该协议用于建立和维持侏罗育美国蟑螂(佩里普拉内塔美洲)通过表面消毒鸡蛋的情况下(oothecae)孵化前。这些侏罗纪昆虫含有垂直传播的 布拉塔细菌 内生菌,但有斧头内脏。
侏儒动物是研究微生物群结构和功能控制的有力工具。这里介绍的是建立和维护侏罗育美国蟑螂(佩里普兰塔美洲)的协议。此方法包括内置的不育检查,以进行持续的质量控制。这里的侏罗纪昆虫被定义为蟑螂,它们仍然含有垂直传播的内膜(Blattab细菌),但缺乏其他通常存在于它们表面和消化道上的微生物。对于此协议,鸡蛋盒(卵子)从(非消毒)种群中取出并进行表面消毒。一旦收集和消毒,oothecae在30°C孵育约4−6周脑心输液(BHI)agar,直到他们孵化或被移除,由于污染。孵化的仙女被转移到一个埃伦迈尔烧瓶,里面装着BHI地板、无菌水和无菌老鼠食品。为了确保仙女不会容纳在给定条件下无法在 BHI 上生长的微生物,额外的质量控制措施使用限制片段长度多态性 (RFLP) 来测试非内分泌微生物。使用这种方法产生的侏儒仙女可以接种简单或复杂的微生物群落,并用作肠道微生物群落研究的工具。
侏儒动物已被证明是微生物群研究的宝贵工具1,2,3。无细菌和定义的植物动物允许阐明宿主-微生物相互作用,包括宿主免疫反应、肠道上皮成熟和宿主代谢1、4、5、6、7。接种简化社区的侏罗育动物也有助于更全面地了解肠道社区的微生物-微生物相互作用,特别是解开交叉喂养和对抗关系8、9、10、11。目前首选的哺乳动物肠道微生物群研究模型系统是穆林模型。虽然该系统在上述发现中至关重要,但一个关键缺陷是所涉及的成本。建立和维护侏罗万象设施需要专门设备和训练有素的技术人员。这一点,结合必须给予格诺特生物动物维护的各个方面的额外照顾,导致侏罗纪动物的繁殖成本比标准动物模型12高出十到二十倍。由于成本高昂,许多研究人员可能买不起侏罗纪穆林模型。此外,虽然穆林模型可能是最广泛接受的研究选择,希望转化为人类健康,仍然有许多生理和形态差异的人和老鼠的肠道13。显然,没有一个奇异的模型足以回答越来越多的关于肠道微生物群许多方面的问题。
与哺乳动物相比,昆虫模型的维护成本较低,因此是一种更便宜的替代品。在各种昆虫物种中广泛开展无细菌和侏罗育研究,导致多种常用模型的发展。蚊子和嗜血杆菌是无细菌工作的常见模型,因为它与全球疾病和遗传可及性有关。另一个新兴的模型系统是蜜蜂(阿皮斯梅利维拉),因为它在授粉和社会研究中的重要性16。然而,许多这些常用的昆虫缺乏哺乳动物肠道群落17的分类复杂性,限制了它们模拟高阶相互作用的能力。不仅美国蟑螂肠道中微生物的完全多样性与哺乳动物更为相似,而且蟑螂肠道中存在的许多微生物都属于哺乳动物和人类肠道微生物群中常见的家族和植物。蟑螂的后腿在功能上也类似于哺乳动物的大肠,因为它是一个发酵室,里面密密麻麻地挤满了细菌,有助于提取19、20的营养物质。最后,蟑螂的杂食性允许多样化的饮食制度,这是不可能与饮食专家。
美国蟑螂可以是一个有用的模型系统,了解肠道微生物群落在更高的生物体,但蟑螂作为害虫的地位也使该系统相关害虫控制21。利用肠道社区对蟑螂健康和生理的影响的基本知识,有助于开发新的害虫管理技术。
这种方法的目的是概述一个全面描述建立和维护侏罗育美国蟑螂(佩里普兰塔美洲),但这个协议可以用来产生任何异性蟑螂的仙女。它包括一种高效、非侵入性地收集成熟卵母细胞的方法,以及一种监测昆虫22、23、24的侏罗育物状态的无损技术。虽然以前实现和维持侏罗纪蟑螂的方法描述 ootheca 集合23,24,25,26,27,ootheca 成熟度要么解释在物种特定的线索 (在布拉特拉德国22,24,25),或没有明确描述27,28,使那些不熟悉该系统的人难以实施.由于此处描述的方法使用自然掉落的卵子,因此不存在过早取卵的错误。该协议包含依赖文化和文化独立的质量控制方法,而依赖文化的方法不需要牺牲昆虫。最后,这种方法汇集了来自多种侏罗育蟑螂研究的信息,以创建一个全面的协议,为实现和维持侏罗育蟑螂提供一切必要的信息。
描述侏罗育蟑螂生成的其他方法要么没有描述骨土库的收集,要么使用特定于其他蟑螂物种的基准来指示何时可以从母体23、25、26中去除。最初,从储物罐中的木片床上用品中收集卵石,导致孵化率非常低(+10%)与非消毒乌特卡(47%)29.这可能是由于未封口的乌瑟卡随着时间的推移积累在股票笼中,没有办法验证奥特卡的年龄或生存能力。实行”产房”办法,可以收集已知年龄的新鲜存款的卵轮。这进一步促进了实验规划,因为研究人员可以预测个别卵母的可能孵化时间。最初和已公布的协议的另一项修改包括在半密封室中孵化含有超饱和氯化钠溶液的卵母和仙女。溶液的存在保持约75%30的相对湿度。Oothecae通常以30°C孵育,这已被证明可以最大限度地减少孵育所需的天数,同时最大限度地提高胚胎的生存能力和每个卵母细胞31产生的仙女数量。孵化后,在实验室室温和环境条件下,侏罗纪仙女通常在台面上培养,尽管湿度控制室再次被用于关键实验。在对 ootheca 收集和孵化进行这些更改后,孵化率增加到大约 41% (n = 51),这还不包括因污染而移除的卵母。进一步优化舱口率的潜在途径可能包括延长 ootheca 收集和灭菌之间的时间。卵壳的皮质在初始释放32时可能未完全晒黑,因此可能渗透到在灭菌过程中在丢弃后24小时内使用的溶液中。
使用0.1%的乙酸的灭菌协议是根据娃娃等人25改编的。其他研究已经记录了绝育卵母鸡23,26的替代技术。污染率基于在 BHI 倾斜上孵育卵石的无损方法。这种方法非常有利,因为它可以快速识别和清除受污染的乌瑟卡。大多数以前的协议测试可栽培生物通过电镀粪便或仙女同质化在细菌介质和检查生长22,23,25,27,28,33。在至少一个案例中,检测侏罗育状态的方法没有完全描述26。除了克莱顿在饲养瓶中加入一小块不育测试介质24个外,先前的方法22、23在细菌介质上安置了侏罗育昆虫,只是在短时间内对灭菌方案进行了初步评估。
将由此产生的仙女的继续栖体置于BHI介质上,作为一种内置的质量控制措施,允许半实时监测它们的侏罗象状态——这种技术在大多数先前的方法22、23中是看不到的。这对于需要接触侏罗万象仙女的长期实验特别有用。如果仙女下的 BHI 地板似乎受到细菌或真菌生长的污染,应丢弃烧瓶。这种类型的污染通常发生在发现烧瓶给水仙女时,但它也可能来自粪便的情况下,消毒不足的卵母细胞或食物。浇水时使用层压流罩可提高发现烧瓶造成的污染率。
由于并非所有污染物生物都可以在 BHI 介质上有氧生长,因此需要额外的培养独立无菌检测方法。一种潜在的方法是显微镜27,但这种方法可以是劳动密集型的。其他协议使用基于序列的技术来检测可能逃离培养的生物体14、23、27、28。然而,这种方法往往昂贵且难以解释,因为高通量测序方法的结果很容易受到试剂34和条形码跳跃35的低级污染的影响。相反,开发了一种新的方法,它使用PCR放大16S rRNA基因与限制片段长度多态性相结合,可视化内膜和任何污染物肠道共生体。该技术包括内部PCR控制,因为Blatta细菌的16S基因已经测序,其带状模式应同时存在于侏罗纪和非固醇昆虫中。由于内分泌物的受限模式可以从其基因组序列36中预测,因此没有必要对放大器或限制片段进行测序,除非需要识别任何污染物。此协议的当前版本要求为 PCR/RFLP 牺牲一个仙女,但此技术也可以用于粪便作为非破坏性措施。然而,它不会包括内置的控制,因为粪便不应该含有太多的布拉塔细菌。
饲养侏罗要生物动物的另一个容易改变但至关重要的组成部分是饮食。虽然BHI agar可以作为昆虫的临时食物来源,但人们发现,当长期用作唯一的食物来源时,它会导致仙女之间出现巨大的生长缺陷。虽然已经尝试了不同的饮食,但推荐自体大鼠作为维持侏罗育昆虫的常规饮食。没有专门为绝育而配制的饮食往往难以完全无菌,许多无菌或可自杀实验室动物饮食在非固醇条件下表现出快速真菌生长。这种在非固醇条件下降解的倾向使得它们不适合直接比较侏罗酸和非转基因昆虫的实验。建议的饮食允许在侏罗育物和标准仙女之间使用一致的饮食,促进两组人之间的特征(如增长率)的比较。
正如其他人观察到的27,侏罗纪仙女的生长速度比非固醇的仙女慢。侏罗万象 (n = 105) 和非星体仙女 (n = 50) 之间的比较喂养相同, 自封啮齿动物的饮食和保持在室温下显示,非星体仙女平均生长0.059毫米/天,而侏罗育仙女生长0.028毫米/天(p<0.0001)(图5)。在美国,肠道微生物群落的存在已经证明可以改变昆虫的代谢率37,而肠道群落一般被认为会影响营养吸收38,39。这些原因支持观察到的侏罗纪和非固醇仙女的增长率差异。
这种技术的一个可能限制是,侏罗纪仙女可能无法达到性成熟,因为最古老的无菌组超过10个月大,只达到第七星(10:11成年)接近体长40。这些最古老的群体不是在自封的老鼠饮食,而是吃辐照的老鼠周,这种饮食含有太多的水分,不能喂给非星体组,而不会过度的霉菌生长。在实验室条件下(室温和湿度)下,非消毒狗食饮食中的非星体仙女被发现在9−10个月后成年。共用的、自体的鼠周上,侏罗纪和非固醇性仙女的组群目前还不到7个月大,非固醇昆虫估计为第七星(平均:16.7毫米),而无菌昆虫估计为第五星(平均:11.2毫米)。因此,到目前为止,我们还不能证实我们的侏罗育蟑螂能否成功繁殖。然而,鉴于使用这种方法可以轻松建立新的侏罗育群,即使没有经过证实的侏罗育昆虫繁殖,这种方法也显示出很大的希望。
最后,该协议提供了一个多功能的工具,使微生物群研究人员能够使用常见的实验室材料操作自己的低成本侏儒”设施”。这种方法可用于生成侏托生物蟑螂的实验,检查微生物群在塑造宿主行为、免疫力、发育和应激反应方面的作用。这些侏儒昆虫也可能接种合成或异生物群落,并随后用作肠道微生物群落研究的对象23,28。此外,这种方法的要素,包括使用细菌介质衬里孵化室作为内置的不育检查,可以推广到其他模型系统,并可促进在较小规模的设施中对侏罗纪动物进行日常维护。
The authors have nothing to disclose.
本出版物由国家卫生研究院国家普通医学研究所根据编号为R35GM133789的奖项提供支持。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。作者希望确认JosyDyer跟踪绝育率、孵化率和侏罗万象蟑螂的生长速度。
2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |