैच दरों और gnotobiotic तिलचट्टे की विकास दर पर नज़र रखने के लिए जोसी डायर को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2X master mix New England BioLabs M0482 OneTaq MasterMix
Autoclavable rat chow Zeigler NIH-31 Modified Auto
Bacterial DNA extraction kit Omega Bio-Tek D-3350 E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube
binding buffer Omega Bio-Tek PD099 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer)
brain-heart infusion (BHI) broth Research Products International B11000
Delicate task wipes KimWipe JS-KCC-34155-PK KimWipes
DNA purification kit Omega Bio-Tek D6492 E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)
elution buffer Omega Bio-Tek PDR048 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
glass beads Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
Hybridization oven UVP 95-0330-01 we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used
Laminar flow biological safety cabinet NuAire, Inc. NU-425-400 Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity
lysozyme Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
peracetic acid stock solution (32%) Sigma-Aldrich 269336
Petroleum jelly Vaseline n/a
proteinase K buffer Omega Bio-Tek PD061 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer")
purifying buffer Omega Bio-Tek PDR042 included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer)
RsaI New England BioLabs R0167 Includes CutSmart (digestion) buffer
Secondary container n/a n/a a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes
spectrophotometer ThermoFisher ND-2000 Catalog info is for NanoDrop2000
thermal shaker Eppendorf EP5386000028 Thermomixer R
Tris-EDTA Fisher BP1338-1 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8
wash buffer Omega Bio-Tek PDR044 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer)
Woodchip bedding P.J. Murphy Forest Products Sani-Chips

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गिनाओबायोटिक अमेरिकन कॉकरोच<em>(पेरिप्लैनेटा अमेरिकाना)</em>की स्थापना और रखरखाव
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Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen, E. A. Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana). J. Vis. Exp. (171), e61316, doi:10.3791/61316 (2021).More

Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen, E. A. Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana). J. Vis. Exp. (171), e61316, doi:10.3791/61316 (2021).

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