Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling af nukleotidbinding til intakte, funktionelle membranproteiner i realtid

Published: March 11, 2021 doi: 10.3791/61401
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Department of Chemistry and Neuroscience Program, Trinity College

Summary

Denne protokol præsenterer en metode til måling af adeninnukleotidbinding til receptorer i realtid i et cellulært miljø. Binding måles som Förster-resonansenergioverførsel (FRET) mellem trinitrophenylnukleotidderivater og protein mærket med en ikke-kanonisk, fluorescerende aminosyre.

Abstract

Vi har udviklet en metode til at måle binding af adeninnukleotider til intakte, funktionelle transmembranreceptorer i et cellulært eller membranmiljø. Denne metode kombinerer ekspression af proteiner mærket med den fluorescerende ikke-kanoniske aminosyre ANAP og FRET mellem ANAP og fluorescerende (trinitrophenyl) nukleotidderivater. Vi præsenterer eksempler på nukleotidbinding til ANAP-mærkede KATP-ionkanaler målt i udækkede plasmamembraner og udskårne, indefra og ud membranpletter under spændingsklemme. Sidstnævnte muliggør samtidige målinger af ligandbinding og kanalstrøm, en direkte aflæsning af proteinfunktionen. Databehandling og analyse diskuteres udførligt sammen med potentielle faldgruber og artefakter. Denne metode giver rig mekanistisk indsigt i den ligandafhængige gating af KATP-kanaler og kan let tilpasses undersøgelsen af andre nukleotidregulerede proteiner eller enhver receptor, for hvilken en passende fluorescerende ligand kan identificeres.

Introduction

Flere vigtige klasser af protein reguleres direkte af ligandbinding. Disse spænder fra opløselige enzymer til membranindlejrede proteiner, herunder receptortyrosinkinaser, G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) og ionkanaler. GPCR'er og kanaler tegner sig for ~ 34% og ~ 15% af alle nuværende lægemiddelmål, henholdsvis 1,2. Derfor er der en betydelig biokemisk såvel som medicinsk interesse i at udvikle metoder, der giver mekanistisk indsigt i ligand-receptorinteraktioner. Traditionelle metoder til måling af ligandbinding, herunder fotoaffinitetsmærkning og radioligandbindingsundersøgelser, kræver store mængder delvist oprenset protein og udføres typisk under ikke-fysiologiske forhold og tidsskalaer. En ideel metode ville kun kræve små mængder protein, kunne udføres på intakte proteiner udtrykt i et cellulært eller membranmiljø, kunne overvåges i realtid og ville være kompatibel med direkte aflæsninger af proteinfunktionen.

Förster resonans energy transfer (FRET) er en metode, der detekterer nærheden mellem to fluorescerende mærkede molekyler3. FRET opstår, når en exciteret donorfluorofor overfører energi på en ikke-strålingsmæssig måde til et acceptormolekyle (typisk en anden fluorofor). Energioverførsel resulterer i slukning af donorfluorescensemissionen og sensibilisering af acceptoremissionen (hvis acceptoren er en fluorofor). Overførselseffektiviteten afhænger af den 6. effekt af afstanden mellem donor og acceptor. Desuden skal donor og acceptor være i nærheden (normalt mindre end 10 nm), for at FRET kan forekomme. Som sådan kan FRET udnyttes til at måle den direkte binding mellem en fluorescerende mærket proteinreceptor og en fluorescerende ligand.

Flere forskellige proteiner reguleres eller aktiveres ved binding af intracellulære eller ekstracellulære adeninnukleotider (ATP, ADP, AMP, cAMP). Mange transportørproteiner kræver ATP-hydrolyse til deres reaktionscyklus, herunder ATP-bindende kassettetransportører og P-type ATPaser som Na+/K+-pumpen 4,5. ATP-følsomme K + (K ATP) kanaler, cystisk fibrose transmembran konduktansregulator (CFTR) og cyklisk-nukleotidregulerede kanaler er alle ionkanaler, der er lukket ved binding af intracellulære adeninnukleotider, hvilket gør dem udsøgt følsomme over for ændringer i cellulær metabolisme og signaltransduktion 6,7,8 . Purinerge P2X- og P2Y-receptorer reagerer på ændringer i ekstracellulær ATP, som kan frigives som en neurotransmitter eller som følge af vævsskade9. Vi har udviklet et FRET-baseret assay til måling af adeninnukleotidbinding til membranproteiner i realtid. Vi har tidligere anvendt denne metode til at studere nukleotidbinding til K ATP-kanaler 10,11.

For at måle nukleotidbinding via FRET skal et protein af interesse først mærkes med en fluorofor. Det fluorescerende mærke skal indsættes stedspecifikt i det pågældende protein, således at det er tæt nok på ligandbindingsstedet til, at FRET kan forekomme, idet der lægges særlig vægt på at sikre, at mærket ikke påvirker proteinets overordnede struktur og funktion. For at opnå dette anvender vi en teknik udviklet af Chatterjee et al., ved hjælp af rav stop-codon undertrykkelse til at indsætte en fluorescerende ikke-kanonisk aminosyre (l-3-(6-acetylnaphthalen-2-ylamino)-2-aminopropionisk; ANAP) på det ønskede sted12. Vi måler nukleotidbinding som FRET mellem ANAP-mærket protein og fluorescerende, trinitrophenyl (TNP) nukleotidderivater (figur 1A). Emissionsspektret for ANAP overlapper absorbansspektret for TNP-nukleotider, en betingelse for, at FRET kan forekomme (figur 1B). Her skitserer vi to forskellige typer bindingseksperiment. I den første måles nukleotidbinding til den intracellulære side af ANAP-mærkede KATP-kanaler i celler, der er blevet afdækket af sonikering, hvilket efterlader klæbende fragmenter af plasmamembran på et glasdækselslip 10,11,13,14.

I den anden metode måles nukleotidbinding til ANAP-mærkede KATP-kanaler i et membranplaster under spændingsklemme, hvilket muliggør samtidig måling af ionstrømme og fluorescens. Ved at kombinere disse to eksperimentelle tilgange kan ændringer i binding korreleres direkte med ændringer i kanalfunktion11. Typiske resultater, potentielle faldgruber og dataanalyse diskuteres.

Protocol

1. Udarbejdelse af dæksedler

BEMÆRK: Disse trin skal finde sted i en steril vævskulturhætte. Der gives mængder til fremstilling af 10 retter.

  1. Der anbringes ti autoklaverede, 30 mm borosilikatdækselglas enkeltvis i ti 35 mm ubehandlede sterile skåle og skylles en gang med 2 ml sterilt, destilleret vand.
  2. Fortynd 1 ml 0,1% w/v poly-L-lysinopløsning i sterilt, destilleret vand til et samlet volumen på 10 ml (slutkoncentration på 0,01% w/v). Bland godt, pipette derefter 1 ml på hver dækselseddel og inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.
  3. Opsug poly-L-lysin og vask hvert dæksel to gange med mindst 2 ml sterilt destilleret vand. Lad det stå helt tørt, dvs. mindst 3 timer.

