Многие бактерии используют подвижность, управляемую жгутиками, чтобы ориентироваться в окружающей среде и колонизировать благоприятное окружение как индивидуально, так и коллективно. Здесь показано использование трех установленных методов, которые используют подвижность в качестве инструмента выбора для выявления компонентов / путей, способствующих плаванию и роевой подвижности.
Подвижность имеет решающее значение для выживания и успеха многих видов бактерий. Существует множество методологий для использования подвижности для понимания сигнальных путей, выяснения функции и сборки жгутиков, а также для изучения и понимания моделей движения. Здесь мы демонстрируем сочетание трех из этих методологий. Подвижность в мягком агарове является самой старой, предлагая сильный отбор для выделения мутаций супрессора усиления функции у штаммов с нарушениями подвижности, где подвижность восстанавливается с помощью второй мутации. Метод клеточного троса, впервые использованный для демонстрации вращательной природы жгутикового двигателя, может быть использован для оценки влияния сигнальных эффекторов на скорость двигателя и его способность переключать направление вращения. Анализ «пересечения границы» является более недавним, где плавающие бактерии могут быть подготовлены к переходу в коллективное движение в качестве роя. В сочетании эти протоколы представляют собой систематический и мощный подход к выявлению компонентов механизмов подвижности и характеристике их роли в различных аспектах плавания и роения. Они могут быть легко адаптированы для изучения подвижности у других видов бактерий.
Бактерии используют множество придатков для перемещения и рассеивания в своих экологических нишах1. Подвижность, управляемая жгутителями, является самой быстрой из них, способствуя колонизации благоприятных мест в ответ на сигналы окружающей среды и внося значительный вклад в патогенную способность некоторых видов2,3. Жгутиковые бактерии могут плавать индивидуально в объемной жидкости или роиться как коллектив над полутвердой поверхностью4. Внеклеточные жгутики прикрепляются и приводятся в движение роторными двигателями, встроенными в мембрану, которые используют мощность ионных градиентов для создания крутящегомомента,который вызывает вращение1,2,4,5,6,7,8. В E. coli,чьи двигатели работают с постоянным крутящим моментом9,мощность двигателя может быть классифицирована с точки зрения скорости вращения и переключения ротора между направлениями против часовой стрелки (CCW) и по часовой стрелке (CW). Вращение КНО способствует образованию когерентного жгутикового пучка, который продвигает ячейку вперед (бег), в то время как переходный переключатель в направлении вращения (CW) заставляет пучок разбираться частично или полностьюна 10,а клетка переориентировать свое направление плавания (кувыркаться). Кишечно-кишечное кишечное правило бегает в течение секунды и кувыркается в течение десятой доли секунды. Частота переключения ротора или «кувыркающееся смещение» контролируется сигнальной системой хемотаксиса, в которой трансмембранные хеморецепторы обнаруживают внешние химические сигналы и передают их через фосфорелай жгутиковый двигатель для продления пробегов в ответ на аттрактанты или подавления их в ответ на токсичные химические вещества11,12. Подвижность плавания анализируется в 0,3% мягкого агара.
Во время роения бактерии перемещаются по полутвердой поверхности в виде плотного коллектива, где стаи бактерий текут в непрерывном вихревом движении2,13,14,15. Рои E. coli демонстрируют измененную хемосенсорную физиологию (более низкое смещение падения), более высокие скорости и более высокую толерантность к противомикробным препаратам над клетками, плавающими в объемной жидкости16,17. Рои различаются в своем развертывании множества стратегий, которые помогают движению, включая производство поверхностно-активных добавок, гиперфлагелляцию и удлинение клеток2. Роение дает бактериям конкурентное преимущество как в экологических, так и в клинических условиях18,19,20. Существует две категории роящихся бактерий: умеренные рои, которые могут роиться только на средах, затвердевшие с 0,5-0,8% агара, и надежные рои, которые могут перемещаться по более высоким концентрациям агара21.
Существует множество анализов, чтобы исследовать подвижность плавания и ее регулирование. При нарушении мутаций или условий окружающей среды подвижность сама по себе предлагает сильный выбор для выявления мутаций-супрессоров усиления функции. Эти супрессоры могут быть подлинными ревертантами исходной мутации или псевдо-ревертантами, где вторая мутация восстанавливает функциональность. Такие мутанты могут быть идентифицированы путем секвенирования всего генома (WGS). Альтернативой непредвзятому выбору супрессора является предвзятая стратегия целенаправленного мутагенеза (например, мутагенез ПЦР). Эти методологии часто проливает свет на функцию или экологическую регуляцию аппарата моторики. Если цель состоит в том, чтобы изучить двигательную функцию, то восстановление подвижности дикого типа, измеренное в мягком агари, не обязательно может указывать на восстановление двигательной мощности дикого типа. Анализ клеточного привязки, в котором клетки прикрепляются к стеклянной поверхности одним жгутиком и впоследствии контролируется вращение тела клетки, может быть начальным анализом выбора для оценки двигательного поведения. Хотя в настоящее время доступны более сложные методологии для мониторинга свойств двигателя, требуемая высокоскоростная настройка камер и применение пакетов программного обеспечения для анализа движения ограничивают их широкое использование22,23,24,25. Анализ клеточного привязки требует только, чтобы жгутики были сстрижены, что позволяет прикрепить короткие нити к стеклянному слайду с последующей видеозаписью вращения тела клетки. Хотя зарегистрированные скорости двигателя низки в этом анализе из-за высокой нагрузки, которую тело клетки оказывает на жгутик, этот анализ, тем не менее, способствовал ценному пониманию хемотаксических реакций26,27,28,29и остается действительным инструментом исследования, как обсуждается ниже.
Роевая подвижность ставит перед исследователями другой набор проблем. Выбор супрессоров усиления функции работает только в роях, которые производят обильные поверхностно-активные вещества и роя легко13. Поверхностно-активные непроизводители, такие как E. coli, привередливы в отношении выбора агара, состава среды и влажности окружающей среды2,13,14,21. После того, как условия роения установлены, анализ пересечения границы17 является полезной методологией для опроса о способности роя ориентироваться в новых/суровых условиях. Хотя протоколы, представленные ниже, относятся к E. coli,они могут быть легко адаптированы для применения у других видов.
Выделение и характеристика мутаций супрессоров успешно способствовали выявлению ключевых компонентов системы хемотаксиса35,36,37,а также самого моторного механизма38,39,40. При использов?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения GM118085 и частично Фондом Роберта Уэлча (грант F-1811 R.M.H.).
Reagents | |||
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
Eiken agar | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | Essential for E. coli swarming |
Glucose D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
LB (Lennox) Broth | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
Materials and Equipment | |||
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) | Olympus | Or equivalent software for microscope used | |
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape | Fisher | 50-285-28 | |
Frosted microscope slides 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
Olympus BX53 microscope | Olympus | BX53 | Any upright or inverted phase microscope can be used |
Petri dishes (100 mm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | For soft-agar assays |
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | 9908265 | |
Round Petri Dish with 2 Compartments | VWR | 89200-944 | For border-crossing assays |
Safety Hypodermic Needles (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
Sterile Syringe – 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
Task/Tissue wipes | Fisher scientific | 06-666 | Or equivalent single use tissue wipes |
VWR micro cover-glass 18x18mm | VWR | 48366205 | |
XM10 camera | Olympus | XM10 | Or equivalent microscope camera |