Summary
I detta arbete tillhandahåller vi ett protokoll för att biofunktionalisera magnetiska nanomaterial med antikroppar för specifik cellinriktning. Som exempel använder vi järnnanotrådar för att rikta in oss på cancerceller.
Abstract
Magnetiska nanomaterial har fått stor uppmärksamhet i olika biomedicinska tillämpningar. Biofunktionalisering av dessa nanomaterial med specifika målsökande ämnen är en avgörande aspekt för att förbättra deras effektivitet vid diagnostik och behandlingar samtidigt som biverkningarna minimeras. Fördelen med magnetiska nanomaterial jämfört med icke-magnetiska är deras förmåga att reagera på magnetfält på ett beröringsfritt sätt och över stora avstånd. Detta gör det möjligt att styra eller ackumulera dem, samtidigt som de också kan övervakas. Nyligen utvecklades magnetiska nanotrådar (NW) med unika egenskaper för biomedicinska tillämpningar. Det stora magnetiska momentet hos dessa NT möjliggör en effektivare fjärrstyrning av deras rörelse med hjälp av ett magnetfält. Detta har utnyttjats med stor framgång inom cancerbehandling, läkemedelstillförsel, cellspårning, stamcellsdifferentiering eller magnetisk resonanstomografi. Dessutom ger NW-tillverkning genom mallassisterad elektrokemisk deponering en mångsidig metod med noggrann kontroll över NW-egenskaperna. Speciellt järn-NT och järn-järnoxid (kärnskal) NT är lämpliga för biomedicinska tillämpningar på grund av deras höga magnetisering och låga toxicitet.
I detta arbete tillhandahåller vi en metod för att biofunktionalisera järn/järnoxid NT med specifika antikroppar riktade mot en specifik cellytemarkör som är överuttryckt i ett stort antal cancerceller. Eftersom metoden utnyttjar egenskaperna hos järnoxidytan är den också tillämplig på superparamagnetiska järnoxidnanopartiklar. Kvävegränserna beläggs först med 3-aminopropyl-tri-etoxisilan (APTES) som fungerar som en länkare, som antikropparna är kovalent bundna till. APTES-beläggningen och antikroppens biofunktionalisering bevisas genom elektronenergiförlustspektroskopi (EELS) och zetapotentialmätningar. Dessutom testas antikropparnas antiicitet på de nn med hjälp av immunprecipitering och western blot. Den specifika inriktningen av de biofunktionaliserade NT och deras biokompatibilitet studeras med konfokalmikroskopi och en cellviabilitetsanalys.
Introduction
En unik egenskap hos magnetiska nanomaterial är deras förmåga att reagera på magnetfält1, vilket med fördel kan utnyttjas för att aktivera dem på många sätt, samtidigt som de också kan övervakas med till exempel magnetisk resonanstomografi (MRT). När de applicerar ett alternerande magnetfält med hög frekvens kan de generera värme, vilket kan inducera hypertermi, vilket ger ett terapeutiskt alternativ1. Ett annat tillvägagångssätt är fototermisk behandling, som kan realiseras med en nära infraröd (NIR) laser 2,3.
Bland det stora antalet magnetiska nanomaterial har järnoxid fått störst uppmärksamhet i biologiska tillämpningar som magnetisk separation, hypertermi2,4, cellvägledning5, läkemedelstillförsel 6,7,8 och som kontrastmedel i MRI 9,10. Detta beror på deras höga biokompatibilitet 11,12, stor magnetisering 11,12, förmåga att beläggas 9,13,14,15, förmåga att bära läkemedel 2,16, förmåga att funktionaliseras med läkemedel2,16 eller/och målsökande medel12,13,17,18, och förmåga att omvandla optisk energi till värme2. Nyligen startade MagForce kliniska prövningar på cancerpatienter med hjälp av nanopartiklar av järnoxidför behandling av hypertermi.
På senare tid har magnetiska nanotrådar (NW) i allt högre grad utnyttjats för biomedicinska tillämpningar 3,11,16,20,21,22. De har liknande egenskaper som magnetiska nanopärlor, men erbjuder en anisotrop form och ett mycket stort magnetiskt moment, vilket möjliggör en mycket effektiv fjärrkontroll med ett magnetfält23,24, inklusive lågfrekvent aktivering för att inducera magnetomekaniska effekter 25,26,27,28,29. Som en konsekvens av detta har NV implementerats för olika biologiska tillämpningar såsom exosomisolering30 cellspårning 21, cancerbehandling 3,11,16, läkemedelstillförsel 16,31,32 och som MRT-kontrastmedel 33.
Biofunktionaliserade magnetiska nanomaterial med specifik cellmålsökande förmåga har stor potential för biomedicinska tillämpningar och inom precisionsmedicin34,35. För att fästa dessa målsökande ämnen krävs en ytmodifiering av nanomaterialen. Vanligtvis behöver de en beläggning som ger en funktionell grupp, vilket underlättar vidhäftningen av behandlingsmedlen. I litteraturen finns ett stort antal organiska och oorganiska beläggningar för magnetiska nanomaterial. Baserat på den funktionella gruppen som kan immobiliseras till nanomaterialet kan dessa beläggningar kategoriseras i fyra huvudgrupper: molekyler baserade på karboxylsyragrupper, polymerer, histidin och molekyler baserade på silangrupper.
Molekylerna baserade på karboxylsyragrupper är en av ytmodifieringsmetoderna. Den utnyttjar den höga affiniteten
mellan den negativa karboxylsyragruppen på beläggningen och den positiva laddningen på de magnetiska nanomaterialen36,37,38. Bindningsprocessen av en karboxylsyra till en metallyta kan innefatta generering av metallkarboxylatsalter eller vidhäftning av karboxylgruppen till metallen. För flersegmenterade NT, såsom järn/guld eller nickel/guld NW, som har utmärkta egenskaper för biotillämpningar39,40, kan denna typ av beläggning dock inte appliceras enkelt. Det kräver två olika beläggningar samtidigt: tiolgrupper för modifiering av guldsegmenten och karboxylgrupper för magnetiska segment (järn eller nickel)38. Några exempel på molekyler baserade på karboxylgrupper är hematoporfyrin, pimelsyra, palmitinsyra och 3-[(2-aminoetyl)dittio]propionsyra (AEDP)38. Ytmodifieringar av magnetiska nanomaterial med hjälp av polymerer erbjuder några tydliga fördelar. På grund av polymerernas stora molekylvikt förbättrar det stabiliteten hos det magnetiska nanomaterialet i en lösning38. Det kommer dock att öka nanomaterialets storlekavsevärt 38. Polyvinylpyrrolidon (PVP), polyetylenimin (PEI), arginin-glycin-D asparaginsyra (RGD) och polyetylenglykol (PEG) är några exempel på de vanligaste polymererna för ytmodifieringar. Var och en har sina egna funktioner och använder38. Den tredje ytmodifieringsmetoden är att använda en histidinbeläggning. Histidin är ett protein med en sidokedja av histidinaminosyror som har en hög affinitet till ett begränsat antal magnetiska nanomaterial såsom nickel38. Det kan användas för proteinreningsprocesser 38,41,42. En histidinbeläggning kan också appliceras på flersegmenterade NT, såsom nickel/guld NT38. Silanisering av en nanomaterialyta är en väletablerad process 38,43,44. Den är baserad på en kiselatom kopplad till vilken metalloxidyta som helst genom tre enkelbindningar, och samtidigt binder denna kiselatom till den funktionella gruppen i slutet genom en alkylkedja 38,43,44. Fördelen med denna beläggning är att den ger fria amingrupper, och den har förmågan att belägga både magnetiska och icke-magnetiska material38,45, såsom nickel respektive guld. Att använda molekyler baserade på saltlösningsgruppen är därför en praktisk väg för att biofunktionalisera flersegmenterade NT. Några exempel på molekyler baserade på silangrupper är (3-aminopropyl) trietoxisilan (APTES) och (3-aminopropyl) trimetoxisilan (APTMS)38,45.
Tillsatsen av ett målsökande medel till beläggningen kan spela en viktig roll vid både diagnos och behandling av sjuka celler och samtidigt minimera biverkningarna på friska vävnader46,47. Tillsatsen av ett målsökande medel på ytan av nanomaterial förbättrar både cellulär selektiv bindning och internalisering genom endocytosreceptorer7. Utan dessa målsökande ligander interagerar nanomaterial ospecifikt med cellmembran, som binder i lägre takt jämfört med nanomaterialen med liganderna48. En av utmaningarna med att rikta in sig på cancervävnader är deras karakteristiska likhet med friska vävnader. Därför beror framgången med målinriktning huvudsakligen på att bestämma lämplig ligand att använda som ett biologiskt mål49,50. Olika målsökande medel har använts för att rikta nanomaterial till cancerceller48,51 (t.ex. CD44, på grund av dess höga uttryck i cancerceller jämfört med friska celler52,53,54,55).
Målsökande agenter kan kategoriseras i tre huvudgrupper, baserat på de komponenter de är gjorda av och deras komplexitet: aptamerbaserad inriktning, ligandbaserad inriktning och antikroppsbaserad inriktning. Aptamerer är korta, kemiskt syntetiserade strängar av DNA eller RNA-oligonukleotider som veckas till två- och tredimensionella strukturer, vilket gör dem kapabla att rikta in sig på ett specifikt antigen, oftast proteiner56. Ligandbaserad målsökning inkluderar peptider och korta aminosyrakedjor57. Antikroppsbaserad målsökning innebär användning av en hel antikropp eller antikroppsfragment, t.ex. fragment med variabel enkelkedja eller antigenbindande fragment51. Fördelen med att använda denna metod är att den har två bindningsställen med hög bindningsaffinitet till sitt specifika målantigen, vilket ger den en mycket hög selektivitet58. Bindningsställena är analoga med ett lås och antigenet med en nyckel58.
I detta arbete tillverkades de NT som användes genom elektrodeposition på aluminiumoxidmembran, en metod som beskrivits i detalj i en tidigare publikation59. Fokus här ligger på att frigöra dessa järn-järnoxid (kärnskal) NT från membranen och biofunktionalisera dem med specifika antikroppar för att ge en målsökande förmåga. Antikropparna kan inte binda direkt till järn-järnoxid-NT och kräver en länkare. Beläggning av NT med APTES ger fria amingrupper, vilket möjliggör kovalent bindning via karboxylgruppen på antikropparna (figur 1). Fördelen med APTES-beläggningen är dess förmåga att fungera för både magnetiska21 och icke-magnetiska60-material , såsom järn/guld eller nickel/guld NWs45. Alla beläggnings- och biofunktionaliseringssteg som förklaras i detta protokoll kan användas med alla järn/järnoxidnanomaterial i allmänhet. Järn/järnoxid NT användes här som exempel. Resultaten visar att de antikroppsfunktionaliserade NT har en hög antigenicitet mot specifika cellytereceptorer, vilket kan användas för olika tillämpningar. Exempel på detta är cellseparation, läkemedelstillförsel, specifik cancercellsbehandling med fototermiska och/eller magnetomekaniska behandlingar.
Protocol
VARNING: Läs alltid alla relevanta säkerhetsdatablad före användning. Använd alla lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, labbrock, fullängdsbyxor, skor med stängda tår). Utför alla biologiska reaktioner i det biologiska dragskåpet.
OBS: Detta protokoll är avsett att producera 2 x 10 10 biofunktionaliserade NTs/ml motsvarande 0,36 mg järn/ml belagda med anti-CD44-antikroppar med en densitet på 3 x10 4 antikroppar/NW. Järn-järnoxid (kärnskal) NT är 2,5 μm långa och har en diameter på 41,5 nm.
1. Frisättning av järnnanotrådar
Anm.: Tillverkningsprocessen för järn/järnoxid förklarades i detalj i en tidigare publikation59.
- Skär aluminiumskivorna (Al) (Figur 2A) i små bitar (Figur 2B) på en skärmatta med ett eneggat blad och en liten hammare för att passa in i ett 2 ml rör. Använd en pincett för att överföra de små Al-bitarna till röret.
- Fyll 2 ml röret, som innehåller de små Al-bitarna, med 1 ml 1 M natriumhydroxid (NaOH). Se till att alla Al-bitar är täckta med NaOH.
- Låt lösningen verka i 30 minuter i rumstemperatur inuti ett kemiskt dragskåp.
- Ta endast bort Al-bitarna med pincetten och behåll de frigjorda NT (svarta kluster, figur 3A) i NaOH-lösningen i ytterligare 30 minuter. Byt inte NaOH-lösningen.
- Samla upp NT genom att placera 2 ml-röret i ett magnetiskt ställ och vänta i 2 minuter innan du tar bort den gamla 1 M NaOH-lösningen. Byt ut den mot en ny NaOH-lösning.
- Ultraljudsbehandla 2 ml-röret som innehåller NW i 30 s och lämna det i 1 timme i ett kemiskt dragskåp.
- Upprepa steg 1.5-1.6 minst fyra gånger.
- Tvätta NV genom att placera 2 ml-röret i magnetstället och vänta i 2 minuter.
- Kassera NaOH-lösningen och ersätt den med 1 ml absolut etanol.
- Ultraljudsbehandla röret i 30 s.
- Placera 2 ml-röret i magnetstället och vänta 2 minuter.
- Kassera den gamla absoluta etanollösningen och ersätt den med 1 ml färsk absolut etanol och sonikera i 30 s.
- Upprepa steg 1.11 och 1.12 minst fyra gånger.
- Förvara kväve i 1 ml absolut etanol vid rumstemperatur tills de behövs.
- Mät koncentrationen av järn och därmed NT med hjälp av induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS).
OBS: Protokollet kan pausas här. För långtidslagring ska du dock inte släppa de nn från Al-mallen förrän det behövs. Att hålla de frigjorda NV fäller ut i etanol under lång tid utan frekvent ultraljudsbehandling kommer att skapa aggregationer som kommer att behöva längre tider av ultraljudsbehandling för att separeras.
2. Beläggning av nanotrådarna med APTES
OBS: I detta protokoll räcker det med 100 μL APTES-lösning (densitet 0,946 g/ml61) för att belägga 1,6 x 107 m2/g NT. Om det sker en förändring i nanomaterialets förhållande eller massa bör APTES-volymen justeras i enlighet med detta.
- Överför NT från steg 1.14 till ett 5 ml glasrör med en 1 ml pipett.
- För att samla upp eventuella NT som finns kvar i 2 ml-röret, tvätta det tomma 2 ml-röret två gånger genom att tillsätta 1 ml absolut etanol och överför det till 5 ml-glasröret med en 1 ml-pipett.
- Med hjälp av pipetten tar du 100 μL APTES och tillsätter det direkt till den NW-lösningen.
- Virvla 5 ml glasröret i 10 s.
- Justera det 5 ml glasröret på clamp på ett laboratorieretortstativ.
- Placera hälften av 5 ml glasröret inuti vattnet i ultraljudsbadet och sonikera i 1 timme.
- Ta ut 5 ml glasröret från ultraljudsbadet och tillsätt 400 μL avjoniserat (DI) vatten följt av 20 μL 1 M NaOH (basisk katalys).
VARNING: Det är viktigt att tillsätta DI-vattnet först. - Justera 5 ml glasröret, som förklaras i steg 2.5-2.6, och sonikera i ytterligare 1 timme.
- Ta ut 5 ml glasröret från ultraljudsbadet.
- Placera en magnet bredvid glasröret i 5 minuter för att samla upp NV.
- Byt ut supernatanten mot 1 ml färsk absolut etanol och sonikera i 10 s.
- Upprepa steg 2.10-2.11 fyra gånger.
- Överför all NW suspenderad etanol till ett nytt 5 ml glasrör med hjälp av en 1 ml pipett.
OBS: APTES-belagda NT kan förvaras i ett glasrör med etanol tills de behövs. Protokollet kan pausas här.
3. Biofunktionalisering av nanotrådarna
- Aktivering av antikropparna
OBS: För att uppnå cirka 3 x 104 delar antikropp/NW, använd 30 μL antikropp (1 mg/ml) per 0.1 mg järn.- Lös upp 0,4 mg 3-3-dimetylaminopropylkarbodiimid (EDC) och 1,1 mg sulfo-N-hydroxisulfosuccinimid (Sulfo-NHS) i 1 ml 2-N-morfolinoetansulfonsyrahydrat (MES) (pH 4,7) i ett 2 ml rör.
OBS: EDC/sulfo-NHS-blandningen ska vara färsk och beredd före användning. - Tillsätt 30 μl anti-CD44-antikroppar (1 mg/ml), 960 μl 0,1 M fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, pH 7) respektive 10 μl EDC/sulfo-NH-blandning (beredd i steg 3.1.1) i ett nytt 2 ml rör.
- Placera 2 ml röret i en tubskakare vid 10 x g i 15 minuter i rumstemperatur.
- Lös upp 0,4 mg 3-3-dimetylaminopropylkarbodiimid (EDC) och 1,1 mg sulfo-N-hydroxisulfosuccinimid (Sulfo-NHS) i 1 ml 2-N-morfolinoetansulfonsyrahydrat (MES) (pH 4,7) i ett 2 ml rör.
- Beredning av APTES-belagda nanotrådar
- Under den 15 minuter långa inkubationen i steg 3.1.3 tvättas de kväve genom att en magnet placeras bredvid det APTES-belagda kväveröret (från steg 2.13) i 2 minuter för att samla upp de kväve som saknas.
- Kassera etanolen och ersätt den med 1 ml 0,1 M PBS (pH 7) och sonikera sedan i 10 s.
- Upprepa steg 3.2.1-3.2.2 fyra gånger.
- Samla in de NT, som förklaras i steg 3.2.1, och kassera 0.1 M PBS. Förvara de n-kärlen i röret utan någon lösning.
- Bindning av antikropparna
- Överför all aktiverad antikroppslösning (beredd i steg 3.1.3) till den nanotekniska röret (beredd i 3.2.4) och ultraljudsbehandling i 10 s.
- Placera glasröret i rotatorn över natten vid 4 °C.
- Samla upp NT med hjälp av en magnet som i steg 3.2.1 och kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml 2 % bovint serumalbuminlösning (BSA) i 1 timme vid 4 °C för att blockera reaktionen.
- Kontrollera antikroppsfunktionaliserade NT:s antigenicitet, t.ex. med hjälp av immunoprecipitering (IP) och western blot-analyser (WB).
OBS: För bättre resultat, använd de biofunktionaliserade NT:erna i IP-, WB- eller biokompatibilitetsanalysen omedelbart efter blockeringssteget.
4. Analys av biokompatibilitet
OBS: För att studera biokompatibiliteten hos de nanotekniska nätverken kan olika cellviabilitetsanalyser och olika cellinjer användas. Koncentrationen av de NT som används här är baserad på en tidigare publikation16. Cellsådden bör göras en dag före NW-biofunktionaliseringen.
VARNING: Alla nedanstående steg bör utföras under biosäkerhetsskåpet.
- I en platta med 96 brunnar, så nio brunnar med 4 x 104 tjocktarmscancerceller (HCT116-cellinje) suspenderade i McCoys cellodlingsmedium (100 μL/brunn) och placera den i inkubatorn över natten vid 37 °C och 5 % koldioxid (CO2 ).
- Tvätta de nanotekniska ämnena (från punkt 3.3.4) med PBS genom att samla upp dem med en magnet som i steg 3.2.1 och ersätt den gamla lösningen med 1 ml 0,01 M PBS (pH 7). Upprepa detta steg tre gånger.
- Tvätta NV (från steg 4.2) med uppvärmda McCoy's media genom att samla upp dem med hjälp av en magnet som i steg 3.2.1 och byt ut den gamla PBS mot 1 ml uppvärmd McCoy's media. Upprepa detta steg tre gånger.
- Samla upp de NW (från steg 4.3) med hjälp av en magnet som i steg 3.2.1 och byt ut 1 ml uppvärmda McCoy's-medier mot 900 μL uppvärmda McCoy's-medier. Koncentrationen av kväve bör vara 0,02 mg kväve per ml.
- Ta 96-hålsplattan (från steg 4.1) från inkubatorn till biosäkerhetsskåpet.
- Kassera det gamla mediet från cellerna under biosäkerhetsskåpet och ersätt det med 100 μL suspenderat kväve (bereds i steg 4.4).
- Skaka plattan (beredd i steg 4.6) för hand och inkubera den sedan i 24 timmar inuti inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2 %.
- Nästa dag tar du ut plattan med 96 brunnar (förberedd i steg 4.7) från inkubatorn. Tillsätt 11 μL av cellviabilitetsreagenset (materialtabell) till varje brunn under biosäkerhetsskåpet med hjälp av flerväggspipetten.
- Skaka plattan med plattskakaren med en hastighet av 10 x g i 10 s.
- Inkubera plattan i 1 timme i inkubatorn.
- Ta ut 96-hålsplattan (förberedd i steg 4.10) från inkubatorn. Läs av plattan i mikroplattläsaren (Materialförteckning) genom att mäta absorbansen hos cellviabilitetsreagenset (excitation 540 nm, emission 590 nm).
Representative Results
Det är viktigt att skära aluminiumskivorna (Al) (Figur 2A) i små bitar (Figur 2B) så att de passar i röret som används. Efter tillsats av 1 M NaOH till Al-bitarna bör en reaktion starta omedelbart, vilket observeras genom skapandet av bubblor. Om ingen reaktion inträffar inom 1 minut eller om reaktionen är mycket snabb och lösningen blir helt grumlig med ett vitt moln, ta omedelbart bort den gamla NaOH-lösningen och ersätt den med en ny lösning. Kontrollera pH-värdet för NaOH-lösningen. Det ska vara pH>12. När NT frigörs från Al-bitarna under de första 30 minuterna med NaOH, kommer NW (svarta kluster, figur 3A) att flyta inom NaOH-lösningen. I det sista steget för att frigöra NT bör lösningen vara homogen. Det bör inte finnas något kluster av nanonät (figur 3B). Om NT samlades upp med en magnet i 3 minuter ska lösningen vara klar och den NW-pelleten ska vara svart (Figur 3C). Om pelleten var grå, kassera röret och börja om med ett nytt Al-prov.
Under frisättningsprocessen erhåller NT ett naturligt järnoxidskikt med en tjocklek på cirka 5 nm, vilket liknar tidigare rapporterom 11,16,20. Detta oxidskikt har ett viktigt bidrag till biokompatibiliteten 16, funktionaliseringen16,18 och de magnetiska egenskaperna20 hos de kväveövergripande ämnena. Att behålla de kväverelaterade nätverken i sin mall (dvs. att inte släppa dem) tills det behövs kommer dock att förhindra att de påverkas av miljön. Den genomsnittliga diametern och längden på de nn efter frigöringsprocessen var 2,5 μm respektive 41,5 nm. Massan av en enda NW kan beräknas enligt tabell 1 och bekräftas med induktivt kopplad plasmamasspektroskopi (ICP-MS). Här innehöll varje aluminiumoxidskiva cirka 0,3 mg järn.
För att minska aggregeringen av NT efter utgivning och möjliggöra ytterligare funktionalisering belades NT med APTES. Denna beläggning ger fria amingrupper och har förmågan att belägga både magnetiska och icke-magnetiska material39,45, vilket gör den lämplig för beläggning av flersegmenterade NT såsom järn/guld NW. Under nanotrådsbeläggningen är det viktigt att fokusera på två saker. Beräkna först den nödvändiga volymen från APTES-molekyler62 baserat på ytan och massan av NT. Dessa beräkningar presenterades i tabell 2. För det andra, håll nanotrådarna i en kontinuerlig rörelse för att förhindra att de agglomereras och blockerar vissa delar av NW-ytor från APTES-beläggning. Till exempel, i detta protokoll, inkuberades nanotrådarna under ultraljudsbadet och rotatorn under APTES-beläggningen respektive antikroppsfunktionaliseringen. Varje APTES-molekyl innehåller en kiselatom och en terminal funktionell amingrupp21. Därför kan elektronenergiförlustspektroskopi (EELS) kartor användas för att bekräfta närvaron av APTES-beläggningen genom att visa kiselatomer (rosa färg) på den nordvästra ytan (figur 4A). Däremot visar de icke-belagda NT järnatomerna i barkblått (Figur 4B) och järn/syreblandningsatomer i ljusblått (Figur 4B). Motsvarande EELS-kartläggning av icke-belagda NT (figur 4C,4D) visar en högre intensitet av järn jämfört med syre i mitten (figur 4C) än på ytan (figur 4D), vilket indikerar en järn-järnoxidstruktur (kärnskal). EELS-kartläggningen (figur 4 C,4D) visade att järnoxidskiktet på de kväveoxidska områdena är Fe 3 O4 mer än Fe2O3, vilket liknar en tidigare publikation20.
Antigeniciteten hos de bifogade antikropparna kan bekräftas med hjälp av IP- och WB-testerna, där ett band kan observeras på det positiva provet men inte på de negativa kontrollerna (figur 5). Observera att för att observera ett tydligt band, använd inte mindre än 0,1 mg NVs/10 x 106 celler. BCA-analys (Table of Materials) i kombination med några beräkningar som presenteras i tabell 3 användes för att kvantifiera antalet antikroppar på NW.
Vidare användes zetapotentialmätningen för att belysa ytfunktionaliseringen. Den terminala amingruppen på APTES reducerade den negativa laddningen av de icke-belagda NT:erna, som visas i figur 6. De antikroppsfunktionaliserade NT förändrade också laddningen jämfört med de APTES-belagda NT (Figur 6). Alla zeta-potentialmätningar gjordes vid pH 7.
Den specifika cellinriktningen hos de antikroppsfunktionaliserade NT kan bekräftas med hjälp av konfokalmikroskopi (Figur 7). Biokompatibiliteten hos alla nya nanomaterial bör testas innan någon tillämpning inleds. Därför användes cellviabilitetsanalysen, och den bekräftade att de icke-belagda, APTES-belagda och antikroppsbelagda NT var biokompatibla även med en hög koncentration (Figur 8).
Figur 1: Schematisk bild av nanotrådarnas beläggnings- och biofunktionaliseringsmetod. (A) Beläggning av järn NT med APTES. (B) Aktivering av antikropparna med hjälp av EDC + Sulfo-NHS, för att i slutet (C) ha en antikroppsfunktionaliserad nanotråd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Järndeponerad aluminiumskiva. (A) Aluminiumskivan före skärningen. (B) De röda linjerna visade var skivan skulle skäras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Steg för frigöring av nanotråd. (A) Kluster av nanotrådar flyter i NaOH-lösning. Bilden togs 10 minuter efter att NaOH tillsatts och efter att Al-membranet tagits bort. B) Nanotrådar suspenderade i etanol. Bilden togs i det sista släppsteget, omedelbart efter ultraljudsbehandlingen. (C) Svart nanotrådspellets som samlas upp av en magnet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Karta över elektronenergiförlustspektroskopi (EELS). (A) APTES-belagd nanotråd (APTES-NW). De blå och rosa färgerna representerar järn- respektive kiselatomer. (B) Nanotråd utan beläggning (NW). De barkblå och ljusblå färgerna representerar kartläggningen av järn- respektive järn/syreblandningen. Motsvarande EELS-kartläggning av (C) kärnan och (D) skalet på de icke-belagda NT. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Bekräftelse av funktionalisering och aktivitet av antikroppskonjugerade nanotrådar. Antigeniciteten hos CD44-NW bekräftades med hjälp av immunprecipitering (IP) och western blot (WB). +Ve: representerar den positiva kontrollen (helcellslysat). -Ve: representerar den negativa kontrollen (endast icke-belagd NV). – CD44-celler: representerar celler som inte uttrycker CD44-antigen; + CD44-celler: representerar tjocktarmscancerceller som uttrycker CD44-antigen. Detta är en representativ fläck av n = 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Zeta-potentialvärden för NT, APTES-NW och antikroppar. Staplarna representerar medelvärdet ± standardfelet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Konfokalmikroskopiska bilder visar den specifika inriktningen. CD44-NW fästs (A och C), medan isotyp-NW (negativ kontroll) inte fästs (B och D). De röda, blå och gröna färgerna representerar cellmembranet, kärnan respektive klustret av CD44-NW. A och B är ljusfältsbilderna av C respektive D. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Cellviabilitetsstudie av tjocktarmscancerceller (HCT116) inkuberade med olika formuleringar av nanotrådar. Cellerna behandlades med NT efter 24 timmars inkubation och inkuberades sedan i 24 timmar med NT. Alla experiment utfördes i en inkubator vid 37 °C. Staplarna representerar medelvärdet ± standardfelet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Parameter | Värde | Enhet | ||
| Längd Fe NW (h) | 2.6 | μm | ||
| Radie (diameter/2) (r) | 0.01679231 | μm | ||
| Fe-densitet (D) | 7.87 | g/cm3 | ||
| 1 Fe NW volym (V)= π r^2h | 2.30E-15 | cm3 | ||
| 1 Fe NW-massa = V x D | 1.80E-08 | μg | ||
| 1 Fe NV yta = 2π r^2 + 2πrh | 2.76E-01 | μm2 | 2.8E+05 | nm2 |
Tabell 1: Beräkning av järnets NW-massa.
| Parameter | Värde | Enhet |
| Densitet för APTES/100 μL* | 9.50E-01 | g |
| Molekylvikt (MW) av APTES | 2.21E+02 | g/mol |
| Antal APTES-mol = massa/MW | 4.29E-03 | Mol |
| Antal APTES-molekyler/100 μL** | 2,57E+21 | Molekyler |
| APTES storlek *** | 5.00E-01 | Nm |
| APTES-yta | 2.00E-01 | nm2 |
| NV yta**** | 2.76E+05 | nm2 |
| Antal NV i 0,3 mg NV **** | 1,70E+10 | Nws |
| Antal APTES-molekyler som behövs för att skapa ett lager runt NW | 1.38E+06 | APTES-molekyl |
| Antal APTES-molekyler som behövs för 0,3 mg NT | 2.35E+16 | APTES-molekyl |
| *Referensnummer 61 | ||
| ** Antal molekyler = Antal mol*avogadro-tal (6E+23) | ||
| Referens nummer 62 | ||
| Från tabell 1 | ||
Tabell 2: Beräkning av antalet APTES-molekyler som krävs för NT-beläggning.
| Y-formad IgG-antikropp | NW | |
| Massa för en antikropp | 2,3E-13 μg | 1,8E-08 μg* |
| Yta för en antikropp | 23 nm2 | 2.6E+05 nm2 |
| Baserat på BCA-analys | 0,3 mg per 1 mg | |
| Antalet antikroppsmolekyler och NV i 0,3 mg antikroppar per mg NV | ~1E+15 antikroppar** per ~5,6E+10 N:er | |
| Antal antikroppsmolekyler per NW | ~2E+04 antikroppar per 1 NW*** | |
| *Beräknat från tabell 1 | ||
| **Antalet antikroppar i 0,3 mg beräknades genom att dividera antalet antikroppar som vi fick från BSA-analysen (0,3 mg) med den genomsnittliga molekylvikten för Y-formade IgG-antikroppar (180 kDa = 3E-16 mg). | ||
| Baserat på ytan av en molekyl av Y-formade IgG-antikroppar (~23 nm2) och ytan av en NW (~2,6E+05 nm2), skulle cirka 1E+04-antikroppar vara tillräckligt för att skapa ett monolager på NW. I vårt fall var antikroppstätheten två gånger högre än den förväntade mängden. Detta kan relateras till APTES-beläggningen som ger fler armar som möjliggör hög bindning av antikropparna. Detta fall säkerställer att NT är helt täckt med antikropparna och möjligheten för antikroppen att binda till ett cellyteantigen, oavsett orienteringen av NT kommer att vara hög. Men om antikroppstätheten är lägre än det förväntade antalet (1E+04 antikroppsmolekyl) blir bindningschansen mellan cellen och NT lägre. | ||
Tabell 3: Beräkning av antalet antikroppar på nanotråden.
Discussion
Som med alla metoder för tillverkning och beläggning av nanomaterial krävs en hög kvalitet på de lösningar som används. Lösningarna för frigöring (1 M NaOH) och funktionalisering (MES) kan återanvändas flera gånger. Det är dock mycket viktigt att kontrollera deras pH-värde innan du påbörjar en ny process. I frigöringssteget bör de kväve som tvättas med NaOH utföras minst fyra gånger. Ju bättre tvätt, desto bättre stabilitet har NT och desto mindre aggregeras de. Oxidskiktet förbättrar stabiliteten hos de tekniska ämnena vid nedsänkning i etanol eller vatten63.
Diametern och längden på de nuni påverkades efter att de belagts med APTES och antikroppar. Här ökade diametern från 41,5 nm till 70 nm, och längden minskade från 2,5 μm till 1,6 μm, på grund av ultraljudsbehandlingsstegen som bryter NV. Därför är det viktigt att karakterisera morfologin hos de NT efter biofunktionaliseringssteget.
Antikropparnas bindning till de non beror på den kovalenta interaktionen mellan amingruppen (på APTES) och karboxylgruppen (på antikroppen). Därför är det ett viktigt steg att bekräfta förekomsten av APTES-beläggningen, för vilket vi använde EELS-kartläggning. Beläggningsmetoden är säker och enkel. Den behöver inte höga temperaturer eller långa inkubationstider. APTES-beläggning fungerar också som en länkare för att möjliggöra kovalent bindning av andra antikroppar eller proteiner som har en karboxylgrupp.
Vid biofunktionalisering av de n:er med en antikropp kan antigeniciteten hos antikropparnas bindningsställen efter biofunktionaliseringsprocessen påverkas. IP- och WB-metoden kan användas för att undersöka det här problemet. Genom att använda den biofunktionaliseringsmetod som nämns i detta protokoll kan antikropparna binda till NT med hög antigenicitet till en specifik cellreceptor. Biofunktionalisering av NT med antikroppar gav dessutom möjlighet att rikta in sig på cellerna med receptorn av intresse, CD44 här. Detta bekräftades med konfokalmikroskopi. Även om biokompatibiliteten hos de obelagda NT var hög (>95 %), ökade tillsats av APTES-beläggning eller antikroppar till de NT deras biokompatibilitet med 100 %.
Dessutom är beläggnings- och biofunktionaliseringsprotokollet effektivt, ekonomiskt och reproducerbart. Det bör vara tillämpligt på alla andra nanomaterial av järn-järnoxid, varvid koncentrationen av både beläggningen och de vidhäftade antikropparna bör optimeras på grundval av nanomaterialets yta och massa. Detta protokoll kan göras på ett säkert sätt under omgivande förhållanden i det allmänna laboratoriet. Biofunktionaliseringen har avsevärt förbättrat nanomaterialets biokompatibilitet och deras målsökningsförmåga. I allmänhet är de nanotekniska ämnena extremt lovande material för nanomedicinska tillämpningar (inklusive multimodala eller kombinatoriska behandlingar, celldetektion eller cellvägledning och biologisk avkänning). I kombination med biofunktionalisering, som beskrivs här, kan specifik cellmålsökning uppnås för ökad precision och effektivitet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av King Abdullah University of Science and Technology (KAUST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
References
- Dürr, S. Magnetic nanoparticles for cancer therapy. Nanotechnology Reviews. 2 (4), 395-409 (2013).
- Espinosa, A. Duality of iron oxide nanoparticles in cancer therapy: amplification of heating efficiency by magnetic hyperthermia and photothermal bimodal treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
- Martínez Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery, Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. , (2019).
- Das, R. Tunable high aspect ratio iron oxide nanorods for enhanced hyperthermia. The Journal of Physical Chemistry. 120 (18), 10086-10093 (2016).
- Chen, J., et al. Guidance of stem cells to a target destination in vivo by magnetic nanoparticles in a magnetic field. ACS Applied Materials Interfaces. 5 (13), 5976-5985 (2013).
- Juneja, R., Roy, I. Iron oxide-doped niosomes as drug carriers for magnetically targeted drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 13, 7 (2018).
- Aires, A., et al. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective drug delivery to CD44-positive cancer cells. Nanotechnology. 27 (6), 065103 (2016).
- Trabulo, S., Aires, A., Aicher, A., Heeschen, C., Cortajarena, A. L. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective targeting of pancreatic cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta -General Subjects. 1861 (6), 1597-1605 (2017).
- Blanco-Andujar, C., et al. Design of iron oxide-based nanoparticles for MRI and magnetic hyperthermia. Nanomedicine. 11 (14), 1889-1910 (2016).
- Hachani, R., et al. Polyol synthesis, functionalisation, and biocompatibility studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential MRI contrast agents. Nanoscale. 8 (6), 3278-3287 (2016).
- Contreras, M. F., Sougrat, R., Zaher, A., Ravasi, T., Kosel, J. Non-chemotoxic induction of cancer cell death using magnetic nanowires. International Journal of Nanomedicine. 10, 2141 (2015).
- Perez, J. E., et al. Cytotoxicity. , IntechOpen. Ch. 12 (2018).
- Kievit, F. M., Zhang, M. Surface engineering of iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy. Accounts of Chemical Research. 44 (10), 853-862 (2011).
- Xu, H. Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood. Journal of Biomaterials. 32 (36), 9758-9765 (2011).
- Zhang, L., Dong, W. F., Sun, H. B. Multifunctional superparamagnetic iron oxide nanoparticles: design, synthesis and biomedical photonic applications. Nanoscale. 5 (17), 7664-7684 (2013).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Functionalized magnetic nanowires for chemical and magneto-mechanical induction of cancer cell death. Scientific Reports. 6, 35786 (2016).
- Tian, Q., et al. Multifunctional Polypyrrole@ Fe3O4 Nanoparticles for Dual-Modal Imaging and In Vivo Photothermal Cancer Therapy. Small. 10 (6), 1063-1068 (2014).
- Alsharif, N. A., Martiìnez-Banderas, A. I., Merzaban, J., Ravasi, T., Kosel, J. Biofunctionalizing Magnetic Nanowires Toward Targeting and Killing Leukemia Cancer Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 2 (99), 1-5 (2018).
- Ventola, C. L. Progress in nanomedicine: approved and investigational nanodrugs. Journal of Pharmacy Therapeutics. 42 (12), 742 (2017).
- Ivanov, Y. P., et al. Tunable magnetic nanowires for biomedical and harsh environment applications. Scientific Reports. 6, 24189 (2016).
- Margineanu, M. B., et al. Semi-automated quantification of living cells with internalized nanostructures. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 4 (2016).
- Jeon, Y. S., et al. Metallic Fe-Au Barcode Nanowires as a Simultaneous T Cell Capturing and Cytokine Sensing Platform for Immunoassay at the Single-Cell Level. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (27), 23901-23908 (2019).
- Lee, E., et al. Highly selective CD44-specific gold nanorods for photothermal ablation of tumorigenic subpopulations generated in MCF7 mammospheres. Nanotechnology. 23 (46), 465101 (2012).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. J. J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rozhkova, E. A., et al. Ferromagnetic microdisks as carriers for biomedical applications. Journal of Applied Physics. 105 (7), 306 (2009).
- Kim, D. H., et al. Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction. Nature Materials. 9 (2), 165-171 (2010).
- Kim, D. H., et al. Mechanoresponsive system based on sub-micron chitosan-functionalized ferromagnetic disks. Journal of Materials Chemistry. 21 (23), 8422-8426 (2011).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Multifunctional ferromagnetic disks for modulating cell function. IEEE Transactions on Magnetics. 48 (11), 3269-3274 (2012).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Microfabricated magnetic structures for future medicine: from sensors to cell actuators. Nanomedicine. 7 (10), 1611-1624 (2012).
- Lim, J., et al. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1-12 (2019).
- Shore, D., et al. Electrodeposited Fe and Fe–Au nanowires as MRI contrast agents. Chemical Communications. 52 (85), 12634-12637 (2016).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery and Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (47), 43976-43988 (2019).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Magnetic core-shell nanowires as MRI contrast agents for cell tracking. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 1-12 (2020).
- Zhu, L., Zhou, Z., Mao, H., Yang, L. Magnetic nanoparticles for precision oncology: theranostic magnetic iron oxide nanoparticles for image-guided and targeted cancer therapy. Nanomedicine. 12 (1), 73-87 (2017).
- Guleria, A., Priyatharchini, K., Kumar, D. Applications of Nanomaterials. , Elsevier. 345-389 (2018).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 2. Quantitative infrared spectroscopic determination of equilibrium structures of solution-adsorbed n-alkanoic acids on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 52-66 (1985).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 1. Formation, dynamics, and physical properties of n-alkanoic acids adsorbed from solution on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 45-52 (1985).
- Schrittwieser, S., Reichinger, D., Schotter, J. Applications, surface modification and functionalization of nickel nanorods. Materials and Structures. 11 (1), 45 (2018).
- Lim, J., Choi, M., Lee, H., Kim, Y. H., Han, J. Y., Lee, E. S., Cho, Y. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1 (2019).
- Nemati, Z., et al. Magnetic Isolation of Cancer-derived Exosomes Using Fe/Au Magnetic Nanowires. ACS Applied Nano Materials. 3 (2), 2058-2069 (2020).
- Hainfeld, J. F., Liu, W., Halsey, C. M., Freimuth, P., Powell, R. D. Ni-NTA-gold clusters target His-tagged proteins. Journal of Structural Biology. 127 (2), 185-198 (1999).
- Agarwal, G., Naik, R. R., Stone, M. O. Immobilization of histidine-tagged proteins on nickel by electrochemical dip pen nanolithography. Journal of the American Chemical Society. 125 (24), 7408-7412 (2003).
- Aswal, D., Lenfant, S., Guerin, D., Yakhmi, J., Vuillaume, D. Self assembled monolayers on silicon for molecular electronics. Analytica Chimica Acta. 568 (1-2), 84-108 (2006).
- Haensch, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Chemical modification of self-assembled silane based monolayers by surface reactions. Chemical Society Reviews. 39 (6), 2323-2334 (2010).
- Wildt, B., Mali, P., Searson, P. C. Electrochemical template synthesis of multisegment nanowires: Fabrication and protein functionalization. Langmuir. 22 (25), 10528-10534 (2006).
- Schladt, T. D., Schneider, K., Schild, H., Tremel, W. Synthesis and bio-functionalization of magnetic nanoparticles for medical diagnosis and treatment. Dalton Transactions. 40 (24), 6315-6343 (2011).
- Kumar, C. S. Magnetic nanomaterials. , John Wiley & Sons. (2009).
- Peiris, P., et al. Precise targeting of cancer metastasis using multi-ligand nanoparticles incorporating four different ligands. Nanoscale. 10 (15), 6861-6871 (2018).
- Veiseh, O., Gunn, J. W., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Journal of Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (3), 284-304 (2010).
- Rosenblum, D., Joshi, N., Tao, W., Karp, J. M., Peer, D. Progress and challenges towards targeted delivery of cancer therapeutics. Nature Communications. 9 (1), 1410 (2018).
- Bazak, R., Houri, M., El Achy, S., Kamel, S., Refaat, T. Cancer active targeting by nanoparticles: a comprehensive review of literature. Journal of Cancer Research Clinical Oncology. 141 (5), 769-784 (2015).
- Zeilstra, J., et al. CD44 expression in intestinal epithelium and colorectal cancer is independent of p53 status. PLoS One. 8 (8), 72849 (2013).
- Pesarrodona, M., et al. Intracellular targeting of CD44+ cells with self-assembling, protein only nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics. 473 (1-2), 286-295 (2014).
- Chandra, V., et al. Quantitative assessment of CD44 genetic variants and cancer susceptibility in Asians: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (45), 74286 (2016).
- Thapa, R., Wilson, G. D. The importance of CD44 as a stem cell biomarker and therapeutic target in cancer. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Gao, S., Zheng, X., Jiao, B., Wang, L.
- Das, M., Mohanty, C., Sahoo, S. K. Ligand-based targeted therapy for cancer tissue. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (3), 285-304 (2009).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: the Immune System in Health and Disease. 2, Garland Pub. New York. (2001).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rao, X., et al. High density gold nanoparticles immobilized on surface via plasma deposited APTES film for decomposing organic compounds in microchannels. Applied Surface Science. 439, 272-281 (2018).
- Merck. (3-Aminopropyl)triethoxysilane. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440140?lang=en®ion=SA (2020).
- Munguía-Cortés, L., et al. APTES-functionalization of SBA-15 using ethanol or toluene: Textural characterization and sorption performance of carbon dioxide. Journal of the Mexican Chemical Soceity. 61 (4), 273-281 (2017).
- Sperling, R. A., Parak, W. J. Surface modification, functionalization and bioconjugation of colloidal inorganic nanoparticles. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical & Physical Engineering Sciences. 368 (1915), 1333-1383 (2010).