2. Såning af HEK-293T-celler

BEMÆRK: Disse trin skal finde sted i en vævskulturhætte. HEK-293T-celler blev valgt for deres lave nuværende baggrund og lette dyrkning i kultur. Denne protokol kan tilpasses andre celletyper.

  1. Skyl en 80-90% sammenflydende T75-kolbe af HEK-293T-celler en gang med 12 ml fosfatbufret saltvand (PBS), før du inkuberer med 2 ml trypsin i 2-5 minutter, eller indtil cellerne er helt løsrevet og næsten fuldstændigt dissocieret.
  2. Resuspender cellerne ved at tilføje 10 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 E / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin. Der pipetteres forsigtigt mod bunden af kolben for at nedbryde de resterende klumper af celler.
  3. Der tilsættes 2 ml suppleret DMEM til det ønskede antal 35 mm skåle, der indeholder coatede dækselsedler. Tilsæt 100 μL opslæmmede celler til hver skål. Der inkuberes natten over ved 37 °C.

3. Transfektion

BEMÆRK: Disse trin skal finde sted i en vævskulturhætte. Der gives mængder til transfektion af 10 retter. For stedspecifik ANAP-inkorporering skal DNA-kodonet på den position, der er beregnet til mærkning, erstattes med det gule (TAG) stopkodon. Denne konstruktion er co-transfekteret med to plasmider: pANAP og peRF1-E55D12,15. pANAP koder for flere kopier af et ANAP-specifikt tRNA/tRNA-syntetasepar. I nærvær af ANAP producerer transfektion af dette plasmid tRNA ladet med ANAP, der genkender det gule stopkodon. peRF1-E55D koder for en dominerende negativ ribosomal frigivelsesfaktor, der øger udbyttet af ANAP-mærket protein i fuld længde.

  1. Forbered et 1,5 ml rør med 10 μg pANAP, 10 μg peRF1-E55D og DNA til konstruktionen beregnet til mærkning med ANAP. Bring til et slutvolumen på 500 μL med usuppleret DMEM.
  2. I et separat rør fremstilles 3 μL lipidbaseret transfektionsreagens (se materialetabel) for hver 1 μg DNA og bringes til et endeligt volumen på 500 μL med usuppleret DMEM.
  3. Kombiner DNA- og transfektionsreagensblandingerne i et enkelt rør og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur.
  4. Der tilsættes 400 μL af 1 mM ANAP-stammen (trifluoracetatsalt i 30 mM NaOH) til 20 ml suppleret DMEM for en slutkoncentration på 20 μM ANAP. Udskift det gamle medie fra de belagte celler med 2 ml af det ANAP-holdige medie pr. skål.
  5. Pipette 10% af DNA-transfektionsblandingen på hver skål. Der inkuberes ved 33 °C i 2-4 dage før forsøg. Inkubation ved 33 °C bremser celledelingen og øger proteinudbyttet pr. celle16.

4. Eksperimenter med membraner uden tag

  1. Brug et par tang til at bryde et dæksel med transfekterede celler i mindre fragmenter.
  2. Følg en af nedenstående procedurer for at fjerne tagceller.
    1. Hvis der anvendes forbelagte dækselsedler, skylles et fragment med PBS, og det anbringes derefter i bunden af en 35 mm skål, der indeholder 2 ml PBS. Kort sonikere ved hjælp af en sonde sonikator (50 W, 20% -40% amplitude, 3 mm sonde) placeret 3-5 mm over prøven for at fjerne tagceller og efterlade klæbende plasmamembranfragmenter (figur 2A, C).
      BEMÆRK: Sonikatoreffekt, varighed og sondehøjde over prøven kan alle varieres for at opnå et højt udbytte af udækkede membraner uden helt at benægte dæksel.
    2. Hvis du ikke bruger præcoatede dækselsedler, skylles et dækslipfragment med PBS, dyppes derefter ned i et rør indeholdende 0,1% w / v poly-L-lysin i ~ 30 s, før du kortvarigt sonikerer (som i trin 4.2.1) for at fjerne tagceller og efterlade udækkede / delvist udækkede plasmamembranfragmenter (figur 2A, C, D). Kortvarig eksponering for poly-L-lysin har vist sig at forbedre vedhæftningen til dæksel13.
  3. Placer det sonikerede fragment i en dækglasbund 35 mm skål indeholdende 2 ml badopløsning og monter på et omvendt mikroskop udstyret med et højt NA, 60x vandnedsænkningsmål. Mikroskopets kameraport er forbundet til en spektrograf i serie med et CCD-kamera med høj følsomhed. Perfus badekammeret (0,5 – 1 ml / min) med buffer ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Bufferens sammensætning vil variere afhængigt af det undersøgte protein.
    BEMÆRK: Hvis brugeren ikke har adgang til et mål med lang arbejdsafstand, kan det være umuligt at fokusere på de udækkede membranfragmenter på grund af den ekstra højde på dækslen. Et alternativ er at frøceller direkte på fade med poly-L-lysinglasbund (se materialetabel for et eksempel). Dette vil også reducere potentielle afvigelser i billedet forbundet med fokusering gennem to stykker glas. Disse afvigelser påvirker ikke formen af de erhvervede spektre.
  4. Identificer membranfragmenter uden tag, der udtrykker den ANAP-mærkede kanal ved at kigge efter kanalfluorescens (figur 2C, D).
    BEMÆRK: Det anbefales at bruge en ekstra fluorescerende etiket (hvor emissionsspektret kan skelnes fra ANAP-emissionsspektret) for at hjælpe med at identificere membraner uden tag, der indeholder det pågældende protein. Eksperimenterne i figur 2C,D blev udført på ANAP-mærkede kanaler med C-terminale fluorescerende proteinmærker.
  5. Aktiver delvist spektrometermasken (hæv ~10%) mellem kameraporten på mikroskopet og spektrografen. Skyggen af masken vises på kamerabilledet. Juster membranen uden tag med spektrometermasken ved at justere mikroskoptrinnet. Få et lyst felt og fluorescensbillede af den udækkede membran. Disse vil blive brugt til at vælge en region af interesse til analyse.
  6. Placer spidsen af mikrovolumenperfusionssystemet tæt på membranen uden tag.
    BEMÆRK: For at reducere baggrundsfluorescensen blev udstrømningen af perfusionssystemet erstattet med en brugerdefineret spids fremstillet af borosilikatglas.
  7. For at afbilde fluorescensspektre exciteres membranen med en 385 nm LED gennem et 390/18 nm båndpas-excitationsfilter og et 416 nm kantdikroisk. Det udsendte lys opsamles gennem et 400 nm langpasemissionsfilter (figur 2B).
  8. Aktivér spektrometermasken, og sørg for, at det udsendte lys føres igennem. Aktiver spektrometerristene (300 riller/mm). Når ristene er på plads, projiceres det lys, der diffrakteres af spektrometeret, på CCD-kameraets chip for at producere spektrale billeder (figur 3A). Disse billeder bevarer rumlig information i y-dimensionen . X-dimensionen erstattes med bølgelængde.
  9. Valgfrit, hvis proteinet af interesse er mærket med et fluorescerende protein, erhverver du et spektralt billede af det fluorescerende protein ved hjælp af det passende filtersæt.
  10. Tag en eller flere 0,1-10 s eksponeringer i starten af eksperimentet, mens du perfuserer nukleotidfri bufferopløsning. Disse vil blive brugt til at korrigere og normalisere data gennem resten af eksperimentet (se afsnit 5 nedenfor).
    BEMÆRK: Valg af eksponeringstid afhænger af det opnåede ekspressionsniveau, fluoroforens lysstyrke og optikken. Eksponeringstid bør vælges for at maksimere signalet og minimere den observerede blegningshastighed. Eksponeringstidsintervallet i 4.10 er velegnet til ligevægtsbindende målinger, men kan være nyttigt til måling af langsommere kinetiske ændringer10. Evnen til at bruge korte eksponeringstider til at spore hurtigere kinetik vil være begrænset af proteinekspressionsniveauer og fotoblegning snarere end hardware.
  11. Påfør en række koncentrationer af TNP-ATP (sædvanligvis fremstillet i badopløsning) for at etablere en koncentrations-responskurve. Perfuse hver opløsning i mindst 1 min for at sikre, at en stabil tilstand nås, og vask hver koncentration ud med badopløsning i mindst 1 min.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at sikre, at perfusionssystemet hurtigt kan nå ligevægt (figur 2E) og opnå den korrekte lokale koncentration af TNP-ATP (figur 2F).
  12. Der udtages en eksponering (med samme varighed som anvendt i trin 4.10) ved hver koncentration og ved afslutningen af hver udvaskning.

5. Spektral analyse

BEMÆRK: Disse instruktioner er skrevet til brug med analysekoden "pcf.m", som findes på GitHub. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. Yderligere og alternativ kode kan findes på https://github.com/smusher/KATP_paper_201911. Vi har beskrevet de operationer, der udføres af softwaren her, så brugeren kan oprette deres egen kode eller vælge at analysere dataene manuelt.

  1. Start analyseprogrammet ved at skrive programmets navn ("pcf") i kommandolinjen.
  2. Når en åben fil-/mappedialogboks åbnes med prompten: "Vælg filer til ROI", skal du vælge de filnavne, der er knyttet til brightfield- og fluorescensbillederne af membranen uden tag. Der vises en prompt i kommandolinjen for at skrive navnet på outputfilen.
  3. Indtast filnavnet, og tryk på enter.
  4. Når softwaren viser brightfield- og fluorescensbillederne, skal du vælge et interesseområde (ROI) i spektralbilledet, der svarer til placeringen af det udækkede membranfragment eller det udskårne plaster (se afsnit 6) efter softwarevejledningen. Vælg et baggrundsområde i det samme spektralbillede (der repræsenterer det samme bølgelængdeområde som i ROI) svarende til et afsnit af dæksel eller skål uden membran fastgjort (figur 3A). Softwaren vil bede om at klikke øverst på ROI og trykke på Enter, klikke på bunden af ROI og trykke på Enter og derefter gentage denne proces for baggrundsområdet.
  5. Når en åben fil-/mappedialogboks åbnes med prompten: "Vælg fil til FP-spektrum", skal du vælge det filnavn, der er knyttet til FP-spektret (fluorescerende protein) (valgfrit trin 4.9). Hvis der ikke blev hentet noget FP-spektrum, skal du vælge en anden spektrumfil. FP-spektret fungerer som kvalitetskontrol for at skelne mellem mærket protein og baggrundsfluorescens.
  6. Når en åben fil/mappe-dialogboks åbnes med prompten: "Vælg filer til analyse", skal du vælge alle de filer, der svarer til ANAP-spektrene (fra trin 4.10 til 4.12), inklusive de filer, der er nødvendige for blegemiddelkorrektion.
  7. Når en åben fil-/mappedialogboks åbnes med prompten: "Select Files for Bleaching Collection", skal du vælge delmængden af filer fra trin 5.6 svarende til indledende spektre erhvervet i nukleotidfri opløsning i begyndelsen af eksperimentet eller spektre erhvervet under vask i nukleotidfri opløsning, der skal bruges til korrektion (fra trin 4.10 til 4.12).
  8. Linjegennemsnit hvert billede for at producere spektre, dvs. gennemsnit intensiteten for alle pixels i y-dimensionen af et ROI eller baggrundsområde ved hver bølgelængde. (figur 3B). Træk det resulterende gennemsnitlige baggrundsspektrum fra det gennemsnitlige spektrum erhvervet fra ROI for at fjerne baggrundsfluorescens og fluorescens fra ubundet TNP-ATP (figur 3C). Disse trin udføres automatisk af softwaren.
  9. ANAP-intensiteten for hver eksponering bestemmes ved at beregne gennemsnittet af intensiteten af et 5 nm-vindue centreret omkring ANAP-toppen af de subtraherede spektre (typisk ~ 470 nm, men kan variere afhængigt af ANAP-restens lokale mikromiljø).
    BEMÆRK: Figur 3D viser 6 spektre opnået fra på hinanden følgende 10 s eksponeringer af et udækket membranfragment, der udtrykker ANAP-mærkede kanaler. Indsatsen viser den gennemsnitlige intensitet af toppen af hvert spektrum. Softwaren finder automatisk den maksimale bølgelængde i det første spektrum, der er erhvervet, og bruger denne værdi hele vejen igennem. Intensiteten beregnes automatisk af softwaren.
  10. Normaliser ANAP-intensiteterne for hvert eksperiment ved at dividere ANAP-intensiteten af en given eksponering (F) med ANAP-intensiteten af den første eksponering i tidsserien, som blev taget i trin 4.10 (Fmax). Igen udfører softwaren disse beregninger automatisk.
  11. Udfør nedenstående trin for at hente data.
    1. For at korrigere for ANAP-fotoblegning skal du først tilpasse et enkelt eksponentielt henfald, (F/Fmax) = A*exp(-t/τ)+(1-A), hvor t er den kumulative eksponeringstid, τ er tidskonstanten og A er amplituden) til enten de mellemliggende vasketrin mellem TNP-ATP-applikationer eller til flere indledende eksponeringer taget før vask på TNP-ATP (figur 3D, indsat).
      BEMÆRK: Softwaren viser denne pasform og beder om at acceptere eller afvise den. Hvis tilpasningen afvises, vil der blive givet en anden mulighed for at vælge filer til blegningskorrektion.
    2. De normaliserede (i trin 5.10) ANAP-spektre divideres med den forudsagte værdi af den eksponentielle tilpasning fra trin 5.11.1 på hvert tidspunkt (figur 3E).
      BEMÆRK: For det viste eksempel er den observerede normaliserede maksimale fluorescens ved 50 s 0,65, og den forudsagte fluorescens fra den eksponentielle tilpasning er 0,64. For at korrigere for blegning divideres den observerede værdi (0,65, figur 3E-indsats, tom cirkel) med den forudsagte værdi (0,64, figur 3E-indsats, stiplet linje) for at frembringe den korrigerede værdi (~1, figur 3E-indsats, farvet cirkel). Hvis blegningskorrektion er tilstrækkelig, bør intensiteten af ANAP fra alle eksponeringer erhvervet uden nukleotider være omtrent ens (figur 3E). Disse beregninger udføres automatisk af softwaren.
    3. Få outputtet som et billede, der plotter dataene og et regneark med faner, der indeholder de rå spektre, subtraherede spektre, spektre korrigeret for fotoblegning og topdataene for hver fil, så yderligere analyse kan udføres.

6. Patch-clamp fluorometri eksperimenter

  1. Træk plasterpipetter fra tykvæggede borosilikatglaskapillærer til en modstand på 1,5 MΩ til 2,5 MΩ, når de fyldes med pipetteopløsning. Sammensætningen af pipetteopløsningen vil variere afhængigt af det undersøgte protein.
  2. Overfør en dækselseddel med transfekterede celler til en 35 mm skål med glasbund, der indeholder 2 ml badeopløsning, og monter den på et omvendt mikroskop udstyret med et højt NA, 60x vandnedsænkningsmål. Perfus badekammeret (0,5 – 1 ml/min) med badeopløsning ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Hvad angår pipetteopløsningen, vil badopløsningen variere afhængigt af proteinet under undersøgelse.
  3. Identificer en celle, der udtrykker ANAP-mærkede kanaler ved at kigge efter fluorescens ved cellemembranen.
  4. Fyld en plasterpipette med pipetteopløsning. Påfør let positivt tryk på pipetten og læg den i badekammeret. Tryk pipetten mod cellens membran, og sug forsigtigt for at opnå en GΩ-forsegling (figur 4A).
  5. Punkttegn plasteret ved hurtigt at flytte pipetteholderen væk fra cellen (figur 4A).
    BEMÆRK: Fjernelse af plasteret på denne måde skal danne et indefra-ud-plaster, hvor proteinets cytosoliske domæner udsættes for perfusionssystemet. Hvis placeringen af nukleotidbindingsstedet under undersøgelse ikke er cytosolisk, vil det være nødvendigt at anvende udefra-ud-patches eller helcelleoptagelser til at udføre PCF-eksperimenter.
  6. Placer spidsen af plasterpipetten tæt på spidsen af perfusionssystemet, og kontroller, at plasteret er inden for spektrometermaskens slids (figur 4A).
  7. Anvend TNP-ATP og billedspektre som i trin 4.10-4.12, mens du samtidig registrerer ionisk strømrespons på nukleotidapplikation.
    BEMÆRK: Pipetteglasset kan introducere rumlige aberrationer og refleksioner i de erhvervede billeder. Disse afvigelser vil imidlertid ikke påvirke formen af de erhvervede spektre, og reflekteret excitationslys adskilles let fra fluorescens ved hjælp af enten spektrografen eller et langpasemissionsfilter.
  8. Analyser spektrene. Spektre afbildet fra udskårne plastre kan udvise oversubtraktion af ubundet TNP-ATP-fluorescens på grund af udelukkelsen af TNP-ATP fra plasterpipettens glas (figur 4C-E). Denne oversubtraktion påvirker ikke ANAP-emissionsspektret og kan derfor ignoreres.
    BEMÆRK: Da fluorescenssignalet i udskårne pletter vil være lavere end i membraner uden tag, er det vigtigt at bruge en eksponeringstid, der giver højt nok signal-til-støj uden at blege ANAP for hurtigt.

Representative Results

Figur 2 viser den grundlæggende eksperimentelle opsætning til måling af nukleotidbinding til fluorescerende proteiner i udækkede membranfragmenter opnået ved sonikering (figur 2A, B). To forskellige tilgange blev brugt til at opnå udækkede membraner, direkte dyrkning af celler på poly-L-lysinbelagte dæksedler eller dyrkning af celler på ubehandlet glas og kortvarigt udsat dem for poly-L-lysin (0,1% i vand) før tagdækning. Figur 2C viser et typisk udækket membranfragment fra en HEK-293T-celle, der udtrykker KATP-kanaler mærket med orange fluorescerende protein (OFP). Udækkede membraner var næsten usynlige på lysfeltbilleder og blev identificeret ved fluorescens af mærkede membranproteiner eller ved modfarvning med et membranfarvestof som octadecylrhodamin B13. Ud over udækkede membraner producerede sonikering af HEK-293T-celler også delvist udækkede cellefragmenter (figur 2D)10,17. Disse fragmenter var synlige i lyse felter. Dette kan være resultatet af ruffled plasmamembraner, der kun er dårligt klæbende til dækglasset. Alternativt kan disse fragmenter indeholde vesikler og membraner fra intracellulære organeller. Som sådan foretrækkes det kun at erhverve billeder fra "sande" udækkede membraner, da mærket målprotein forbundet med intracellulære membraner kan afspejle mellemliggende stadier af posttranslationel behandling og samling. Dyrkning af celler på poly-L-lysinbelagt glas anbefales, da dette resulterede i et højere udbytte af "ægte" udækkede membraner ved sonikering.

Et mikrovolumenperfusionssystem blev anvendt på fluorescerende nukleotider for at minimere de nødvendige mængder i et typisk eksperiment (figur 2B). Den medfølgende polyimidbelagte glasspids blev erstattet med en håndtrukket borosilikatglasspids i vores perfusionsopsætning, hvilket reducerede fluorescensbaggrunden. For at minimere nukleotidakkumulering omkring de udækkede membraner, der blev afbildet, blev hele badekammeret langsomt perfuseret med buffer. Som sådan ønskede vi at måle hastigheden af opløsningsændring fra vores mikrovolumenperfusionssystem og verificere, at vi var i stand til at opnå den tilsigtede ligandkoncentration i vores interesseområde, dvs. at liganden fra vores perfusionssystem ikke blev fortyndet direkte i bademediet, før den nåede den udækkede membran. For at kontrollere disse muligheder blev der målt indvaskning og udvaskning af en 50 μM opløsning af tetramethylrhodamin-5-maleimid (TMRM) fra vores mikrovolumenperfusionssystem rettet mod overfladen af en dækglasbundskål perfuseret med vand (figur 2E). Opløsningsudvekslingskinetikken var reproducerbar og velbeskrevet ved et enkelt eksponentielt henfald med tidskonstanter mindre end 1 s for både indvaskning og udvaskning. Sådanne løsningsudvekslingstider begrænser vores evne til at måle kinetik af ligandbinding og afbinding i vores nuværende opsætning. For at kontrollere, at vi var i stand til at opnå den ønskede ligandkoncentration på overfladen af dækselsedlen, sammenlignede vi fluorescensintensiteten på 50 μM TMRM, der blev leveret til dækselen af vores mikrovolumenperfusionssystem, med 50 μM TMRM i et stille bad (figur 2F). Der blev ikke observeret nogen forskel i intensitet, hvilket verificerede, at passende ligandkoncentrationer på overfladen af dækselsedlen med vores mikrovolumenperfusionssystem kan opnås, selv når badet er perfuseret.

Figur 3A viser et spektralbillede opnået fra ANAP-mærkede KATP-kanaler i en udækket membran fra en HEK-239T-celle udsat for 5 μM TNP-ATP. For at opnå sådanne billeder blev udsendt lys fra den udækkede membran rettet gennem et spektrometer i serie med et CCD-kamera. Den udsendte fluorescens blev diffrakteret af riste og projiceret på kamerachippen, hvilket producerede spektre. De resulterende billeder bevarer rumlig information i y-dimensionen , men x-dimensionen blev erstattet med bølgelængde. Interesseområdet (ROI), der svarer til den udækkede membran, er skitseret med orange. To områder med høj intensitet er tydelige på billedet, svarende til topemissionen af ANAP og TNP-ATP. Dette blev bedst værdsat i bølgelængde-for-bølgelængde-gennemsnittet (over hele ROI) spektret vist i figur 3B. Toppen ~ 470 nm svarer til ANAP inkorporeret i KATP; toppen ~ 535 nm svarer til TNP-ATP. For at korrigere for baggrundsfluorescens og direkte excitation af TNP-ATP i opløsning blev der valgt et baggrundsområde (figur 3A, grå) fra hvert billede. Det gennemsnitlige baggrundsspektrum er vist i figur 3B. Det endelige spektrum blev opnået ved at trække det gennemsnitlige baggrundsspektrum fra det gennemsnitlige ROI-spektrum (figur 3C).

ANAP er tilbøjelig til fotoblegning af artefakter. Figur 3D viser reduktionen i maksimal ANAP-fluorescens efter flere eksponeringer. Den maksimale fluorescens fra flere eksponeringer i fravær af TNP-ATP (eller fra vasker mellem koncentrationerne af TNP-ATP) blev monteret på et enkelt eksponentielt henfald, og dette blev brugt til at korrigere for fotoblegningsartefakter (figur 3E). Det anbefales at udføre koncentrationsresponsforsøg fra både lave til høje og høje til lave nukleotidkoncentrationer. Hvis blegningskorrektion ikke medfører yderligere artefakter, skal resultaterne være sammenlignelige11.

Figur 5A viser repræsentative spektralbilleder fra en udækket membran opnået fra en celle, der udtrykker ANAP-mærkede K ATP-kanaler i fravær og tilstedeværelse af TNP-ATP. De korrigerede spektre er vist i figur 5B. Ved observation af emissionsspektre var der en klar adskillelse mellem donor- og acceptorfluorescensemissionen. Da der blev observeret en vis ikke-specifik binding af TNP-ATP til naive plasmamembraner fra utransfekterede HEK-293T-celler, anbefales det at kvantificere FRET som en reduktion i donorfluorescensen (ANAP) 10,11. Denne top var specifik for den mærkede receptor.

For ligander, der inducerer en konformationsændring i deres receptor, giver bindingsstudier isoleret set ikke direkte, mekanisk meningsfuld information om ligandbindingsprocessen18. Koncentrations-responsforholdet for ligandbinding afhænger ikke kun af den indre bindingsaffinitet, men også den konformationelle ændring induceret af ligandbinding og receptorens iboende tilbøjelighed til at ændre konformation i fravær af ligand. For bedre at forstå de processer, der understreger ligand-receptorinteraktioner, kan bindingsmålinger parres med eksperimenter, der giver en aflæsning af proteinfunktionen. Til dette formål er ionkanaler et ideelt modelsystem, da deres strømme kan måles med sub-ms tidsopløsning ned til enkeltmolekyleniveau ved hjælp af spændingsklemme. Historisk set har parrede strøm- og fluorescensmålinger givet betydelig indsigt i åbning og lukning (gating) af spændings- og ligand-gated ionkanaler 19,20,21. Eksperimenter er blevet udført for samtidig at måle ioniske strømme og fluorescerende cyklisk nukleotidbinding til forskellige cykliske nukleotidregulerede kanaler22,23,24. Disse undersøgelser anvendte en ligand, der øgede dens kvanteudbytte ved binding. Fluorescens fra ubundet ligand i volumenet af opløsning nær plasteret kan trækkes fra ved billeddannelse af plastrene ved hjælp af konfokalmikroskopi22,23. I vores studier blev bindingen målt ved hjælp af reduktionen i ANAP-fluorescens. Da dette signal er specifikt for kanalen, og FRET mellem ANAP og TNP-ATP er stærkt afstandsafhængig (halv maksimum ved ~ 43 Å), blev forurening af vores signal med ikke-specifikt bundne og ubundne nukleotider undgået.

Figur 4A viser et typisk patch-clamp fluorometri (PCF) eksperiment. En tætning med høj modstand (GΩ) blev dannet mellem en saltvandsfyldt borosilikatglaspipette (forbundet til en spændingsklemmeforstærker) og en celle, der udtrykker ANAP-mærket KATP. Efter tætningsdannelsen blev pipetten trukket væk fra cellen, hvilket gav adgang til de intracellulære nukleotidbindingssteder. Pipetten blev derefter placeret over mikroskopmålet, centreret på spalten af spektrometermasken, og udstrømningen af mikrovolumenperfusionssystemet (modificeret med en borosilikatglasspids) blev bragt tæt på pipetten (figur 4D). Spændingen blev styret, og strømme blev målt fra kanalerne i plasteret. Repræsentative strømme og spektre fra ANAP-mærkede KATP-kanaler er vist i figur 4B, farvekodet for at matche spektrene til strømmene. Emissionsspektre blev korrigeret for baggrund og blegning som for membraner uden tag.

Figure 1
Figur 1: ANAP og TNP-ATP udgør et passende FRET-par. a) ANAP's og TNP-ATP's strukturer. De fluorescerende dele fremhæves. B) Absorbans- og fluorescensemissionsspektre for ANAP og TNP-ATP. Der kræves overlapning mellem ANAP-emission og TNP-ATP-absorbans for FRET. Tilpasset fra Puljung et al. (udgivet under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)10. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Måling af nukleotidbinding i udækkede plasmamembraner. A) Skematisk til fremstilling af plasmamembraner uden tag fra vedhængende celler, der udtrykker et fluorescerende membranprotein. Der gives instruktioner for celler dyrket på poly-L-lysinbelagte eller ubehandlede dæksedler. (B) Eksperimentel opsætning til måling af nukleotidbinding i membraner uden tag. (C) Lyse feltbilleder og fluorescerende billeder af en fuldstændig udækket plasmamembran afledt af en celle, der udtrykker orange fluorescerende protein (OFP) mærkede KATP-kanaler. Stjernen markerer placeringen af membranen, som er næsten usynlig i lysfeltbilledet. OFP blev begejstret med en bred 565 nm LED gennem et 531/40 nm båndpasfilter og 562 nm kantdikroisk og udsendt lys blev opsamlet gennem et 593/40 nm båndpasfilter. (D) Lyse feltbilleder og fluorescerende billeder af et delvist udækket membranfragment afledt af en celle, der udtrykker orange fluorescerende protein (OFP) mærkede KATP-kanaler. (E) Løsningsudvekslingstidskursus erhvervet ved hjælp af opsætningen beskrevet i B. Der vises fem tekniske replikater. Mikrovolumenperfusionssystemet blev fyldt med 50 μM tetramethylrhodamin-5-maleimid (TMRM). Badet blev perfuseret med vand med en hastighed på ~ 0. 5 ml / min. Data fra tidsforløbene for afvaskning (stigende fluorescens) og udvaskning (faldende fluorescens) passede med et enkelt eksponentielt henfald af formen F = A*exp(-x/τ) + y0. Tidskonstanten (τ) for indvaskning var ~0,6 s. Tidskonstanten for udvaskning var ~ 1,0 s. TMRM var begejstret med en bred 565 nm LED gennem et 540/25 nm båndpasfilter og 565 nm kantdikroisk og udsendt lys blev opsamlet gennem et 605/55 nm båndpasfilter. F) Sammenligning af fluorescensintensiteten af en 50 μM opløsning af TMRM anvendt ved hjælp af mikrovolumenperfusionssystemet som i B og et stille bad indeholdende 50 μM TMRM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Baggrundssubtraktion og blegningskorrektion. (A) Spektralbillede (rumlig information i y-dimensionen, bølgelængde i x-dimensionen) af en udækket plasmamembran fra en celle, der udtrykker ANAP-mærkede KATP-kanaler. 5 μM TNP-ATP blev anvendt ved hjælp af den opsætning, der er beskrevet i figur 2B. Den orange boks angiver interesseområdet (ROI), svarende til den udækkede membran. Den grå boks angiver baggrundsområdet, der bruges til at korrigere spektret. (B) Emissionsspektre afledt af bølgelængde-for-bølgelængde-gennemsnit af ROI og baggrundsregioner i A. (C) Spektrum afledt ved at trække det gennemsnitlige baggrundsspektrum fra det gennemsnitlige ROI-spektrum i B. Vinduet på 5 nm omkring ANAP-toppen, der bruges til at bestemme gennemsnitsintensiteten, vises som et gråt skraveret område. (D) Spektre erhvervet fra seks på hinanden følgende 10-s eksponeringer af en udækket plasmamembran fra en celle, der udtrykker ANAP-mærkede KATP-kanaler. Bemærk nedgangen i fluorescens som følge af fotoblegning. Indsatsen viser den normaliserede maksimale fluorescenstilpasning med et enkelt eksponentielt henfald af formen F/Fmax = A*exp(-t/τ) + (1-A). Symbolerne i indsatsen er farvekodede for at matche spektrene. (E) De samme spektre som i D korrigeret for fotoblegning. Indsatsen viser den normaliserede topfluorescens fra D som åbne cirkler, med den korrigerede topfluorescens vist ved hjælp af fyldte cirkler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Samtidige målinger af nukleotidbinding og kanalstrømme ved hjælp af patch-clamp fluorometri (PCF). (A) Skematisk visning af den eksperimentelle opsætning til måling af nukleotidbinding og ioniske strømme. (B) Eksempelstrømme (venstre) og spektre (højre) erhvervet fra et membranplaster udskåret fra en celle, der udtrykker ANAP-mærkede KATP-kanaler . Strømme blev registreret med et holdepotentiale på -60 mV, digitaliseret ved 20 kHz og filtreret ved 5 kHz. Det grå skraverede område svarer til det bølgelængdeområde, hvorfra ANAP-intensiteten blev kvantificeret. Tilpasset fra Usher et al. (udgivet under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. (C) Spektrum erhvervet fra et membranplaster udskåret fra en celle, der udtrykker ANAP-mærkede KATP-kanaler udsat for 1 mM TNP-ATP. Bemærk den negative top svarende til bølgelængdeområdet, over hvilket TNP-ATP-fluorescens observeres. Det grå skraverede område angiver bølgelængdeområdet, der bruges til at kvantificere ANAP-fluorescens som i B. Tilpasset fra Usher et al. (udgivet under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. D) Lysfeltsbilleder og fluorescerende billeder af en plasterpipette udsat for 1 mM TNP-ATP. Stjernen markerer pipettens spids. E) Spektralbillede af samme plasterpipette i 1 mM TNP-ATP. Stjernen markerer pipettens position. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: TNP-ATP-binding til ANAP-mærkede KATP-kanaler. (A) Spektrale billeder af en udækket plasmamembran fra en celle, der udtrykker ANAP-mærkede K ATP-kanaler i fravær af TNP-ATP eller i nærværelse af 50 μM eller 1 mM TNP-ATP. Intensiteter vises som et varmekort. (B) Spektre med bølgelængde for bølgelængde i gennemsnit fra billederne i A, der viser slukning af ANAP-fluorescens ved TNP-ATP. De skraverede områder repræsenterer to forskellige båndpasfiltre, der kan bruges til at måle ANAP-slukning, hvis et spektrometer ikke er tilgængeligt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Slukning af ANAP-mærkede K ATP-kanaler af TNP-ATP i membraner uden tag og PCF. Overlejring af data fra Usher et al. (udgivet under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. Data passede til Hill-ligningen : F / F max = E max + (1 - E max) / (1 + 10 (EC50 - [TNP-ATP])*h). F er den målte fluorescens, F max er den maksimale fluorescens i fravær af nukleotid, Emax er den maksimale slukning ved mættende nukleotidkoncentrationer, og h er Hill-hældningen. EC50 (nukleotidkoncentrationen, hvor slukning er halvt maksimal) og [TNP-ATP] er logværdier. Membraner uden tag: EC50 = -4,59 (25,7 μM), h = 0,82, Emax = 0,93. PCF: EC50 = -4,11 (77,6 μM), h = 0,87, Emax = 1,00. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Vi har udviklet en metode til at måle adeninnukleotidbinding i realtid til intakte membranproteiner. Vores metode bygger på flere andre etablerede teknikker, herunder mærkning af proteiner med ANAP ved hjælp af ravstopkodonundertrykkelse 12, celleafdækning 14 og spændingsklemmefluorometri / PCF 19,20,21,22,23,24,25 . Syntesen af disse tilgange muliggør måling af nukleotidbinding med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Faktisk var vi i vores tidligere arbejde i stand til at skelne mellem forskellige bindingssteder på det samme proteinkompleks ved hjælp af denne tilgang10,11. Det er vigtigt, at denne teknik kan anvendes direkte på små mængder protein i et cellulært miljø under forhold, der bevarer proteinfunktionen. Ved hjælp af vores bindingsmetode sammen med direkte, elektrofysiologisk aflæsning af ionkanalstrømme kan vi få rig indsigt i det molekylære grundlag for kanalgating11.

Da spektrometre er et ikke-standardiseret stykke laboratorieudstyr, kan ANAP-intensiteten også overvåges relativt isoleret ved hjælp af båndpasfiltre. Figur 5B viser spektrale egenskaber af to sådanne filtre. 470/10 nm båndpasfilteret screener effektivt fluorescenssignalet fra TNP-ATP og overlapper godt med peak ANAP-fluorescensen. Imidlertid er toptransmissionen for dette filter kun omkring 50%, hvilket kan gøre det vanskeligt at opnå gode signaler fra svage membraner (eller i udskårne membranpletter under spændingsklemme). En anden mulighed er et 460/60 nm båndpasfilter. Der er lidt mere overlapning mellem 460/60 nm-filteret og foden af TNP-ATP-emissionstoppen sammenlignet med 470/10 nm-filteret. Imidlertid har 460/60 nm båndpasset en transmission på 90-95% over et bredt område af ANAP-toppen, hvilket forventes at øge fluorescensemissionssignalet.

ANAP er en miljøfølsom fluorofor 12,26,27. Topemissionen og kvanteudbyttet varierer afhængigt af inkorporeringsstedet på proteinet af interesse og kan ændre sig, efterhånden som proteinet ændrer konformation. Sådanne ændringer ville være umiddelbart tydelige ud fra emissionsspektre, men ville ikke være så indlysende, når ANAP-intensiteten måles ved hjælp af filtre. Under alle omstændigheder kræves passende kontroller for at påvise, at fluorescenssignalet ikke varierer på grund af ændringer i det lokale miljø omkring ANAP efter nukleotidbindingen. Kontroleksperimenter med umærkede nukleotider kan hjælpe med at verificere, at eventuelle ændringer i ANAP-intensitet er resultatet af FRET mellem ANAP og TNP-nukleotider. TNP-nukleotider kan binde uspecifikt til membranerne afledt af utransfekterede celler (enten til plasmamembranen eller til native membranproteiner)10. Vi kvantificerer binding som et fald i donorfluorescensen, da dette signal er specifikt for den mærkede kanal. Vi anbefaler dog at udføre yderligere kontrolforsøg for hvert agonist/receptorpar, for eksempel mutering af nukleotidbindingsstedet, hvis det er kendt, for at verificere, at ændringen i donorfluorescens virkelig er resultatet af direkte binding til den mærkede receptor11. Endelig anbefales det at arbejde med konstruktioner, der indeholder et fluorescerende proteinmærke ud over ANAP-mærket. Dette hjælper med at differentiere mærket receptorfluorescens fra baggrund / autofluorescens. Baggrundsfluorescens kan skelnes fra ANAP ved toppen og formen af emissionsspektre10, men sådanne bestemmelser kan være meget vanskelige, når der kun anvendes filtersæt. Derudover kan celler og udækkede membraner, der udtrykker fluorescerende receptorer, identificeres ved hjælp af fluorescerende proteinmærke uden at skulle excitere ANAP og risikere overdreven fotoblegning.

I mange af vores PCF-optegnelser observerede vi en stærk negativ top i vores spektre ved høje TNP-ATP-koncentrationer (figur 4C). Denne negative top er en artefakt af vores baggrundssubtraktionsprotokol. Figur 4D viser lysfeltsbilleder og fluorescerende billeder af en plasterpipette udsat for 1 mM TNP-ATP. Der er tydelig en skygge ved pipettespidsen, som skyldes udelukkelse af TNP-ATP fra pipettevæggenes volumen, hvilket er mest tydeligt inden for fokusplanet. Spektralbilledet i figur 4E viser et mørkt bånd, der svarer til denne skygge. Når et område over eller under dette mørke bånd bruges til baggrundssubtraktion, producerer det en negativ top. Det er vigtigt, at denne top fandt sted over et bølgelængdeområde svarende til TNP-ATP-emission og påvirkede ikke vores målinger af ANAP-slukning.

Den største begrænsning af vores eksperimenter var at opnå tilstrækkelig plasmamembranekspression af ANAP-mærkede konstruktioner til måling af fluorescens. Det var generelt lettere at erhverve spektre af høj kvalitet fra udækkede membraner end i PCF på grund af deres større størrelse og vores evne til hurtigt at scanne en hel skål med udækkede membraner, i modsætning til PCF, hvor patches kun kan fås en ad gangen. I vores eksperimenter var dataene fra membraner uden tag og PCF-eksperimenter ens, men ikke ækvivalente (figur 6)11. Der er dog ingen a priori grund til, at dette skulle være en universel observation, da proteiner i en plasterpipette kan være i en anden funktionel tilstand end dem i membraner uden tag.

Her er der gjort forsøg på at maksimere ekspressionen af vores ANAP-mærkede konstruktioner, især sænke cellekulturtemperaturen til 33 °C10,11,16. Efter vores erfaring resulterede forsøg på at identificere steder i proteinet, hvor ANAP ville være en konservativ substitution, ikke konsekvent i konstruktioner, der udtrykte sig godt. Vi havde større succes med systematisk at scanne hele proteinområder for ANAP-inkorporeringssteder og screene kandidater for overfladeekspression10. ANAP-mærkningssystemet fungerer også i Xenopus laevis oocytter, hvilket gør det muligt at udskære meget større membranplastre, hvilket øger signalet til støj26,27,28.

Mens større ekspressionsniveauer forventes at resultere i lysere signaler, afhænger det mindste antal kanaler, der kræves for at måle fluorescens, af flere faktorer, herunder fluoroforens lysstyrke, graden af fotoblegning, intensiteten af excitationslyset og fokusplanet. I teorien kunne estimater foretages ved at korrelere fluorescensintensiteten og kanalstrømmen, som tidligere har vist28,29. Pålideligheden af sådanne estimater kræver imidlertid et vist kendskab til enkeltkanalens konduktans og kanalens åbne sandsynlighed. Ud over de faktorer, der er anført ovenfor, vil fluorescenssignalet også blive påvirket af kanaler forbundet med vesikler eller sektioner af plasmamembranen, der sidder fast på pipetteglasset, der ikke er under spændingsklemme.

Denne metode er let tilpasset undersøgelsen af andre nukleotidfølsomme ionkanaler. CFTR svarer strukturelt til tilbehørssulfonylurinstofreceptorunderenheden af KATP30,31. Ligesom KATP CFTR styres gating af nukleotidbinding, hvilket gør det til et oplagt fremtidigt mål for vores metode7. Purinerge P2X-receptorer er ionkanaler gated af ekstracellulær ATP9. TNP-ATP virker som en antagonist for P2X-receptorer32,33. Derfor vil det ikke være nyttigt at studere P2X-aktivering, selvom det kan bruges i konkurrenceanalyser med P2X-agonister. Alternativt kan andre fluorescerende ATP-derivater med tilstrækkelig spektral overlapning med ANAP-emission anvendes til at undersøge aktivering. Alexa-647-ATP er en fluorescerende P2X-agonist34. Den beregnede R0 mellem Alexa-647 og ANAP er ~85 Å, hvilket betyder, at direkte binding til P2X skulle resultere i betydelig slukning af ANAP inkorporeret i kanalen. Imidlertid vil en så lang R0 også resultere i slukning fra Alexa-647-ATP bundet til nærliggende underenheder og øger sandsynligheden for, at ikke-specifik nukleotidbinding vil resultere i FRET. Da ligandbindingsstedet i P2X-receptorer er ekstracellulært, vil bindingsmålinger blive udført på intakte celler, i helcellespændingsklemme eller i udefrakommende membranplastre. Vores metode kan også udvides til at studere binding og aktivering af elektrogene og ikke-elektrogene transportører og pumper, der er afhængige af ATP for deres reaktionscyklus samt G-proteinkoblede P2Y-receptorer. Endelig, selvom vi har udviklet denne metode til måling af adeninnukleotidbinding (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), kan den samme tilgang bruges til at studere binding til stort set enhver receptor, for hvilken en passende, fluorescerende ligand er blevet identificeret.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Raul Terron Exposito for fremragende teknisk assistance. Dette arbejde blev finansieret af Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/R002517/1; MCP og FMA) og Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T75 tissue-culture treated flask StarLab CC7682-4875
0.1% w/v poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
30 mm borosilicate cover glass slips VWR 631-0174
35 mm non-treated sterile dishes CytoOne CC7672-3340
35 mm cover glass bottom dish WPI FD35-PDL-100
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 31966021
Foetal bovine serum (FBS) Gibco 10500-064
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
TrypLE select (tryosin) Gibco 12563-011 Trypsin/EDTA reagent
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14040-091
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-035
HEK293T cells ATTC CRL-3216 Used between passages 5-30
ANAP-TFA AsisChem ASIS-0014 Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM
pANAP expression plasmid Addgene Plasmid #48696 Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein
peRF1-E55D Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor
TransIT-LT1 Mirus Bio MIR 2300 Lipopolyplex transfection reagent
Thick-walled borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15
Tetramethylrhodamine-5-maleimide Sigma-Aldrich 94506
TNP-ATP Jena Bioscience NU-221L Delivered at 10 mM in water
Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope Nikon
60x water immersion objective (1.4 NA) Nikon MRD07602
4-Wavelength High-Power LED Head ThorLabs LED4D245 385/490/565/625 nm LEDs
Four-Channel LED Driver ThorLabs DC4100
390/18 nm band-pass excitation filter ThorLabs MF390-18 For ANAP excitation
400 nm long-pass emission filter ThorLabs FEL0400 For imaging ANAP spectra
416 nm edge dichroic ThorLabs MD416 For imaging ANAP spectra
460/60 nm band-pass emission filter ThorLabs MF460-60 Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
470/10 nm band-pass emission filter ThorLabs FB470-10 Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
531/40 band-pass excitation filter Brightline FF01-531/40-25 For orange fluorescent protein (OFP) excitation
540/25 nm band-pass excitation filter Chroma D540/25X For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation
562 nm edge dichroic Semrock FF562-Di03 For imaging OFP fluorescence
565 nm edge dichroic Chroma 565DC For imaging TMRM fluorescence
593/40 nm band-pass excitation filter Brightline FF01-387/11-25 For imaging OFP fluorescence
605/55 nm band-pass emission filter Chroma D605/55M For imaging TMRM fluorescence
IsoPlane-160 Imaging Spectrometer Princeton Instruments IsoPlane-160
PIXIS 400BR_eXcelon Camera Princeton Instruments PIXIS: 400BR_eXcelon
Axopatch 200B amplifier Molecular Devices Axopatch 200B-2
Digidata 1440A digitizer Molecular Devices Digidata 1440A
Probe sonicator Sonics & Materials VC-50 For unroofing
REGLO digital peristaltic pump Ismatec ISM 832 For bath perfusion
Microvolume perfusion system ALA Scientific Instruments ALA μFlow-8 For TNP-ATP perfusion
pClamp 10.6.2 Molecular Devices Recording and analysing currents
Lightfield 5.20.1507 Princeton Instruments Acquisition software for images and spectra
Matlab Mathworks For data analysis
Python 3.8.1 Python Software Foundation For data analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. Ion channels find a pathway for therapeutic success. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).
  2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
  3. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  4. Higgins, C. F., Linton, K. J. The ATP switch model for ABC transporters. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).
  5. Toyoshima, C., Cornelius, F. New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).
  6. Craven, K. B., Zagotta, W. N. CNG and HCN channels: two peas, one pod. Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).
  7. Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).
  8. Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model. Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).
  9. Burnstock, G. Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).
  10. Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding. Elife. 8, 41103 (2019).
  11. Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry. Elife. 9, 52775 (2020).
  12. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  13. Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane. Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).
  14. Heuser, J. The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy. Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).
  15. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  16. Lin, C. Y., et al. Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature. PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).
  17. Usukura, J., et al. Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions. Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).
  18. Colquhoun, D. Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors. British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).
  19. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  20. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  21. Zheng, J., Zagotta, W. N. Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels. Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).
  22. Biskup, C., et al. Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels. Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).
  23. Kusch, J., et al. Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels. Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).
  24. Wu, S., et al. State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry. Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).
  25. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  26. Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).
  27. Kalstrup, T., Blunck, R. S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).
  28. Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).
  29. Liu, C., et al. Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance. Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).
  30. Hwang, T. C., et al. Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction. Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).
  31. Puljung, M. C. Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels. Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).
  32. Kasuya, G., et al. Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel. Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).
  33. Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors. Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).
  34. Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 169 ligandbinding membranprotein ionkanal nukleotid metode patchklemme fluorescens spektre receptor
Måling af nukleotidbinding til intakte, funktionelle membranproteiner i realtid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Usher, S. G., Ashcroft, F. M.,… More

Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time. J. Vis. Exp. (169), e61401, doi:10.3791/61401 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter