Denne protokollen brukes til å etablere og vedlikeholde gnotobiotiske amerikanske (Periplaneta americana) ved overflatesterilisering av eggkassene (oothecae) før klekking. Disse gnotobiotiske insekter inneholder sine vertikalt overførte Blattabacterium endosymbionts, men har akseniske tarmer.
Gnotobiotiske dyr er et kraftig verktøy for studiet av kontroller på mikrobiomestruktur og funksjon. Presentert her er en protokoll for etablering og vedlikehold av gnotobiotiske amerikanske (Periplaneta americana). Denne tilnærmingen inkluderer innebygde sterilitetskontroller for kontinuerlig kvalitetskontroll. Gnotobiotiske insekter er her definert som som fortsatt inneholder deres vertikalt overførte endosymbiont (Blattabacterium), men mangler andre mikrober som normalt ligger på overflaten og i fordøyelseskanalen. For denne protokollen fjernes eggkasser (oothecae) fra en (ikke-steril) lagerkoloni og overflatesterilisert. Når den er samlet og sterilisert, inkuberes oothecaen ved 30 °C i ca. 4-6 uker på hjernehjerteinfusjon (BHI) agar til de klekkes eller fjernes på grunn av forurensning. Klekkede nymfer overføres til en Erlenmeyer-kolbe som inneholder et BHI-gulv, sterilt vann og steril rottemat. For å sikre at nymfene ikke huser mikrober som ikke er i stand til å vokse på BHI under de gitte forholdene, bruker et ekstra kvalitetskontrolltiltak begrensning fragmentlengde polymorfisme (RFLP) for å teste for ikke-dosymbiotiske mikrober. Gnotobiotiske nymfer generert ved hjelp av denne tilnærmingen kan inokuleres med enkle eller komplekse mikrobielle samfunn og brukes som et verktøy i tarmmikrobiomestudier.
Gnotobiotiske dyr har vist seg å være uvurderlige verktøy for mikrobiomestudier1,2,3. Bakteriefrie og definerte floradyr har tillatt belysning av vertsmikrobeinteraksjoner, inkludert vertsimmunologiske responser, tarmepiteriemodning og vertsmetabolisme1,4,5,6,7. Gnotobiotiske dyr inokulert med et forenklet samfunn har også bistått i en mer fullstendig forståelse av mikrobe-mikrobe interaksjoner i et tarmsamfunn, spesielt i unraveling kryssfôring og antagonistiske forhold8,9,10,11. Det nåværende foretrukne modellsystemet for studier i pattedyret tarmmikrobiom er murinmodellen. Selv om dette systemet har vært avgjørende i funnene som er skissert ovenfor, er en viktig mangel kostnadene som er involvert. Spesialisert utstyr og høyt utdannede teknikere er nødvendige for å etablere og vedlikeholde et gnotobiotisk anlegg. Dette, i kombinasjon med ekstra forsiktighet som må gis til alle aspekter av gnotobiotisk dyrevedlikehold, fører til at et gnotobiotisk dyr koster ti til tjue ganger mer å avle enn en standard dyremodell12. På grunn av høye kostnader kan mange forskere ikke ha råd til en gnotobiotisk murinmodell. I tillegg, mens murine modeller kan være det mest aksepterte valget for studier som ønsker å oversette til menneskers helse, er det fortsatt mange fysiologiske og morfologiske forskjeller mellom menneske- og muse tarm13. Det er klart at ingen entallsmodell er nok til å svare på det stadig økende antallet spørsmål om de mange aspektene ved tarmmikrobiomet.
Insektmodeller er et billigere alternativ på grunn av deres lavere vedlikeholdskostnader i forhold til pattedyrarter. Omfattende bakteriefri og gnotobiotisk forskning i en rekke insektarter har ført til utvikling av flere ofte brukte modeller. Mygg og Drosophila er vanlige modeller for bakteriefritt arbeid på grunn av deres relevans for globale sykdommer og genetisk tractability14,15. Et annet fremvoksende modellsystem er honningbien (Apis mellifera), gitt sin betydning i pollinering og sosialitetsforskning16. Imidlertid mangler mange av disse ofte brukte insekter den taksonomiske kompleksiteten sett i pattedyr tarmsamfunn17, og begrenser deres evne til å modellere høyere ordens interaksjoner. Ikke bare er det totale mangfoldet av mikrober som finnes i tarmen til amerikanske mer lik pattedyr, men mange av mikroberene som er tilstede i tarmen tilhører familier og phyla som ofte finnes i tarmmikrobiota av pattedyr og mennesker18. Bakenden av er også funksjonelt analog med tykktarmen av pattedyr, da det er et gjæringskammer tett pakket med bakterier for å hjelpe til med utvinning av næringsstoffer19,20. Til slutt gir altomfattende natur et mangfold av diettregimer som ikke ville være mulig med kostholdsspesialister.
Amerikanske kan være et nyttig modellsystem for å forstå tarmmikrobielle samfunn i høyere organismer, men status som gjør også dette systemet relevant for skadedyrskontroll21. Utnytte grunnleggende kunnskap om tarmsamfunnets innflytelse på helse og fysiologi bidrar til å utvikle nye teknikker for skadedyrshåndtering.
Målet med denne metoden er å skissere en omfattende beskrivelse av etablering og vedlikehold av gnotobiotiske amerikanske (Periplaneta americana), men denne protokollen kan brukes til å generere nymfer av enhver oviparøs. Det inkluderer en metode for effektiv, ikke-invasiv samling av moden oothecae, og en ikke-ødeleggende teknikk for å overvåke gnotobiotisk status for insekter22,23,24. Mens tidligere metoder for å oppnå og vedlikeholde gnotobiotiske beskriver ootheca samling23,24,25,26,27, ootheca modenhet er enten tolket i form av artsspesifikke signaler (i Blattella germanica22,24,25), eller ikke eksplisitt beskrevet27,28, noe som gjør implementering vanskelig for de ukjente med systemet. Siden metoden beskrevet her bruker naturlig droppet oothecae, er feilen ved å fjerne egg for tidlig fraværende. Denne protokollen inneholder både kulturavhengige og kulturuavhengige metoder for kvalitetskontroll, og den kulturavhengige metoden krever ikke å ofre insekter. Til slutt samler denne metoden informasjon fra flere gnotobiotiske kakerlakkstudier for å lage en omfattende protokoll med all nødvendig informasjon for å oppnå og vedlikeholde gnotobiotiske.
Andre metoder som beskriver generering av gnotobiotiske beskrev enten ikke oothecae-samlingen eller brukte benchmarks som er spesifikke for andre kakerlakkarter for å indikere når oothecae kunne fjernes fra moren23,25,26. Opprinnelig ble oothecae samlet inn fra woodchip sengetøy i lagertankene, noe som resulterte i svært lave lukehastigheter (~ 10%) sammenlignet med ikke-steroid oothecae (47 %)29. Dette skyldes sannsynligvis det faktum at unhatched oothecae akkumuleres over tid i lagerburet, og det er ingen måte å verifisere ootheca alder eller levedyktighet. Implementering av “barselavdelingen” -tilnærmingen tillater innsamling av nyavsatt oothecae av kjent alder. Dette letter videre eksperimentell planlegging, da forskeren kan forutse sannsynlige luketider for individuell oothecae. En annen modifikasjon fra innledende og publiserte protokoller inkluderer inkubasjon av oothecae og nymfer i halvforseglede kamre som også inneholder en overmettet natriumkloridoppløsning. Tilstedeværelsen av løsningen opprettholder en relativ fuktighet på ca. 75%30. Oothecae inkuberes rutinemessig ved 30 °C, noe som har vist seg å minimere antall dager som kreves for inkubasjon, samtidig som embryoenes levedyktighet og antall nymfer produseres per ootheca31. Etter klekking dyrkes gnotobiotiske nymfer rutinemessig på benken ved laboratorietemperatur og omgivelsesforhold, selv om fuktighetskontrollerte kamre igjen brukes til kritiske eksperimenter. Etter etablering av disse endringene i ootheca innsamling og inkubasjon økte lukehastighetene til ca. 41% (n = 51), ikke inkludert oothecae fjernet på grunn av forurensning. En potensiell vei til ytterligere optimalisering av lukehastigheter kan omfatte å forlenge tiden mellom ootheca-innsamling og sterilisering. Kutikylen i eggkassen kan ikke være fullt solbrun ved første utgivelse32, og kan derfor være gjennomtrengelig for løsninger som brukes under sterilisering innen 24 timer etter å ha blitt droppet.
Steriliseringsprotokollen ved hjelp av 0,1% peratisk syre ble tilpasset fra Doll et al.25. Andre studier har dokumentert alternative teknikker for sterilisering av oothecae23,26. Forurensningsrater er basert på den ikke-ødeleggende metoden for å inkubere oothecae på en BHI-skråning. Denne tilnærmingen er svært fordelaktig, da den gir mulighet for rask identifisering og fjerning av forurenset oothecae. De fleste tidligere protokoller tester for dyrkbare organismer ved å plating avføring eller nymfe homogenat på bakteriologiske medier og se etter vekst22,23,25,27,28,33. I minst ett tilfelle ble metoden for testing av gnotobiotisk status ikke fullstendig beskrevet26. Bortsett fra Clayton som la til en liten plate med sterilitetstesting middels til oppdrettsflasker24, tidligere metoder22,23 huset gnotobiotiske insekter på bakteriologiske medier bare i korte perioder for å først evaluere steriliseringsprotokollen.
Fortsatt hus av de resulterende nymfer på BHI medium som et innebygd kvalitetskontrolltiltak gjør at deres gnotobiotiske status kan overvåkes i semi-sanntid – en teknikk som ikke er sett i de fleste tidligere metoder22,23. Dette er spesielt nyttig for langsiktige eksperimenter som krever gnotobiotiske nymfer for å få tilgang til. Hvis BHI-gulvet under nymfer virker forurenset med bakteriell eller soppvekst, bør kolben kastes. Denne typen forurensning oppstår vanligvis når du avdekker kolber til vannnymfer, men det kan også oppstå fra avføringen ved utilstrekkelig sterilisert oothecae eller mat. Bruken av en laminær strømningshette ved vanning forbedrer forurensningshastigheten forårsaket av å avdekke kolber.
Siden ikke alle forurensende organismer kan vokse aerobt på BHI-medium, er det nødvendig med en ekstra kulturuavhengig sterilitetsmetode. En potensiell tilnærming er mikroskopi27, men denne tilnærmingen kan være arbeidskrevende. Andre protokoller bruker sekvensbaserte teknikker til å oppdage organismer som kan unnslippe kultur14,23,27,28. Imidlertid er slike tilnærminger ofte dyre og vanskelige å tolke, da resultatene av høygjennomstrømningssekvenseringsmetoder lett kan påvirkes av lavnivåforurensning av reagenser34 og strekkodehopping35. I stedet er det utviklet en ny tilnærming som bruker PCR-forsterkning av 16S rRNA-genet i kombinasjon med begrensning av fragmentlengdepolymorfisme for å visualisere både endosymbiont og eventuelle forurensende tarmsympmioner. Denne teknikken inkluderer en intern PCR-kontroll, siden Blattabacteriums16S-gen har blitt sekvensert, og båndmønsteret skal være til stede i både gnotobiotiske og ikke-steroide insekter. Siden endosymbionts begrensningsmønster kan forutsies fra sin genomsekvens36, er det ikke nødvendig å sekvensere amfikanene eller begrensningsfragmentene, med mindre identifisering av forurensning er ønsket. Den nåværende versjonen av denne protokollen krever at en nymfe ofres for PCR / RFLP, men denne teknikken kan også brukes på avføring som et ikke-ødeleggende tiltak. Det vil imidlertid ikke inkludere en innebygd kontroll, da avføringen ikke skal inneholde mye Blattabacterium.
En ekstra lett modifiserbar, men kritisk komponent for oppdrett av gnotobiotiske dyr er kosthold. Mens BHI agar kan tjene som en midlertidig matkilde for insekter, har det blitt funnet at det resulterer i betydelige vekstunderskudd blant nymfer når den brukes som eneste matkilde i lengre perioder. Mens ulike dietter har blitt prøvd, anbefales autoklaverbar rotte chow som et rutinemessig kosthold for vedlikehold av gnotobiotiske insekter. Dietter som ikke er spesielt formulert for sterilisering, var ofte vanskelige å gjengi helt sterile, og mange sterile eller autoklaverbare laboratoriedyr dietter ble funnet å vise rask soppvekst under ikke-sterile forhold. Denne tendensen til å forringe under ikke-steroide forhold gjorde dem uegnet til bruk i eksperimenter som direkte sammenlignet gnotobiotiske og nongnotobiotiske insekter. Det anbefalte kostholdet tillater bruk av et konsistent kosthold mellom gnotobiotiske og standard nymfer, noe som letter sammenligning av egenskaper – for eksempel vekstrater – mellom de to gruppene.
Som andre har observert27, vokser de gnotobiotiske nymfene langsommere enn deres ikke-steroide kolleger. En sammenligning mellom kroppslengder av gnotobiotisk (n = 105) og ikke-steroide nymfer (n = 50) matet det samme, autoklavert gnagerdiett og holdt ved romtemperatur avslører at ikke-steroide nymfer vokser i gjennomsnitt 0,059 mm/dag, mens gnotobiotiske nymfer vokser 0,028 mm/dag (p < 0,0001) (Figur 5). Tilstedeværelsen av tarmmikrobiota i P. americana har vist seg å endre insektenes metabolske rate37, og tarmsamfunn generelt antas å påvirke næringsopptaket38,39. Disse årsakene støtter de observerte forskjellene i vekstraten av gnotobiotiske og ikke-steroide nymfer.
En mulig begrensning i denne teknikken er at gnotobiotiske nymfer kanskje ikke når seksuell modenhet, da de eldste sterile kohortene er mer enn 10 måneder gamle og bare har nådd den syvende instar (av 10; 11 er voksen alder) så omtrentlig etter kroppslengde40. Disse eldste kohortene er ikke på autoklaved rotte diett, men i stedet spise bestrålet rotte chow, en diett som inneholder for mye fuktighet til å mate til ikke-steroide kohorter uten overdreven muggvekst. Ikke-steroide nymfer på et ikke-steroid hundematdiett ble funnet å nå voksen alder etter 9-10 måneder under laboratorieforhold (romtemperatur og fuktighet). Kohorter av gnotobiotiske og ikke-sterile nymfer på de delte, autoklavede rotte chow er for tiden mindre enn 7 måneder gamle, ikke-sterile insekter anslås å være syvende instar (gjennomsnitt: 16,7 mm) mens sterile insekter anslås å være femte instar (gjennomsnitt: 11,2 mm). Som et resultat kan vi ennå ikke bekrefte om våre gnotobiotiske kan reprodusere. Men gitt den enkle som nye gnotobiotiske kohorter kan etableres ved hjelp av denne tilnærmingen, viser denne metoden stort løfte selv i fravær av bevist reproduksjon av gnotobiotiske insekter.
Til slutt gir denne protokollen et allsidig verktøy som gjør det mulig for mikrobiomeforskere å drive sitt eget, rimelige gnotobiotiske “anlegg” ved hjelp av vanlige laboratoriematerialer. Denne tilnærmingen kan brukes til å generere gnotobiotiske for eksperimenter som undersøker mikrobiotaens rolle i å forme vertsadferd, immunitet, utvikling ogstressresponser 21,26,27. Disse gnotobiotiske insekter kan også inokuleres med enten syntetiske eller xenobiotiske samfunn og senere brukes som forsøkspersoner for tarmmikrobiomestudier23,28. Videre er elementer av denne tilnærmingen, inkludert bruk av bakteriologiske medieforede inkubasjonskamre som en innebygd sterilitetskontroll, generaliserbare for andre modellsystemer og kan lette rutinemessig vedlikehold av gnotobiotiske dyr i mindre anlegg.
The authors have nothing to disclose.
Denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under tildelingsnummer R35GM133789. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis det offisielle synet på National Institutes of Health. Forfatterne ønsker å anerkjenne Josey Dyer for sporing av steriliseringshastigheter, lukehastigheter og vekstrater for de gnotobiotiske.
2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |