Detta protokoll används för att upprätta och upprätthålla gnotobiotiska amerikanska kackerlackor (Periplaneta americana) genom att ytsterilisera äggfallen (oothecae) före kläckning. Dessa gnotobiotiska insekter innehåller sina vertikalt överförda Blattabacterium endosymbionts men har yxniska tarmar.
Gnotobiotiska djur är ett kraftfullt verktyg för studier av kontroller på mikrobiomstruktur och funktion. Presenteras här är ett protokoll för etablering och underhåll av gnotobiotiska amerikanska kackerlackor (Periplaneta americana). Detta tillvägagångssätt omfattar inbyggda sterilitetskontroller för kontinuerlig kvalitetskontroll. Gnotobiotiska insekter definieras här som kackerlackor som fortfarande innehåller deras vertikalt överförda endosymbiont (Blattabacterium) men saknar andra mikrober som normalt bor på deras yta och i matsmältningssystemet. För detta protokoll avlägsnas äggfall (oothecae) från en (icke-steril) lagerkoloni och ytan steriliserad. När oothecae har samlats in och steriliserats den vid 30 °C i cirka 4−6 veckor på hjärnhjärtats infusion (BHI) agar tills de kläcks eller avlägsnas på grund av förorening. Kläckta nymfer överförs till en Erlenmeyerkolv som innehåller ett BHI-golv, sterilt vatten och steril råttmat. För att säkerställa att nymferna inte innehåller mikrober som inte kan växa på BHI under de givna förhållandena använder en ytterligare kvalitetskontrollåtgärd begränsningsfragmentlängd polymorfism (RFLP) för att testa för icke-dosymbiotiska mikrober. Gnotobiotiska nymfer som genereras med detta tillvägagångssätt kan vaccineras med enkla eller komplexa mikrobiella samhällen och användas som ett verktyg i tarmfloran studier.
Gnotobiotiska djur har visat sig vara ovärderliga verktyg för mikrobiomstudier1,2,3. Bakteriefria och definierade flora djur har tillåtit klargörande av värd-mikrob interaktioner, inklusive värd immunologiska svar, tarm epitelial mognad och värdmetabolism1,4,5,6,7. Gnotobiotiska djur inokulerade med ett förenklat samhälle har också hjälpt till med en mer fullständig förståelse av mikrob-mikrobinteraktioner i ett tarmsamhälle, särskilt för att riva upp korsmatning och antagonistiskarelationer 8,9,10,11. Det nuvarande föredragna modellsystemet för studier i däggdjursmagsmikrobiomet är murinmodellen. Även om detta system har varit avgörande i de upptäckter som beskrivs ovan, är en viktig brist kostnaden. Specialiserad utrustning och högutbildade tekniker är nödvändiga för att etablera och underhålla en gnotobiotisk anläggning. Detta, i kombination med extra omsorg som måste ges till varje aspekt av gnotobiotiskt djurunderhåll, gör att ett gnotobiotiskt djur kostar tio till tjugo gånger mer att odla än en vanlig djurmodell12. På grund av höga kostnader kan många forskare inte ha råd med en gnotobiotisk murinmodell. Dessutom, medan murinmodeller kan vara det mest accepterade valet för studier som vill översättas till människors hälsa, finns det fortfarande många fysiologiska och morfologiska skillnader mellan mänskliga och mus tarmar13. Uppenbarligen räcker det inte med någon ovanlig modell för att svara på det ständigt ökande antalet frågor om de många aspekterna av tarmfloran.
Insektsmodeller är ett billigare alternativ på grund av deras lägre underhållskostnad i jämförelse med däggdjursarter. Omfattande bakteriefri och gnotobiotisk forskning i en mängd olika insektsarter har lett till utveckling av flera vanliga modeller. Myggor och Drosophila är vanliga modeller för bakteriefritt arbete på grund av deras relevans för globala sjukdomar och genetisk tractability14,15. Ett annat framväxande modellsystem är honungsbiet (Apis mellifera), med tanke på dess betydelse i pollinerings- och socialitetsforskning16. Många av dessa vanliga insekter saknar dock den taxonomiska komplexiteten som ses i däggdjurs gut communities17, vilket begränsar deras förmåga att modellera högre ordningsinteraktioner. Inte bara är den totala mångfalden av mikrober som finns i tarmen av amerikanska kackerlackor mer lik däggdjur, men många av mikroberna som finns i kackerlacksmagen tillhör familjer och phyla som ofta finns i tarmfloran hos däggdjur och människor18. Kackerlackans bakben är också funktionellt analogt med tjocktarmen hos däggdjur, eftersom det är en jäsningskammare tätt packad med bakterier för att hjälpa till vidextraktion av näringsämnen 19,20. Slutligen tillåter kackerlackornas allätande natur en mångfald av dietregimer som inte skulle vara möjliga med kostspecialister.
Amerikanska kackerlackor kan vara ett användbart modellsystem för att förstå tarmmikrobiella samhällen i högre organismer, men kackerlackans status som skadedjur gör också detta system relevant för skadedjursbekämpning21. Genom att utnyttja grundläggande kunskaper om tarmsamhällets påverkan på kackerlackans hälsa och fysiologi hjälper man till att utveckla nya tekniker för skadedjursbekämpning.
Målet med denna metod är att beskriva en omfattande beskrivning av etablering och underhåll av gnotobiotiska amerikanska kackerlackor (Periplaneta americana), men detta protokoll kan användas för att generera nymfer av någon oviparous kackerlacka. Den innehåller en metod för effektiv, icke-invasiv samling av mogen oothecae och en icke-förstörande teknik för att övervaka gnotobiotisk status hosinsekterna 22,23,24. Medan tidigare metoder för att uppnå och upprätthålla gnotobiotiska kackerlackor beskriver ootheca samling23,24,25,26,27, ootheca mognad tolkas antingen i termer av artspecifika ledtrådar (i Blattella germanica22,24,25), eller inte uttryckligen beskrivs27,28, vilket gör genomförandet svårt för dem som inte är bekanta med systemet. Eftersom metoden som beskrivs här använder naturligt tappade oothecae, är felet att ta bort ägg i förtid frånvarande. Detta protokoll innehåller både kulturberoende och kulturoberoende metoder för kvalitetskontroll, och den kulturberoende metoden kräver inte att man offrar insekter. Slutligen sammanför denna metod information från flera gnotobiotiska kackerlacksstudier för att skapa ett omfattande protokoll med all nödvändig information för att uppnå och upprätthålla gnotobiotiska kackerlackor.
Andra metoder som beskriver generering av gnotobiotiska kackerlackor beskrev antingen inte oothecae-samlingen eller använde riktmärken som är specifika för andra kackerlacksarter för att ange när oothecae kunde avlägsnas frånmodern 23,25,26. Ursprungligen samlades oothecae från flissängkläderna i lagertankarna, vilket resulterade i mycket låga kläckningshastigheter (~ 10%) jämfört med icke-steriliserad oothecae (47%)29. Detta beror sannolikt på det faktum att unhatched oothecae ackumuleras över tiden i lagerburen, och det finns inget sätt att verifiera ootheca ålder eller livskraft. Genomförandet av “moderskapsavdelningen” gör det möjligt att samla in nyligen deponerade oothecae av känd ålder. Detta underlättar ytterligare experimentell planering, eftersom forskaren kan förutse sannolika kläckningstider för enskilda oothecae. En annan modifiering från de första och publicerade protokollen omfattar inkubation av oothecae och nymfer i halvtätade kamrar som också innehåller en övermättad natriumkloridlösning. Närvaron av lösningen upprätthåller en relativ fuktighet på cirka 75%30. Odeka är rutinmässigt inkuberade vid 30 °C, vilket har visat sig minimera antalet dagar som krävs för inkubation samtidigt som embryonas livskraft och antalet nymfer som produceras per ootheca31 maximeras. Efter kläckning odlas gnotobiotiska nymfer rutinmässigt på bänkskivan vid laboratorierumstemperatur och omgivningsförhållanden, även om fuktkontrollerade kammare återigen används för kritiska experiment. Efter etablering av dessa förändringar i ootheca insamling och inkubation ökade kläckningshastigheterna till cirka 41% (n = 51), exklusive oothecae bort på grund av förorening. En potentiell väg till ytterligare optimering av kläckningshastigheter kan inkludera att förlänga tiden mellan ootheca-insamling och sterilisering. Äggets nagelband får inte vara helt garvat vid förstafrisättningen 32, och kan därför vara genomsläppligt för lösningar som används under sterilisering inom 24 timmar efter att ha tappats.
Sterilisering protokollet med 0,1% peracetic syra anpassades från Docka et al.25. Andra studier har dokumenterat alternativa tekniker för sterilisering av oothecae23,26. Kontamineringshastigheterna baseras på den icke-förstörande metoden att inkubera oothecae på en BHI-vinkling. Detta tillvägagångssätt är mycket fördelaktigt eftersom det möjliggör snabb identifiering och avlägsnande av förorenade oothecae. De flesta tidigare protokolltest för odlingsbara organismer genom plätering av avföring eller nymf homogenat på bakteriologiska medier och kontroll förtillväxt 22,23,25,27,28,33. I minst ett fall beskrevs inte metoden för att testa gnotobiotiska status fullt ut26. Förutom Clayton som lade till en liten platta av sterilitetstestmedel tilluppfödningsflaskor 24, tidigaremetoder 22,23 inrymde gnotobiotiska insekter på bakteriologiska medier endast under korta tidsperioder för att initialt utvärdera steriliseringsprotokollet.
Fortsatt hölje av de resulterande nymferna på BHI-medium som en inbyggd kvalitetskontrollåtgärd gör att deras gnotobiotiska status kan övervakas i halv realtid – en teknik som inte setts i de flesta tidigare metoder22,23. Detta är särskilt användbart för långsiktiga experiment som kräver att gnotobiotiska nymfer nås. Om BHI-golvet under nymfer verkar förorenat med bakteriell eller svamptillväxt, ska kolven kasseras. Denna typ av förorening uppstår vanligtvis när kolvarna avtäcks för att vattna nymfer, men det kan också uppstå från avföringen vid otillräckligt steriliserad oothecae eller mat. Användningen av en laminär flödeshuv vid vattning förbättrar föroreningshastigheten som orsakas av avtäckt av flaskor.
Eftersom inte alla förorenande organismer kan växa aerobiskt på BHI-medium krävs ytterligare en kulturoberoende sterilitetstestmetod. Ett potentiellt tillvägagångssätt är mikroskopi27, men detta tillvägagångssätt kan vara arbetsintensivt. Andra protokoll använder sekvensbaserade tekniker för att upptäcka organismer som kan undkomma kultur14,23,27,28. Sådana tillvägagångssätt är dock ofta dyra och svåra att tolka, eftersom resultaten av sekvenseringsmetoder med hög genomströmning lätt kan påverkas av lågnivåförorening av reagenser34 och streckkodshoppning35. Istället har ett nytt tillvägagångssätt utvecklats som använder PCR-förstärkning av 16S rRNA-genen i kombination med restriktionsfragmentlängdspolymorfism för att visualisera både endosymbionten och eventuella förorenande tarm symbionter. Denna teknik inkluderar en intern PCR kontroll, eftersom Blattabacteriums16S gen har sekvenserats, och dess banding mönster bör vara närvarande i både gnotobiotiska och nonsterile insekter. Eftersom endosymbiontens begränsningsmönster kan förutsägas från dess genomsekvens36, finns det inget behov av att sekvensera ampliconerna eller begränsningsfragmenten, såvida inte identifiering av något främmande medel önskas. Den nuvarande versionen av detta protokoll kräver att en nymf offras för PCR / RFLP, men denna teknik kan också användas på avföring som en icke-förstörande åtgärd. Det kommer dock inte att innehålla en inbyggd kontroll, eftersom avföringen inte bör innehålla mycket Blattabacterium.
En ytterligare lätt modifierbar men kritisk komponent i uppfödning av gnotobiotiska djur är kost. Medan BHI agar kan fungera som en tillfällig livsmedelskälla för insekterna, har det visat sig att det resulterar i betydande tillväxtunderskott bland nymfer när de används som den enda livsmedelskällan under längre perioder. Medan olika dieter har provats, rekommenderas autoklaverbar rått chow som en rutindiet för underhåll av gnotobiotiska insekter. Dieter som inte specifikt formulerats för sterilisering var ofta svåra att göra helt sterila, och många sterila eller autoklaverbara laboratoriedjurdieter konstaterades uppvisa snabb svamptillväxt under icke-sterila förhållanden. Denna tendens att bryta ned under ickesterila förhållanden gjorde dem olämpliga för användning i experiment som direkt jämförde gnotobiotiska och nongnotobiotiska insekter. Den rekommenderade kosten möjliggör användning av en konsekvent diet mellan gnotobiotiska och vanliga nymfer, vilket underlättar jämförelse av egenskaper – såsom tillväxthastigheter – mellan de två grupperna.
Som andra harobserverat 27, växer de gnotobiotiska nymferna långsammare än deras icke-sterila motsvarigheter. En jämförelse mellan kroppslängder av gnotobiotiska (n = 105) och icke-sterila nymfer (n = 50) matade samma, autoklaverad gnagare diet och hålls vid rumstemperatur avslöjar att icke-sterila nymfer växer i genomsnitt 0,059 mm/ dag, medan gnotobiotiska nymfer växer 0,028 mm / dag (p < 0,0001) (Figur 5). Förekomsten av tarmmikrobiota i P. americana har visat sig förändra insekternas ämnesomsättning37, och tarmsamhällen i allmänhet tros påverka näringsabsorption38,39. Dessa skäl stöder de observerade skillnaderna i tillväxttakt för gnotobiotiska och nonsterile nymfer.
En möjlig begränsning av denna teknik är att gnotobiotiska nymfer inte kan nå sexuell mognad, eftersom de äldsta sterila kohorterna är mer än 10 månader gamla och har nått endast den sjunde instjärnan (av 10; 11 är vuxen ålder) som approximeras av kroppslängd40. Dessa äldsta kohorter finns inte på den autoklaverade råttdieten utan äter istället bestrålad råttmat, en diet som innehåller för mycket fukt för att mata till icke-sterila kohorter utan överdriven mögeltillväxt. Nonsterile nymfer på en nonsterilized hundmatdiet befanns nå vuxen ålder efter 9−10 månader under laboratorieförhållanden (rumstemperatur och fuktighet). Kohorter av gnotobiotiska och icke-sterila nymfer på den delade, autoklaverade rått chow är för närvarande mindre än 7 månader gamla, icke-sterila insekter uppskattas vara sjunde instar (genomsnitt: 16,7 mm) medan sterila insekter uppskattas vara femte instar (genomsnitt: 11,2 mm). Som ett resultat kan vi ännu inte verifiera om våra gnotobiotiska kackerlackor framgångsrikt kan reproducera. Men med tanke på hur lätt nya gnotobiotiska kohorter kan etableras med detta tillvägagångssätt, visar denna metod stort löfte även i avsaknad av bevisad reproduktion av gnotobiotiska insekter.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll ett mångsidigt verktyg som gör det möjligt för mikrobiomforskare att driva sin egen, billiga gnotobiotiska “anläggning” med hjälp av vanliga laboratoriematerial. Detta tillvägagångssätt kan användas för att generera gnotobiotiska kackerlackor för experiment som undersöker mikrobiotans roll i utformningen av värdbeteende, immunitet, utveckling och stresssvar21,26,27. Dessa gnotobiotiska insekter kan också inokuleras med antingen syntetiska eller xenobiotiska samhällen och därefter användas som försökspersoner för tarmfloranstudier23,28. Vidare är delar av detta tillvägagångssätt, inklusive användning av bakteriologiska mediefodrade inkubationskammare som en inbyggd sterilitetskontroll, generaliserbara för andra modellsystem och kan underlätta rutinmässigt underhåll av gnotobiotiska djur i mindre anläggningar.
The authors have nothing to disclose.
Denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under tilldelningsnummer R35GM133789. Innehållet är enbart upphovsmännens ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella uppfattning. Författarna skulle vilja erkänna Josey Dyer för att spåra steriliseringshastigheter, kläckningshastigheter och tillväxthastigheter för de gnotobiotiska kackerlackorna.
2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |