Summary
Dans ce travail, nous proposons un protocole permettant de biofonctionnaliser des nanomatériaux magnétiques avec des anticorps pour un ciblage cellulaire spécifique. À titre d’exemple, nous utilisons des nanofils de fer pour cibler les cellules cancéreuses.
Abstract
Les nanomatériaux magnétiques ont fait l’objet d’une grande attention dans différentes applications biomédicales. La biofonctionnalisation de ces nanomatériaux avec des agents de ciblage spécifiques est un aspect crucial pour améliorer leur efficacité dans les diagnostics et les traitements tout en minimisant les effets secondaires. L’avantage des nanomatériaux magnétiques par rapport aux nanomatériaux non magnétiques est leur capacité à répondre aux champs magnétiques sans contact et sur de grandes distances. Cela permet de les guider ou de les accumuler, tout en les surveillant. Récemment, des nanofils magnétiques (NW) aux caractéristiques uniques ont été développés pour des applications biomédicales. Le grand moment magnétique de ces NW permet un contrôle à distance plus efficace de leur mouvement par un champ magnétique. Cela a été utilisé avec beaucoup de succès dans le traitement du cancer, l’administration de médicaments, le traçage cellulaire, la différenciation des cellules souches ou l’imagerie par résonance magnétique. De plus, la fabrication de NW par dépôt électrochimique assisté par gabarit fournit une méthode polyvalente avec un contrôle étroit des propriétés NW. Les ON de fer et les NO d’oxyde de fer (noyau-coquille) conviennent particulièrement aux applications biomédicales, en raison de leur forte magnétisation et de leur faible toxicité.
Dans ce travail, nous proposons une méthode permettant de biofonctionnaliser les nanoparticules de fer/oxyde de fer avec des anticorps spécifiques dirigés contre un marqueur spécifique de la surface cellulaire qui est surexprimé dans un grand nombre de cellules cancéreuses. Étant donné que la méthode utilise les propriétés de la surface de l’oxyde de fer, elle est également applicable aux nanoparticules superparamagnétiques d’oxyde de fer. Les NW sont d’abord enrobés de 3-aminopropyl-tri-éthoxy-silane (APTES) agissant comme un agent de liaison, auquel les anticorps sont attachés de manière covalente. Le revêtement APTES et la biofonctionnalisation des anticorps sont prouvés par spectroscopie de perte d’énergie électronique (EELS) et mesures de potentiel zêta. De plus, l’antigénicité des anticorps sur les NW est testée à l’aide de l’immunoprécipitation et du western blot. Le ciblage spécifique des ON biofonctionnalisées et leur biocompatibilité sont étudiés par microscopie confocale et un test de viabilité cellulaire.
Introduction
Une propriété unique des nanomatériaux magnétiques est leur capacité à répondre aux champs magnétiques1, qui peut être utilement utilisée pour les actionner de plusieurs façons, tout en pouvant également être surveillées, par exemple, par imagerie par résonance magnétique (IRM). Lors de l’application d’un champ magnétique alternatif à haute fréquence, ils peuvent générer de la chaleur, ce qui peut induire une hyperthermie, offrant une option thérapeutique1. Une autre approche est le traitement photothermique, qui peut être réalisé avec un laser proche infrarouge (NIR) 2,3.
Parmi le grand nombre de nanomatériaux magnétiques, l’oxyde de fer a reçu la plus grande attention dans des applications biologiques telles que la séparation magnétique, l’hyperthermie2,4, le guidage cellulaire5, l’administration de médicaments 6,7,8 et comme agent de contraste dans l’IRM 9,10. Cela est dû à leur biocompatibilité élevée 11,12, à leur grande aimantation 11,12, à leur capacité à être enrobés 9,13,14,15, à leur capacité à transporter des médicaments 2,16, à leur capacité à être fonctionnalisés avec des médicaments2,16 et/ou des agents de ciblage 12,13,17,18, et la capacité de convertir l’énergie optique en chaleur2. Récemment, MagForce a commencé des essais cliniques sur des patients atteints de cancer en utilisant des nanoparticules d’oxyde de fer pour le traitement de l’hyperthermie19.
Dernièrement, les nanofils magnétiques (NW) ont été de plus en plus exploités pour des applications biomédicales 3,11,16,20,21,22. Elles ont des propriétés similaires à celles des nanobilles magnétiques, mais offrent une forme anisotrope et un moment magnétique très important, ce qui permet un contrôle à distance très efficace par un champ magnétique23,24, y compris un actionnement à basse fréquence pour induire des effets magnéto-mécaniques 25,26,27,28,29. En conséquence, les NW ont été mis en œuvre pour différentes applications biologiques telles que l’isolement des exosomes30, le suivi cellulaire 21, le traitement du cancer 3,11,16, l’administration de médicaments 16,31,32 et en tant qu’agent de contraste IRM 33.
Les nanomatériaux magnétiques biofonctionnalisés dotés d’une capacité spécifique de ciblage cellulaire ont un grand potentiel pour les applications biomédicales et en médecine de précision34,35. Pour fixer ces agents de ciblage, une modification de surface est nécessaire sur les nanomatériaux. En règle générale, ils ont besoin d’un revêtement qui fournit un groupe fonctionnel, ce qui facilite la fixation des agents de traitement. Dans la littérature, il existe un grand nombre de revêtements organiques et inorganiques pour les nanomatériaux magnétiques. En fonction du groupe fonctionnel qui peut être immobilisé au nanomatériau, ces revêtements peuvent être classés en quatre groupes principaux : les molécules à base de groupes d’acide carboxylique, les polymères, l’histidine et les molécules à base de groupes silane.
Les molécules à base de groupes d’acide carboxylique sont l’une des méthodes de modification de surface. Il utilise la haute affinité
entre le groupe acide carboxylique négatif sur le revêtement et la charge positive sur les nanomatériaux magnétiques36,37,38. Le processus de liaison d’un acide carboxylique à une surface métallique peut impliquer la génération de sels métal-carboxylate ou l’adhésion du groupe carboxyle au métal. Cependant, pour les ON multisegmentés, tels que les ON fer/or ou nickel/or, qui ont de superbes propriétés pour les bio-applications39,40, ce type de revêtement ne peut pas être appliqué facilement. Elle nécessite deux revêtements différents en même temps : des groupes thiol pour modifier les segments d’or et des groupes carboxyle pour les segments magnétiques (fer ou nickel)38. Quelques exemples de molécules basées sur les groupes carboxyle sont l’hématoporphyrine, l’acide pimélique, l’acide palmitique et l’acide 3-[(2-aminoéthyl)dithio] propionique (AEDP)38. Les modifications de surface des nanomatériaux magnétiques à l’aide de polymères offrent des avantages distincts. En raison du poids moléculaire élevé des polymères, il améliore la stabilité du nanomatériau magnétique dans une solution38. Cependant, cela augmentera considérablement la taille du nanomatériau38. La polyvinylpyrrolidone (PVP), la polyéthylèneimine (PEI), l’acide aspartique arginine-glycine-D (RGD) et le polyéthylène glycol (PEG) sont quelques exemples des polymères les plus couramment utilisés pour les modifications de surface. Chacun a ses propres fonctionnalités et en utilise38. La troisième méthode de modification de surface consiste à utiliser un revêtement d’histidine. L’histidine est une protéine avec une chaîne latérale d’acides aminés histidine qui a une forte affinité pour un nombre limité de nanomatériaux magnétiques tels que le nickel38. Il peut être utilisé pour les processus de purification des protéines 38,41,42. Un revêtement d’histidine peut également être appliqué sur des NO multisegmentés, tels que les NW nickel/or38. La silanisation d’une surface de nanomatériau est un procédé bien établi 38,43,44. Il est basé sur un atome de silicium lié à n’importe quelle surface d’oxyde métallique par trois liaisons simples, et en même temps cet atome de silicium se lie au groupe fonctionnel à la fin par une chaîne alkyle 38,43,44. L’avantage de ce revêtement est de fournir des groupes amines libres, et il a la capacité de recouvrir à la fois des matériaux magnétiques et non magnétiques38,45, tels que le nickel et l’or, respectivement. Par conséquent, l’utilisation de molécules basées sur le groupe salin est une voie pratique pour biofonctionnaliser les ON multisegmentés. Quelques exemples de molécules basées sur des groupes silane sont le (3-aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) et le (3-aminopropyl) triméthoxysilane (APTMS)38,45.
L’ajout d’un agent de ciblage à l’enrobage peut jouer un rôle important dans le diagnostic et le traitement des cellules malades et, en même temps, minimiser les effets secondaires sur les tissus sains46,47. L’ajout d’un agent de ciblage à la surface des nanomatériaux améliore à la fois la liaison sélective cellulaire et l’internalisation par les récepteurs d’endocytose7. Sans ces ligands de ciblage, les nanomatériaux interagissent de manière non spécifique avec les membranes cellulaires, qui se lient à un taux inférieur à celui des nanomatériaux avec les ligands48. L’un des défis du ciblage des tissus cancéreux est leur similitude caractéristique avec les tissus sains. Par conséquent, le succès du ciblage dépend principalement de la détermination du ligand approprié à utiliser comme cible biologique49,50. Divers agents de ciblage ont été utilisés pour diriger les nanomatériaux vers les cellules cancéreuses48,51 (par exemple, CD44, en raison de sa forte expression dans les cellules cancéreuses par rapport aux cellules saines52,53,54,55).
Les agents de ciblage peuvent être classés en trois groupes principaux, en fonction des composants qui les composent et de leur complexité : le ciblage basé sur les aptamères, le ciblage basé sur les ligands et le ciblage basé sur les anticorps. Les aptamères sont de courts brins d’ADN ou d’ARN-oligonucléotides synthétisés chimiquement qui sont repliés en structures bidimensionnelles et tridimensionnelles, ce qui les rend capables de cibler un antigène spécifique, le plus souvent des protéines56. Le ciblage basé sur les ligands comprend des peptides et des chaînes d’acides aminés courtes57. Le ciblage par anticorps implique l’utilisation d’un anticorps entier ou de fragments d’anticorps, tels que des fragments variables à chaîne unique ou des fragments de liaison à l’antigène51. L’utilisation de cette méthode présente l’avantage de posséder deux sites de liaison avec une affinité de liaison élevée avec son antigène cible spécifique, ce qui lui confère une sélectivité extrêmement élevée58. Les sites de liaison sont analogues à une serrure et l’antigène à une clé58.
Dans ce travail, les NW utilisés ont été fabriqués par électrodéposition sur des membranes d’oxyde d’aluminium, une méthode décrite en détail dans une publication précédente59. L’accent est mis ici sur la libération de ces NW fer-oxyde de fer (noyau-coquille) des membranes et leur biofonctionnalisation avec des anticorps spécifiques pour fournir une capacité de ciblage. Les anticorps ne peuvent pas se lier directement aux NW fer-oxyde de fer et nécessitent un agent de liaison. L’enrobage des NW avec de l’APTES permet d’obtenir des groupes amines libres, ce qui permet la fixation covalente via le groupe carboxyle sur les anticorps (Figure 1). L’avantage du revêtement APTES est sa capacité à fonctionner aussi bien pour les matériaux magnétiques21 que non magnétiques60 , tels que le fer/or ou le nickel/or NWs45. Toutes les étapes de revêtement et de biofonctionnalisation expliquées dans ce protocole peuvent être utilisées avec n’importe quel nanomatériau fer/oxyde de fer, en général. Les NO fer/oxyde de fer ont été utilisés ici à titre d’exemple. Les résultats montrent que les NW fonctionnalisés par les anticorps ont une antigénicité élevée pour des récepteurs de surface cellulaire spécifiques, qui peuvent être utilisés pour différentes applications. Il s’agit par exemple de la séparation cellulaire, de l’administration de médicaments, du traitement spécifique des cellules cancéreuses à l’aide de traitements photothermiques et/ou magnétomécaniques.
Protocol
ATTENTION : Consultez toujours toutes les fiches signalétiques (FDS) pertinentes avant utilisation. Utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées et l’équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons longs, chaussures fermées). Effectuer toutes les réactions biologiques dans la hotte biologique.
NOTA : Ce protocole est destiné à produire 2 x 10 10 nanocorps biofonctionnalisés/mL équivalant à 0,36 mg de fer/mL enrobés d’anticorps anti-CD44 d’une densité de 3 x10 4 anticorps/NW. Les NW fer-oxyde de fer (noyau-coquille) mesurent 2,5 μm de long et ont un diamètre de 41,5 nm.
1. Libération de nanofils de fer
NOTE : Le procédé de fabrication des NW fer/oxyde de fer a été expliqué en détail dans une publication précédente59.
- Sur un tapis de coupe, coupez les disques d’aluminium (Al) (figure 2A) en petits morceaux (figure 2B) à l’aide d’une lame à un seul tranchant et d’un petit marteau pour les insérer dans un tube de 2 ml. Utilisez une pince à épiler pour transférer les petits morceaux d’Al dans le tube.
- Remplissez le tube de 2 mL, contenant les petits morceaux d’Al, avec 1 mL d’hydroxyde de sodium (NaOH) 1 M. Assurez-vous que toutes les pièces d’Al sont recouvertes de NaOH.
- Laissez la solution agir pendant 30 minutes à température ambiante à l’intérieur d’une hotte chimique.
- Retirez uniquement les morceaux d’Al à l’aide de la pince à épiler et conservez les NW libérés (grappes noires, Figure 3A) dans la solution de NaOH pendant 30 minutes supplémentaires. Ne modifiez pas la solution de NaOH.
- Recueillir les nano en plaçant le tube de 2 mL dans une grille magnétique et attendre 2 min avant de retirer l’ancienne solution de NaOH à 1 M. Remplacez-le par une solution fraîche de NaOH.
- Sonner le tube de 2 mL contenant les NW pendant 30 s et le laisser pendant 1 h à l’intérieur d’une hotte chimique.
- Répétez les étapes 1.5 à 1.6 au moins quatre fois.
- Lavez les NW en plaçant le tube de 2 mL dans la grille magnétique et attendez 2 min.
- Jetez la solution de NaOH et remplacez-la par 1 mL d’éthanol absolu.
- Soniser le tube pendant 30 s.
- Placez le tube de 2 ml dans la grille magnétique et attendez 2 min.
- Jetez l’ancienne solution d’éthanol absolu et remplacez-la par 1 mL d’éthanol absolu frais et sonicate pendant 30 s.
- Répétez les étapes 1.11 et 1.12 au moins quatre fois.
- Conservez les NO dans 1 mL d’éthanol absolu à température ambiante jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires.
- Mesurer la concentration de fer et donc les nanoparticules à l’aide de la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS).
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Toutefois, pour un stockage de longue durée, ne libérez pas les NW du modèle Al tant que vous n’en avez pas besoin. Le fait de maintenir les nano-éléments libérés précipitant dans l’éthanol pendant une longue période sans sonication fréquente créera des agrégations qui nécessiteront des temps de sonication plus longs pour être séparées.
2. Revêtement des nanofils avec de l’APTES
NOTA : Dans ce protocole, 100 μL de solution d’APTES (densité de 0,946 g/mL61) suffisent pour enrober 1,6 x 107 m2/g de NW. S’il y a un changement dans le rapport ou la masse du nanomatériau, le volume APTES doit être ajusté en conséquence.
- Transférer les NW de l’étape 1.14 dans un tube de verre de 5 ml à l’aide d’une pipette de 1 ml.
- Pour recueillir les NO restants dans le tube de 2 mL, lavez le tube vide de 2 mL deux fois en ajoutant 1 mL d’éthanol absolu et transférez-le dans le tube en verre de 5 mL à l’aide d’une pipette de 1 mL.
- À l’aide de la pipette, prélevez 100 μL d’APTES et ajoutez-les directement à la solution NW.
- Vortex le tube de verre de 5 mL pendant 10 s.
- Ajustez le tube de verre de 5 mL sur la pince d’un support d’autoclave de laboratoire.
- Placez la moitié du tube de verre de 5 mL à l’intérieur de l’eau du bain à ultrasons et sonisez pendant 1 h.
- Sortez le tube en verre de 5 mL du bain à ultrasons et ajoutez 400 μL d’eau déminéralisée (DI) suivis de 20 μL de NaOH 1 M (catalyse basique).
ATTENTION : Il est important d’ajouter d’abord l’eau DI. - Ajustez le tube en verre de 5 mL, comme expliqué aux étapes 2.5 à 2.6, et sonisez pendant encore 1 h.
- Sortez le tube en verre de 5 ml du bain à ultrasons.
- Placez un aimant à côté du tube de verre pendant 5 min pour collecter les NWs.
- Remplacer le surnageant par 1 mL d’éthanol absolu frais et sonicer pendant 10 s.
- Répétez les étapes 2.10 à 2.11 quatre fois.
- Transférez tout l’éthanol en suspension dans un nouveau tube en verre de 5 mL à l’aide d’une pipette de 1 mL.
REMARQUE : Les NW revêtus d’APTES peuvent être stockés dans un tube en verre avec de l’éthanol jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Le protocole peut être mis en pause ici.
3. Biofonctionnalisation des nanofils
- Activation des anticorps
REMARQUE : Pour obtenir environ 3 x 104 parties d’anticorps/NW, utiliser 30 μL d’anticorps (1 mg/mL) pour 0,1 mg de fer.- Dans un tube de 2 mL, dissoudre 0,4 mg de 3-3-diméthyl-aminopropyl carbodiimide (EDC) et 1,1 mg de sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) dans 1 mL d’hydrate d’acide éthanesulfonique 2-N-morpholino (MES) (pH 4,7).
REMARQUE : Le mélange EDC/sulfo-NHS doit être frais et préparé avant utilisation. - Dans un nouveau tube de 2 mL, ajouter 30 μL d’anticorps anti-CD44 (1 mg/mL), 960 μL de solution saline tamponnée au phosphate à 0,1 M (PBS, pH 7) et 10 μL de mélange EDC/sulfo-NHS (préparé à l’étape 3.1.1), respectivement.
- Placez le tube de 2 mL dans un agitateur à tube à 10 x g pendant 15 min à température ambiante.
- Dans un tube de 2 mL, dissoudre 0,4 mg de 3-3-diméthyl-aminopropyl carbodiimide (EDC) et 1,1 mg de sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) dans 1 mL d’hydrate d’acide éthanesulfonique 2-N-morpholino (MES) (pH 4,7).
- Préparation des nanofils revêtus d’APTES
- Pendant les 15 minutes d’incubation de l’étape 3.1.3, laver les NO en plaçant un aimant à côté du tube de NOS revêtu d’APTES (à partir de l’étape 2.13) pendant 2 min pour recueillir les ON.
- Jetez l’éthanol et remplacez-le par 1 mL de 0,1 M PBS (pH 7), puis sonifiez pendant 10 s.
- Répétez les étapes 3.2.1 à 3.2.2 quatre fois.
- Récupérez les NW, comme expliqué à l’étape 3.2.1, et jetez les PBS de 0,1 M. Conservez les NW dans le tube sans aucune solution.
- Fixation des anticorps
- Transférez toute la solution d’anticorps activés (préparée à l’étape 3.1.3) dans le tube NWs (préparé à l’étape 3.2.4) et sonnez pendant 10 s.
- Placez le tube de verre dans le rotateur pendant la nuit à 4 °C.
- Récupérez les NO à l’aide d’un aimant comme à l’étape 3.2.1 et jetez le surnageant.
- Ajouter 1 mL de solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % pendant 1 h à 4 °C pour bloquer la réaction.
- Vérifier l’antigénicité des ON fonctionnalisés par les anticorps, par exemple, à l’aide de tests d’immunoprécipitation (IP) et de western blot (WB).
REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, utilisez les NW biofonctionnalisés dans le test IP, WB ou de biocompatibilité immédiatement après l’étape de blocage.
4. Essai de biocompatibilité
REMARQUE : Pour étudier la biocompatibilité des NW, divers tests de viabilité cellulaire et différentes lignées cellulaires peuvent être utilisés. La concentration des NW utilisée ici est basée sur une publication antérieure16. L’ensemencement cellulaire doit être effectué un jour avant la biofonctionnalisation NW.
ATTENTION : Toutes les étapes ci-dessous doivent être effectuées sous l’enceinte de sécurité biologique.
- Dans une plaque à 96 puits, ensemencer neuf puits avec 4 x 104 de cellules cancéreuses du côlon (lignée cellulaire HCT116) en suspension dans le milieu de culture cellulaire de McCoy (100 μL/puits) et les placer à l’intérieur de l’incubateur pendant la nuit à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
- Lavez les NW (à partir de l’étape 3.3.4) avec du PBS en les recueillant à l’aide d’un aimant comme à l’étape 3.2.1 et remplacez l’ancienne solution par 1 mL de 0,01 M PBS (pH 7). Répétez cette étape trois fois.
- Lavez les nanoparticules (à partir de l’étape 4.2) avec du milieu McCoy’s réchauffé en les recueillant à l’aide d’un aimant comme à l’étape 3.2.1 et remplacez l’ancien PBS par 1 mL de milieu McCoy’s réchauffé. Répétez cette étape trois fois.
- Recueillir les NW (à partir de l’étape 4.3) à l’aide d’un aimant comme à l’étape 3.2.1 et remplacer 1 mL de milieu de McCoy réchauffé par 900 μL de milieu de McCoy réchauffé. La concentration de NE devrait être de 0,02 mg de NE par mL.
- Amenez la plaque à 96 puits (de l’étape 4.1) de l’incubateur à l’enceinte de sécurité biologique.
- Sous l’enceinte de sécurité biologique, éliminez l’ancien milieu des cellules et remplacez-le par 100 μL de nano en suspension (préparé à l’étape 4.4).
- Agiter l’assiette (préparée à l’étape 4.6) à la main puis l’incuber pendant 24 h à l’intérieur de l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
- Le lendemain, sortez la plaque à 96 puits (préparée à l’étape 4.7) de l’incubateur. Sous l’enceinte de sécurité biologique, ajoutez 11 μL de réactif de viabilité cellulaire (tableau des matériaux) dans chaque puits à l’aide de la pipette alvéolaire.
- Agitez la plaque à l’aide du shaker à une vitesse de 10 x g pendant 10 s.
- Incuber la plaque pendant 1 h dans l’incubateur.
- Sortez la plaque à 96 puits (préparée à l’étape 4.10) de l’incubateur. Lire la plaque dans le lecteur de microplaques (Table des matériaux) en mesurant l’absorbance du réactif de viabilité cellulaire (excitation 540 nm, émission 590 nm).
Representative Results
Il est important de couper les disques d’aluminium (Al) (Figure 2A) en petits morceaux (Figure 2B) pour qu’ils s’insèrent dans le tube utilisé. Après avoir ajouté 1 M de NaOH aux pièces d’Al, une réaction devrait commencer immédiatement, ce qui est observé par la création de bulles. Si aucune réaction ne se produit en 1 minute ou si la réaction est très rapide et que la solution devient complètement trouble avec un nuage blanc, retirez immédiatement l’ancienne solution de NaOH et remplacez-la par une solution fraîche. Vérifiez le pH de la solution de NaOH. Il doit être de pH>12. Lorsque les nanoparticules sont libérées des morceaux d’Al dans les 30 premières minutes avec du NaOH, les nanoparticules (amas noirs, figure 3A) flottent dans la solution de NaOH. Dans la dernière étape de libération des NW, la solution doit être homogène. Il ne devrait pas y avoir de groupe de NW (figure 3B). Si les NW ont été collectés à l’aide d’un aimant pendant 3 minutes, la solution doit être claire et la pastille de NW doit être noire (Figure 3C). Si la pastille était grise, jetez le tube et recommencez avec un nouvel échantillon d’Al.
Au cours du processus de libération, les NW obtiennent une couche d’oxyde de fer natif d’environ 5 nm d’épaisseur, ce qui est similaire aux rapports précédents11,16,20. Cette couche d’oxyde a une contribution importante à la biocompatibilité 16, à la fonctionnalisation16,18 et aux propriétés magnétiques20 des NWs. Cependant, le fait de garder les NW dans leur modèle (c’est-à-dire de ne pas les relâcher) jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires les empêchera d’avoir des effets sur l’environnement. Le diamètre et la longueur moyens des NW après le processus de libération étaient respectivement de 2,5 μm et 41,5 nm. La masse d’un seul NW peut être calculée comme expliqué dans le tableau 1 et confirmée par spectroscopie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS). Ici, chaque disque d’alumine contenait environ 0,3 mg de fer.
Pour réduire l’agrégation des NO après leur libération et permettre une fonctionnalisation plus poussée, les NO ont été recouverts d’APTES. Ce revêtement fournit des groupes amines libres et a la capacité de recouvrir à la fois des matériaux magnétiques et non magnétiques39,45, ce qui le rend adapté au revêtement de NO multi-segmentés tels que les NO de fer/or. Lors du revêtement des nanofils, il est important de se concentrer sur deux choses. Tout d’abord, calculez le volume nécessaire à partir des molécules APTES62 en fonction de la surface et de la masse des NW. Ces calculs ont été présentés dans le tableau 2. Deuxièmement, maintenir les nanofils dans un mouvement continu pour éviter leur agglomération et le blocage de certaines parties des surfaces NW du revêtement APTES. Par exemple, dans ce protocole, les nanofils ont été incubés sous le bain à ultrasons et le rotateur pendant le revêtement APTES et la fonctionnalisation des anticorps, respectivement. Chaque molécule d’APTES contient un atome de silicium et un groupe d’amines fonctionnelles terminales21. Par conséquent, les cartes de spectroscopie de perte d’énergie des électrons (EELS) peuvent être utilisées pour confirmer la présence du revêtement APTES en montrant des atomes de silicium (couleur rose) sur la surface NW (Figure 4A). En revanche, les nanoparticules non enrobées montrent les atomes de fer en bleu d’écorce (figure 4B) et les atomes de mélange fer/oxygène en bleu clair (figure 4B). La cartographie correspondante de l’EELS des NW non enrobés (Figure 4C, 4D) montre une intensité plus élevée du fer par rapport à l’oxygène au centre (Figure 4C) qu’à la surface (Figure 4D), ce qui indique une structure fer-oxyde de fer (noyau-coquille). La cartographie de l’EELS (Figure 4 C,4D) a permis d’identifier que la couche d’oxyde de fer dans les NW est en Fe 3 O4 de plus qu’en Fe2O3, ce qui est similaire à une publication précédente20.
L’antigénicité des anticorps attachés peut être confirmée à l’aide des tests IP et WB, où une bande peut être observée sur l’échantillon positif mais pas sur les témoins négatifs (Figure 5). Notez que pour observer une bande claire, n’utilisez pas moins de 0,1 mg de NWs/10 x 106 cellules. Le dosage BCA (Table of Materials), combiné à certains calculs présentés dans le tableau 3 , a été utilisé pour quantifier le nombre d’anticorps sur le NW.
De plus, la mesure du potentiel zêta a été utilisée pour élucider la fonctionnalisation de la surface. Le groupe amine terminal sur APTES a réduit la charge négative des NW non revêtus, comme le montre la figure 6. Les ON fonctionnalisés par les anticorps ont également modifié la charge par rapport aux NO enrobés d’APTES (Figure 6). Toutes les mesures du potentiel zêta ont été effectuées à un pH de 7.
Le ciblage cellulaire spécifique des NE fonctionnalisés par les anticorps peut être confirmé par microscopie confocale (Figure 7). La biocompatibilité de tout nouveau nanomatériau doit être testée avant de commencer toute application. Par conséquent, le test de viabilité cellulaire a été utilisé, et il a confirmé que les NW non enrobés, enrobés d’APTES et enrobés d’anticorps étaient biocompatibles, même avec une concentration élevée (Figure 8).
Figure 1 : Le schéma représente la méthode d’enrobage et de biofonctionnalisation des nanofils. (A) Revêtement des NW en fer avec de l’APTES. (B) Activer les anticorps en utilisant EDC + Sulfo-NHS, pour avoir à la fin (C) un nanofil fonctionnalisé par anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Disque d’aluminium déposé en fer. (A) Le disque en aluminium avant la coupe. (B) Les lignes rouges indiquaient l’endroit où couper le disque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Étapes de libération des nanofils. (A) Des amas de nanofils flottent dans une solution de NaOH. L’image a été prise 10 min après l’ajout du NaOH et après le retrait de la membrane Al. (B) Nanofils en suspension dans l’éthanol. La photo a été prise lors de la dernière étape de libération, immédiatement après l’étape de sonication. (C) Pastille de nanofil noir recueillie par un aimant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Carte de la spectroscopie de perte d’énergie électronique (EELS). (A) Nanofil revêtu d’APTES (APTES-NF). Les couleurs bleu et rose représentent respectivement les atomes de fer et de silicium. (B) Nanofils non revêtus (NW). Les couleurs bleu écorce et bleu clair représentent respectivement la cartographie du fer et du mélange fer/oxygène. La cartographie correspondante de l’EELS de (C) le noyau et (D) de la coquille des NW non revêtus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Confirmation de la fonctionnalisation et de l’activité des nanofils conjugués d’anticorps. L’antigénicité des CD44-NWs a été confirmée par immunoprécipitation (IP) et western blot (WB). +Ve : représente le contrôle positif (lysat cellulaire complet). -Ve : représente le témoin négatif (uniquement NW non revêtu). – Cellules CD44 : représentent les cellules qui n’expriment pas l’antigène CD44 ; + Cellules CD44 : représentent les cellules cancéreuses du côlon qui expriment l’antigène CD44. Il s’agit d’une tache représentative de n = 3 expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Valeurs du potentiel zêta pour les NWs, les APTES-NWs et les anticorps. Les barres représentent la moyenne ±erreur-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Les images microscopiques confocales montrent le ciblage spécifique. Les CD44-NW sont représentés attachés (A et C), tandis que les Isotype-NW (contrôle négatif) ne se sont pas attachés (B et D). Les couleurs rouge, bleu et vert représentent respectivement la membrane cellulaire, le noyau et le groupe de CD44-NW. A et B sont les images en fond clair de C et D, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Etude de viabilité cellulaire de cellules cancéreuses du côlon (HCT116) incubées avec différentes formulations de nanofils. Les cellules ont été traitées avec des NW après 24h d’incubation, puis incubées pendant 24h avec les NW. Toutes les expériences ont été réalisées à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C. Les barres représentent la moyenne ±erreur-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Paramètre | Valeur | Unité | ||
| Longueur de Fe NW (h) | 2.6 | μm | ||
| Rayon (diamètre/2) (r) | 0.01679231 | μm | ||
| Densité de Fe (D) | 7.87 | g/cm3 | ||
| 1 Fe NW volume (V)= π r^2h | 2.30F-15 | cm3 | ||
| 1 Fe Masse NW = V x D | 1.80F-08 | μg | ||
| 1 Fe NW surface = 2π r^2 + 2πrh | 2.76F-01 | μm2 | 2.8E+05 | nm2 |
Tableau 1 : Calcul de la masse NW du fer.
| Paramètre | Valeur | Unité |
| Densité d’APTES/100 μL* | 9.50F-01 | g |
| Poids moléculaire (MW) d’APTES | 2.21E+02 | g/mol |
| Nombre de mole APTES = masse/MW | 4.29F-03 | Mol |
| Nombre de molécules APTES/100 μL** | 2.57E+21 | Molécules |
| Taille APTES *** | 5.00F-01 | Nm |
| Superficie de l’APTES | 2.00F-01 | nm2 |
| Superficie NW**** | 2.76E+05 | nm2 |
| Nombre de NO dans 0,3 mg de NO **** | 1.70E+10 | Nws |
| Nombre de molécules APTES nécessaires pour créer une couche autour du NW | 1.38E+06 | Molécule d’APTES |
| Nombre de molécules d’APTES nécessaires pour 0,3 mg de NWs | 2.35E+16 | Molécule d’APTES |
| *Numéro de référence 61 | ||
| ** Nombre de molécules = Nombre de mol*nombre d’avogadro (6E+23) | ||
| Numéro de référence 62 | ||
| Extrait du tableau 1 | ||
Tableau 2 : Calcul du nombre de molécules d’APTES nécessaires à l’enrobage des NW.
| Anticorps IgG en forme de Y | NW | |
| Masse pour un anticorps | 2,3E-13 μg | 1,8E-08 μg* |
| Surface pour un anticorps | 23 nm2 | 2.6E+05 nm2 |
| Basé sur le dosage BCA | 0,3 mg pour 1 mg | |
| Le nombre de la molécule d’anticorps et de NW dans 0,3 mg d’anticorps par mg de NW | ~1E+15 anticorps ** pour ~5,6E+10 NWs | |
| Nombre de molécules d’anticorps par NW | ~2E+04 anticorps pour 1 NW*** | |
| *Calculé à partir du tableau 1 | ||
| **Le nombre d’anticorps dans 0,3 mg a été calculé en divisant le nombre d’anticorps que nous avons reçu du test BSA (0,3 mg) par le poids moléculaire moyen des anticorps IgG en forme de Y (180 kDa = 3E-16 mg). | ||
| Sur la base de la surface d’une molécule d’anticorps IgG en forme de Y (~23 nm2) et de la surface d’un NW (~2,6E+05 nm2), environ 1E+04 anticorps seraient suffisants pour créer une monocouche sur le NW. Dans notre cas, la densité d’anticorps était deux fois supérieure à la quantité attendue. Cela peut être lié au revêtement APTES qui fournit plus de bras qui permet la fixation élevée des anticorps. Ce cas garantit que le NW est entièrement recouvert d’anticorps et que la possibilité pour l’anticorps de se lier à un antigène de surface cellulaire, quelle que soit l’orientation des NW, sera élevée. Cependant, si la densité d’anticorps est inférieure au nombre attendu (1E+04 molécule d’anticorps), alors le risque de liaison entre la cellule et les NW sera plus faible. | ||
Tableau 3 : Calcul du nombre d’anticorps sur le nanofil.
Discussion
Comme pour toute méthode de fabrication et de revêtement de nanomatériaux, une haute qualité des solutions utilisées est requise. Les solutions de libération (1 M NaOH) et de fonctionnalisation (MES) peuvent être réutilisées plusieurs fois. Cependant, il est très important de vérifier leur valeur de pH avant de commencer un nouveau processus. Lors de l’étape de libération, le lavage des NW avec du NaOH doit être effectué au moins quatre fois. Plus le lavage est bon, meilleure est la stabilité des NW et moins ils sont granulés. La couche d’oxyde améliore la stabilité des NW lors de l’immersion dans l’éthanol ou l’eau63.
Le diamètre et la longueur des NW ont été affectés après les avoir enrobés d’APTES et d’anticorps. Ici, le diamètre est passé de 41,5 nm à 70 nm, et la longueur a diminué de 2,5 μm à 1,6 μm, en raison des marches de sonication qui brisent les NW. Il est donc essentiel de caractériser la morphologie des NWs après l’étape de biofonctionnalisation.
La fixation des anticorps aux NWs repose sur l’interaction covalente entre le groupe amine (sur APTES) et le groupe carboxyle (sur l’anticorps). Par conséquent, la confirmation de la présence du revêtement APTES est une étape importante, pour laquelle nous avons utilisé la cartographie EELS. La méthode de revêtement est sûre et simple. Il n’a pas besoin de températures élevées ou de longs temps d’incubation. De plus, l’enrobage APTES fonctionne comme un agent de liaison pour permettre la fixation covalente d’autres anticorps ou protéines ayant un groupe carboxyle.
Dans le cas de la biofonctionnalisation des NO avec un anticorps, l’antigénicité des sites de liaison des anticorps après le processus de biofonctionnalisation peut être affectée. Les méthodes IP et WB peuvent être utilisées pour examiner ce problème. L’utilisation de la méthode de biofonctionnalisation mentionnée dans ce protocole permettra aux anticorps de se lier aux NW avec une antigénicité élevée à un récepteur cellulaire spécifique. De plus, la biofonctionnalisation des NW avec des anticorps a ajouté la capacité de cibler les cellules avec le récepteur d’intérêt, CD44 ici. Cela a été confirmé par microscopie confocale. Bien que la biocompatibilité des NO non enrobées soit élevée (>95 %), l’ajout d’un revêtement APTES ou d’anticorps aux NO a amélioré leur biocompatibilité de 100 %.
De plus, le protocole d’enrobage et de biofonctionnalisation est efficace, économique et reproductible. Il devrait s’appliquer à tout autre nanomatériau fer-oxyde de fer, la concentration du revêtement et des anticorps attachés devant être optimisée en fonction de la surface et de la masse du nanomatériau. Ce protocole peut être effectué en toute sécurité dans des conditions ambiantes dans le laboratoire général. La biofonctionnalisation a considérablement amélioré la biocompatibilité des nanomatériaux et leur capacité de ciblage. En général, les NW sont des matériaux extrêmement prometteurs pour les applications nanomédicales (y compris les traitements multimodaux ou combinatoires, la détection ou le guidage cellulaire et la détection biologique). Combiné à la biofonctionnalisation, comme décrit ici, un ciblage cellulaire spécifique peut être réalisé pour une précision et une efficacité accrues.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les recherches présentées dans cette publication ont été financées par l’Université des sciences et technologies du roi Abdallah (KAUST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
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