Denne protokol anvendes til at etablere og vedligeholde gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana) ved overfladesterilisering af ægkasserne (oothecae) før udklækning. Disse gnotobiotiske insekter indeholder deres lodret overførte Blattabacterium endosymbionts, men har økse indvolde.
Gnotobiotiske dyr er et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af kontroller af mikrobiomstruktur og -funktion. Præsenteret her er en protokol til etablering og vedligeholdelse af gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana). Denne tilgang omfatter indbygget sterilitet kontrol for løbende kvalitetskontrol. Gnotobiotiske insekter defineres her som kakerlakker, der stadig indeholder deres lodret overførte endosymbiont (Blattabacterium), men mangler andre mikrober, der normalt bor på deres overflade og i deres fordøjelseskanal. Til denne protokol fjernes ægkasser (oothecae) fra en (nonsterile) stamkoloni og overfladesteriliseret. Når oothecae er indsamlet og steriliseret, inkuberes den ved 30 °C i ca. 4−6 uger på hjernehjerteinfusion (BHI) agar, indtil de klækkes eller fjernes på grund af forurening. Udklækkede nymfer overføres til en Erlenmeyer kolbe, der indeholder et BHI-gulv, sterilt vand og steril rottemad. For at sikre, at nymferne ikke er boliger mikrober, der ikke er i stand til at vokse på BHI i de givne betingelser, en ekstra kvalitetskontrol foranstaltning bruger begrænsning fragment-længde polymorfi (RFLP) til at teste for nonendosymbiotic mikrober. Gnotobiotiske nymfer genereret ved hjælp af denne tilgang kan podes med enkle eller komplekse mikrobielle samfund og bruges som et værktøj i tarmmikrobiomestudier.
Gnotobiotiske dyr har vist sig at være uvurderlige værktøjer til mikrobiomundersøgelser1,2,3. Kimfrie og definerede floradyr har gjort det muligt at belyse værtsmikrobeinteraktioner, herunder værtsimmunologiske reaktioner, tarmepitelemodning og værtsmetabolisme1,4,5,6,7. Gnotobiotiske dyr podet med en forenklet samfund har også bistået i en mere komplet forståelse af mikrobe-mikrobe interaktioner i en tarm samfund, specielt i optrevling cross-fodring og antagonistiske relationer8,9,10,11. Det nuværende foretrukne modelsystem til undersøgelser af pattedyrs tarmmikrobiomet er murinmodellen. Selv om dette system har været afgørende i de opdagelser, der er skitseret ovenfor, er en vigtig mangel omkostningerne. Specialiseret udstyr og højtuddannede teknikere er nødvendige for at etablere og vedligeholde et gnotobiotisk anlæg. Dette, i kombination med ekstra omhu, der skal gives til alle aspekter af gnotobiotisk dyrevedligeholdelse, får et gnotobiotisk dyr til at koste ti til tyve gange mere at opdrætte end en standarddyrmodel12. På grund af høje omkostninger, mange forskere kan være i stand til at give en gnotobiotisk murine model. Derudover, mens murinmodeller kan være det mest accepterede valg til undersøgelser, der ønsker at oversætte til menneskers sundhed, er der stadig mange fysiologiske og morfologiske forskelle mellem menneske- og museinde13. Det er klart ingen enestående model er nok til at besvare det stadigt stigende antal spørgsmål om de mange aspekter af tarmen mikrobiom.
Insektmodeller er et billigere alternativ på grund af deres lavere vedligeholdelsesomkostninger sammenlignet med pattedyrarter. Omfattende kimfri og gnotobiotisk forskning i en række insektarter har ført til udvikling af flere almindeligt anvendte modeller. Myg og Drosophila er almindelige modeller for kimfrit arbejde på grund af deres relevans for globale sygdomme og genetisk trækkraft14,15. Et andet spirende modelsystem er honningbien (Apis mellifera) i betragtning af dens betydning for bestøvning og socialitetsforskning16. Men mange af disse almindeligt anvendte insekter mangler den taksonomiske kompleksitet ses i pattedyr tarm samfund17, begrænse deres evne til at modellere højere orden interaktioner. Ikke alene er den samlede mangfoldighed af mikrober, der findes i tarmen af amerikanske kakerlakker, mere ligner pattedyr, men mange af de mikrober, der er til stede i kakerlak tarmen, tilhører familier og phyla, der almindeligvis findes i tarmmikrobiotaen hos pattedyr og mennesker18. Bagguden af kakerlakken er også funktionelt analog med tyktarmen af pattedyr, da det er et fermenteringskammer tæt pakket med bakterier for at hjælpe med udvinding af næringsstoffer19,20. Endelig giver kakerlakkernes altomfattende natur mulighed for en mangfoldighed af kostregimer, der ikke ville være mulige med diætspecialister.
Amerikanske kakerlakker kan være et nyttigt modelsystem til forståelse af tarmmikrobibielle samfund i højere organismer, men kakerlakkens status som skadedyr gør også dette system relevant for skadedyrsbekæmpelse21. Udnyttelse af grundlæggende viden om tarmsamfundets indflydelse på kakerlaksundhed og fysiologi hjælper med at udvikle nye teknikker til skadedyrsbekæmpelse.
Målet med denne metode er at skitsere en omfattende beskrivelse af etablering og vedligeholdelse af gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana), men denne protokol kan bruges til at generere nymfer af enhver oviparous kakerlak. Det omfatter en metode til effektiv, ikke-invasiv samling af modne oothecae, og en ikke-destruktiv teknik til at overvåge gnotobiotiske tilstand afinsekterne 22,23,24. Mens tidligere metoder til at opnå og vedligeholde gnotobiotiske kakerlakker beskriver ootheca-samling23,24,25,26,27, fortolkes ootheca-modenhed enten i artsspecifikke signaler (i Blattella germanica22,24,25) eller ikke udtrykkeligt beskrevet27,28, hvilket gør implementering vanskelig for dem, der ikke er bekendt med systemet. Da den her beskrevne metode bruger naturligt tabt oothecae, er fejlen ved at fjerne æg for tidligt fraværende. Denne protokol indeholder både kulturafhængige og kultur-uafhængige metoder til kvalitetskontrol, og den kulturafhængige metode kræver ikke at ofre insekter. Endelig samler denne metode oplysninger fra flere gnotobiotiske kakerlakundersøgelser for at skabe en, omfattende protokol med alle nødvendige oplysninger til at opnå og opretholde gnotobiotiske kakerlakker.
Andre metoder, der beskriver generering af gnotobiotiske kakerlakker, beskrev enten ikke oothecae-samling eller brugte benchmarks, der er specifikke for andre kakerlakarter, for at angive, hvornår oothecae kunne fjernes fra moderen23,25,26. Oprindeligt blev der indsamlet oothecae fra træflisstrøelse i lagertankene, hvilket resulterede i meget lave lugehastigheder (~10%) sammenlignet med ikke-industrialiserede oothecae (47%)29. Dette skyldes sandsynligvis, at unhatched oothecae ophobes over tid i lagerburet, og der er ingen måde at kontrollere ootheca alder eller levedygtighed. Gennemførelsen af “barselsafdelingen” gør det muligt at indsamle nyindlagte produkter af kendt alder. Dette yderligere letter eksperimentel planlægning, som forskeren kan forudse sandsynlige luge gange for de enkelte oothecae. En anden ændring fra indledende og offentliggjorte protokoller omfatter inkubation af oothecae og nymfer i halvlukkede kamre, der også indeholder en overmættet natriumchloridopløsning. Tilstedeværelsen af opløsningen opretholder en relativ luftfugtighed på ca. 75%30. Oothecae inkuberes rutinemæssigt ved 30 °C, hvilket har vist sig at minimere det antal dage, der kræves til inkubation, samtidig med at embryonernes levedygtighed og antallet af nymfer, der produceres pr. ootheca31,maksimeres. Efter udklækning dyrkes gnotobiotiske nymfer rutinemæssigt på bordpladen ved laboratorierumstemperatur og omgivende forhold, selvom fugtighedskontrollerede kamre igen bruges til kritiske eksperimenter. Efter at disse ændringer var blevet foretaget i forbindelse med indsamling og inkubation af ootheca, steg lugehastigheden til ca. 41% (n = 51), ekskl. En mulig vej til yderligere optimering af lugehastigheder kan omfatte forlængelse af tiden mellem ootheca-indsamling og sterilisering. Æggetuiets kutikula må ikke være fuldt garvet ved den første udslip32og kan derfor være gennemtrængelig for opløsninger, der anvendes under sterilisering inden for 24 timer efter sætningen.
Steriliseringsprotokollen med 0,1% pereddikesyre blev tilpasset fra Doll et al.25. Andre undersøgelser har dokumenteret alternative teknikker til sterilisering af oothecae23,26. Kontamineringshastighederne er baseret på den ikke-destruktive metode til inkubation af oothecae på en BHI-skråning. Denne fremgangsmåde er yderst fordelagtig, da den giver mulighed for hurtig identifikation og fjernelse af forurenet oothecae. De fleste tidligere protokoller test for kulturable organismer ved plating afføring eller nymfe homogenat på bakteriologiske medier og kontrol for vækst22,23,25,27,28,33. I mindst ét tilfælde var metoden til test af gnotobiotisk status ikke fuldt ud beskrevet26. Undtagen Clayton, der tilføjede en lille plade af sterilitetstestmedium til opdræt af flasker24, tidligere metoder22,23 husede gnotobiotiske insekter på bakteriologiske medier kun i korte perioder for i første omgang at evaluere steriliseringsprotokollen.
Fortsat hus af de resulterende nymfer på BHI medium som en indbygget kvalitetskontrol foranstaltning gør det muligt at overvåge deres gnotobiotiske status i semi-real-time-en teknik, der ikke ses i de fleste tidligere metoder22,23. Dette er især nyttigt til langsigtede eksperimenter, der kræver gnotobiotiske nymfer, der skal tilgås. Hvis BHI-gulvet under nymfer forekommer forurenet med bakteriel eller svampevækst, skal kolben kasseres. Denne type forurening opstår typisk ved udspørning af kolberne til vandnymfer, men det kan også opstå fra afføring i tilfælde af utilstrækkeligt steriliseret oothecae eller mad. Brugen af en laminar flow hætte, når vanding forbedrer forureningshastigheden forårsaget af udsløring af kolber.
Da ikke alle kontaminerende organismer kan vokse aerobt på BHI-mediet, kræves der en yderligere kulturafhængig metode til sterilitetstest. En potentiel tilgang er mikroskopi27, men denne tilgang kan være arbejdskrævende. Andre protokoller anvender sekvensbaserede teknikker til at detektere organismer , der kan undslippe kultur14,23,27,28. Sådanne tilgange er imidlertid ofte dyre og svære at fortolke, da resultaterne af højgennemstrømningssekvenseringsmetoder let kan påvirkes af lavniveauforurening af reagenser34 og stregkodehopping35. I stedet er der udviklet en ny tilgang, der bruger PCR-forstærkning af 16S rRNA-genet i kombination med begrænsningsfragmentlængdepolymorfi til at visualisere både endosymbionten og eventuelle forurenende tarmsymposbionter. Denne teknik omfatter en intern PCR-kontrol, da Blattabacteriums16S-gen er blevet sekventeret, og dets båndmønster skal være til stede i både gnotobiotiske og nonsterile insekter. Da endosymbiontens begrænsningsmønster kan forudsiges ud fra dets genomsekvens36, er der ingen grund til at sekvensere ampliconerne eller begrænsningsfragmenterne, medmindre der ønskes identifikation af forurenende stoffer. Den nuværende version af denne protokol opfordrer til en nymfe, der skal ofres for PCR / RFLP, men denne teknik kan også bruges på afføring som en ikke-destruktiv foranstaltning. Det vil dog ikke omfatte en indbygget kontrol, da afføringen ikke bør indeholde meget Blattabacterium.
En yderligere let modificerbar, men kritisk komponent i opdræt af gnotobiotiske dyr er kost. Mens BHI agar kan tjene som en midlertidig fødekilde for insekterne, har det vist sig, at det resulterer i betydelige vækstunderskud blandt nymfer, når de anvendes som den eneste fødekilde i længere perioder. Mens forskellige kostvaner er blevet prøvet, anbefales autokraperbar rotte chow som en rutinemæssig kost til vedligeholdelse af gnotobiotiske insekter. Kostvaner, der ikke specifikt er formuleret til sterilisering, var ofte vanskelige at gøre fuldt sterile, og mange sterile eller autokrabbare laboratoriedyrdiæter viste sig at udvise hurtig svampevækst under ikke-sterile forhold. Denne tendens til nedbrydning under ikke-erhvervsmæssige forhold gjorde dem uegnede til brug i forsøg, der direkte sammenlignede gnotobiotiske og ikke-agnotobiotiske insekter. Den anbefalede kost giver mulighed for brug af en konsekvent kost mellem gnotobiotiske og standard nymfer, hvilket letter sammenligningen af egenskaber – såsom vækstrater – mellem de to grupper.
Som andre har observeret27, vokser de gnotobiotiske nymfer langsommere end deres nonsterile modstykker. En sammenligning mellem kropslængder af gnotobiotiske (n = 105) og nonsterile nymfer (n = 50) fodret med det samme, autoklaveret gnaver kost og holdes ved stuetemperatur afslører, at nonsterile nymfer vokser i gennemsnit 0,059 mm/dag, mens gnotobiotiske nymfer vokser 0,028 mm/ dag (p < 0,0001) (Figur 5). Tilstedeværelsen af tarmmikrobiota i P. americana har vist sig at ændre insekternes stofskifte37, og tarmsamfund generelt menes at påvirke næringsstofabsorptionen38,39. Disse grunde understøtter de observerede forskelle i vækstraten for gnotobiotiske og nonsterile nymfer.
En mulig begrænsning af denne teknik er, at gnotobiotiske nymfer muligvis ikke når seksuel modenhed, da de ældste sterile kohorter er mere end 10 måneder gamle og kun har nået den syvende instar (ud af 10; 11 er voksenalderen) som tilnærmet af kropslængde40. Disse ældste kohorter er ikke på autoklaveret rotte kost, men i stedet spise bestrålet rotte chow, en kost, der indeholder for meget fugt til at fodre til nonsterile kohorter uden overdreven skimmelvækst. Nonsterile nymfer på en nonsterilized hundemad kost blev fundet at nå voksenalderen efter 9−10 måneder under laboratorieforhold (stuetemperatur og fugtighed). Kohorter af gnotobiotiske og nonsterile nymfer på den fælles, autoklaverede rotte chow er i øjeblikket mindre end 7 måneder gamle, nonsterile insekter anslås at være syvende instar (gennemsnit: 16,7 mm), mens sterile insekter skønnes at være femte instar (gennemsnit: 11,2 mm). Som følge heraf kan vi endnu ikke kontrollere, om vores gnotobiotiske kakerlakker med succes kan reproducere. Men i betragtning af den lethed, hvormed nye gnotobiotiske kohorter kan etableres ved hjælp af denne tilgang, viser denne metode store løfter selv i mangel af dokumenteret reproduktion af gnotobiotiske insekter.
Afslutningsvis giver denne protokol et alsidigt værktøj, der gør det muligt for mikrobiomforskere at drive deres egen, billige gnotobiotiske “facilitet” ved hjælp af almindelige laboratoriematerialer. Denne tilgang kan bruges til at generere gnotobiotiske kakerlakker til eksperimenter, der undersøger mikrobiotas rolle i udformningen af værtsadfærd, immunitet, udvikling ogstressresponser 21,26,27. Disse gnotobiotiske insekter kan også podes med enten syntetiske eller xenobiotiske samfund og efterfølgende anvendes som forsøgspersoner for tarmmikrobiomeundersøgelser23,28. Desuden kan elementer af denne tilgang, herunder anvendelse af bakteriologiske medieforede inkubationskamre som indbygget sterilitetskontrol, generaliseres til andre modelsystemer og kan lette rutinemæssig vedligeholdelse af gnotobiotiske dyr i mindre anlæg.
The authors have nothing to disclose.
Denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences fra National Institutes of Health under tildelingsnummer R35GM133789. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis det officielle synspunkt fra National Institutes of Health. Forfatterne vil gerne anerkende Josey Dyer for sporing af steriliseringsrater, lugehastigheder og vækstrater for de gnotobiotiske kakerlakker.
2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |