Summary
Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.
Abstract
We hebben een methode ontwikkeld om de binding van adenine-nucleotiden aan intacte, functionele transmembraanreceptoren in een cellulaire of membraanomgeving te meten. Deze methode combineert expressie van eiwitten gelabeld met het fluorescerende niet-canonieke aminozuur ANAP, en FRET tussen ANAP en fluorescerende (trinitrofenyl) nucleotidedederivaten. We presenteren voorbeelden van nucleotidebinding aan ANAP-gelabelde KATP-ionkanalen gemeten in niet-overdekte plasmamembranen en weggesneden, binnenstebuiten gekeerde membraanpleisters onder spanningsklem. Dit laatste maakt gelijktijdige metingen van ligandbinding en kanaalstroom mogelijk, een directe uitlezing van de eiwitfunctie. Databehandeling en -analyse komen uitgebreid aan bod, samen met mogelijke valkuilen en artefacten. Deze methode biedt rijke mechanistische inzichten in de ligand-afhankelijke gating van KATP-kanalen en kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van andere nucleotide-gereguleerde eiwitten of elke receptor waarvoor een geschikt fluorescerend ligand kan worden geïdentificeerd.
Introduction
Verschillende belangrijke eiwitklassen worden direct gereguleerd door ligandbinding. Deze variëren van oplosbare enzymen tot membraan-ingebedde eiwitten, waaronder receptor tyrosinekinasen, G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's) en ionkanalen. GPCR's en kanalen zijn goed voor ~34% en ~15% van alle huidige medicijndoelen, respectievelijk 1,2. Daarom is er een aanzienlijke biochemische, evenals medische interesse in het ontwikkelen van methoden die mechanistische inzichten bieden in ligand-receptorinteracties. Traditionele methoden voor het meten van ligandbinding, waaronder fotoaffiniteitsetikettering en radioligandbindingsstudies, vereisen grote hoeveelheden gedeeltelijk gezuiverd eiwit en worden meestal uitgevoerd onder niet-fysiologische omstandigheden en tijdschalen. Een ideale methode zou slechts kleine hoeveelheden eiwit vereisen, zou kunnen worden uitgevoerd op intacte eiwitten die tot expressie komen in een cellulaire of membraanomgeving, zou in realtime kunnen worden gecontroleerd en zou compatibel zijn met directe uitlezingen van de eiwitfunctie.
Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een methode die de nabijheid tussen twee fluorescerend gelabelde moleculen detecteert3. FRET treedt op wanneer een geëxciteerde donorfluorofoor energie op een niet-stralingsmanier overdraagt aan een acceptormolecuul (meestal een andere fluorofoor). Energieoverdracht resulteert in het blussen van de donorfluorescentie-emissie en sensibilisatie van de acceptoremissie (als de acceptor een fluorofoor is). De overdrachtsefficiëntie is afhankelijk van de6e macht van de afstand tussen de donor en de acceptor. Bovendien moeten de donor en acceptor in de buurt zijn (meestal minder dan 10 nm) om FRET te laten optreden. Als zodanig kan FRET worden gebruikt om de directe binding tussen een fluorescerend gelabelde eiwitreceptor en een fluorescerend ligand te meten.
Verschillende eiwitten worden gereguleerd of geactiveerd door intracellulaire of extracellulaire adeninenucleotiden (ATP, ADP, AMP, cAMP) te binden. Veel transporteiwitten hebben ATP-hydrolyse nodig voor hun reactiecyclus, waaronder ATP-bindende cassettetransporters en P-type ATPases zoals de Na+/K+ pomp 4,5. ATP-gevoelige K + (KATP) kanalen, de cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) en cyclisch-nucleotide gereguleerde kanalen zijn allemaal ionkanalen die worden afgesloten door de binding van intracellulaire adenine nucleotiden, waardoor ze buitengewoon gevoelig zijn voor veranderingen in cellulair metabolisme en signaaltransductie 6,7,8 . Purinerge P2X- en P2Y-receptoren reageren op veranderingen in extracellulaire ATP, die kunnen worden vrijgegeven als een neurotransmitter of als gevolg van weefselbeschadiging9. We hebben een FRET-gebaseerde assay ontwikkeld voor het meten van adenine nucleotide binding aan membraaneiwitten in real time. We hebben deze methode eerder toegepast om nucleotidebinding aan KATP-kanalen 10,11 te bestuderen.
Om de nucleotidebinding via FRET te meten, moet een interessant eiwit eerst worden gelabeld met een fluorofoor. Het fluorescerende label moet plaatsspecifiek in het eiwit van belang worden ingebracht, zodat het dicht genoeg bij de ligandbindingsplaats ligt om FRET te laten optreden, met speciale aandacht om ervoor te zorgen dat het label de algehele structuur en functie van het eiwit niet beïnvloedt. Om dit te bereiken, gebruiken we een techniek ontwikkeld door Chatterjee et al., met behulp van amber stop-codon onderdrukking om een fluorescerend niet-canoniek aminozuur (l-3-(6-acetylnaftaleen-2-ylamino)-2-aminopropionisch in te voegen; ANAP) op de gewenste locatie12. We meten nucleotidebinding als FRET tussen ANAP-gelabeld eiwit en fluorescerende, trinitrofenyl (TNP) nucleotidederivaten (figuur 1A). Het emissiespectrum voor ANAP overlapt met het absorptiespectrum van TNP-nucleotiden, een voorwaarde die nodig is om FRET te laten optreden (figuur 1B). Hier schetsen we twee verschillende soorten bindingsexperimenten. In de eerste wordt nucleotidebinding aan de intracellulaire kant van ANAP-gelabelde KATP-kanalen gemeten in cellen die zijn losgemaakt door ultrasoonapparaat, waardoor aanhangende fragmenten van plasmamembraan op een glazen afdekplaat10,11,13,14 achterblijven.
In de tweede methode wordt nucleotidebinding aan ANAP-gelabelde KATP-kanalen gemeten in een membraanpleister onder spanningsklem, waardoor gelijktijdige meting van ionische stromen en fluorescentie mogelijk is. Door deze twee experimentele benaderingen te combineren, kunnen veranderingen in binding direct worden gecorreleerd met veranderingen in kanaalfunctie11. Typische resultaten, mogelijke valkuilen en data-analyse worden besproken.
Protocol
1. Voorbereiding van afdekstroken
OPMERKING: Deze stappen moeten plaatsvinden in een steriele weefselkweekkap. Hoeveelheden worden gegeven voor de bereiding van 10 gerechten.
- Plaats tien geautoclaveerde, 30 mm borosilicaat afdekglas glijdt afzonderlijk in tien 35 mm niet-behandelde steriele schalen en spoel eenmaal af met 2 ml steriel, gedestilleerd water.
- Verdun 1 ml 0,1% m/v poly-L-lysineoplossing tot steriel, gedestilleerd water tot een totaal volume van 10 ml (eindconcentratie van 0,01% m/v). Meng goed, pipetteer vervolgens 1 ml op elke afdekslip en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig de poly-L-lysine op en was elke dekslip twee keer met ten minste 2 ml steriel gedestilleerd water. Laat tot het volledig droog is, d.w.z. ten minste 3 uur.
2. HEK-293T cellen zaaien
OPMERKING: Deze stappen moeten plaatsvinden in een weefselkweekkap. HEK-293T-cellen werden gekozen vanwege hun lage stroomachtergrond en het gemak van groeien in cultuur. Dit protocol kan worden aangepast aan andere celtypen.
- Spoel een 80-90% confluente T75-kolf van HEK-293T-cellen eenmaal met 12 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voordat u gedurende 2-5 minuten incubeert met 2 ml trypsine, of totdat de cellen volledig zijn losgemaakt en bijna volledig zijn gedissocieerd.
- Resuspendeer de cellen door toevoeging van 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine. Pipetteer zachtjes tegen de bodem van de kolf om de resterende klonten cellen te breken.
- Voeg 2 ml aangevulde DMEM toe aan het gewenste aantal schalen van 35 mm met gecoate afdekstroken. Voeg 100 μL geresuspendeerde cellen toe aan elk gerecht. Incubeer een nacht bij 37 °C.
3. Transfectie
OPMERKING: Deze stappen moeten plaatsvinden in een weefselkweekkap. Hoeveelheden worden gegeven voor de transfectie van 10 gerechten. Voor locatiespecifieke ANAP-opname moet het DNA-codon op de positie die bedoeld is voor etikettering worden vervangen door het oranje (TAG) stopcodon. Deze constructie is co-getransfecteerd met twee plasmiden: pANAP en peRF1-E55D12,15. pANAP codeert voor verschillende kopieën van een ANAP-specifiek tRNA/tRNA-synthetasepaar. In aanwezigheid van ANAP produceert transfectie van dit plasmide tRNA geladen met ANAP dat het amberkleurige stopcodon herkent. peRF1-E55D codeert voor een dominante negatieve ribosomale afgiftefactor die de opbrengst van anap-gelabeld eiwit over de volledige lengte verhoogt.
- Bereid een buis van 1,5 ml met 10 μg pANAP, 10 μg peRF1-E55D en DNA voor het construct dat bedoeld is voor etikettering met ANAP. Breng tot een eindvolume van 500 μL met ongesupplementeerde DMEM.
- Bereid in een aparte buis 3 μl op lipiden gebaseerd transfectiereagens (zie tabel met materialen) voor elke 1 μg DNA en breng het tot een eindvolume van 500 μl met niet-aangevulde DMEM.
- Combineer de DNA- en transfectiereagensmengsels in een enkele buis en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 400 μL van de 1 mM ANAP-voorraad (trifluoracetaatzout in 30 mM NaOH) toe aan 20 ml aangevuld DMEM voor een eindconcentratie van 20 μM ANAP. Vervang de oude media uit de vergulde cellen door 2 ml van de ANAP-bevattende media per schaal.
- Pipetteer 10% van de DNA-transfectie meng op elk gerecht. Incubeer bij 33 °C gedurende 2-4 dagen vóór de experimenten. Incubatie bij 33 °C vertraagt de celdeling en verhoogt de eiwitopbrengst per cel16.
4. Niet-overdekte membraanexperimenten
- Gebruik een tang om een afdekslip met getransfecteerde cellen in kleinere fragmenten te breken.
- Volg een van de onderstaande procedures om het dak van cellen te ontgrendelen.
- Als u voorgecoate afdekstroken gebruikt, spoelt u een fragment af met PBS en plaatst u het vervolgens op de bodem van een schaal van 35 mm met 2 ml PBS. Kort soniceren met behulp van een sondesonator (50 W, 20% -40% amplitude, 3 mm sonde) die 3-5 mm boven het monster is geplaatst om cellen los te maken en aanhangende plasmamembraanfragmenten achter te laten (figuur 2A, C).
OPMERKING: Het vermogen van de sonicator, de duur en de sondehoogte boven het monster kunnen allemaal worden gevarieerd om een hoge opbrengst van niet-overdekte membranen te verkrijgen zonder de dekplaat volledig te ontmaskeren. - Als u geen voorgecoate afdekstroken gebruikt, spoelt u een afdekslipfragment af met PBS en dompelt u vervolgens gedurende ~ 30 s in een buis met 0,1% w / v poly-L-lysine voordat u kort soniceert (zoals in stap 4.2.1) om cellen los te maken en niet-overdekte plasmamembraanfragmenten achter te laten (figuur 2A, C, D). Korte blootstellingen aan poly-L-lysine hebben aangetoond dat ze de hechting aan de coverslip13 verbeteren.
- Als u voorgecoate afdekstroken gebruikt, spoelt u een fragment af met PBS en plaatst u het vervolgens op de bodem van een schaal van 35 mm met 2 ml PBS. Kort soniceren met behulp van een sondesonator (50 W, 20% -40% amplitude, 3 mm sonde) die 3-5 mm boven het monster is geplaatst om cellen los te maken en aanhangende plasmamembraanfragmenten achter te laten (figuur 2A, C).
- Plaats het gesonificeerde fragment in een deksel glazen bodem 35 mm schaal met 2 ml badoplossing en monteer op een omgekeerde microscoop uitgerust met een hoge NA, 60x water onderdompeling objectief. De camerapoort van de microscoop is aangesloten op een spectrograaf in serie met een zeer gevoelige CCD-camera. Perfuseer de badkamer (0,5 – 1 ml/min) met buffer met behulp van een peristaltische pomp. De samenstelling van de buffer zal variëren afhankelijk van het onderzochte eiwit.
OPMERKING: Als de gebruiker geen toegang heeft tot een objectief met een lange werkafstand, kan het onmogelijk zijn om te focussen op de niet-gedekte membraanfragmenten vanwege de extra hoogte van de afdekslip. Een alternatief is om cellen direct te zaaien op schalen met poly-L-lysine glazen bodems (zie Tabel van Materialen voor een voorbeeld). Dit vermindert ook mogelijke aberraties in het beeld die gepaard gaan met scherpstellen door twee stukken glas. Deze aberraties hebben geen invloed op de vorm van de verkregen spectra. - Identificeer niet-geroofde membraanfragmenten die het ANAP-gelabelde kanaal tot expressie brengen door te zoeken naar kanaalfluorescentie (figuur 2C,D).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een extra fluorescerend label te gebruiken (waarbij het emissiespectrum te onderscheiden is van het ANAP-emissiespectrum) om niet-geroofde membranen te helpen identificeren die het eiwit van belang bevatten. De experimenten in figuur 2C,D werden uitgevoerd op ANAP-gelabelde kanalen met C-terminale fluorescerende eiwittags. - Schakel het spectrometermasker gedeeltelijk in (verhoog ~ 10%) tussen de camerapoort op de microscoop en de spectrograaf. De schaduw van het masker verschijnt op het camerabeeld. Lijn het niet-overdekte membraan uit met het spectrometermasker door het microscoopstadium aan te passen. Verkrijg een helder veld- en fluorescentiebeeld van het niet-overdekte membraan. Deze zullen worden gebruikt om een regio van belang te selecteren voor analyse.
- Breng de punt van het microvolumeperfusiesysteem dicht bij het niet-overdekte membraan.
OPMERKING: Om de achtergrondfluorescentie te verminderen, werd de uitstroom van het perfusiesysteem vervangen door een aangepaste tip gemaakt van borosilicaatglas. - Om fluorescentiespectra in beeld te brengen, prikkelt u het membraan met een 385 nm LED door een 390/18 nm band-pass excitatiefilter en een 416 nm edge dichroic. Vang uitgestraald licht op via een 400 nm langdoorlaatemissiefilter (figuur 2B).
- Schakel het spectrometermasker in en zorg ervoor dat het uitgestraalde licht wordt doorgelaten. Schakel de spectrometerroosters in (300 groeven/mm). Met de roosters op hun plaats wordt het licht dat door de spectrometer wordt verspreid, geprojecteerd op de chip van de CCD-camera om spectrale beelden te produceren (figuur 3A). Deze beelden behouden ruimtelijke informatie in de y-dimensie . De x-dimensie wordt vervangen door golflengte.
- Optioneel, als het eiwit van belang is gelabeld met een fluorescerend eiwit, verkrijgt u een spectraal beeld van het fluorescerende eiwit met behulp van de juiste filterset.
- Neem een of meer blootstellingen van 0,1-10 s aan het begin van het experiment terwijl u de nucleotidevrije bufferoplossing perfuseert. Deze zullen worden gebruikt om gegevens gedurende de rest van het experiment te corrigeren en te normaliseren (zie sectie 5 hieronder).
OPMERKING: De keuze van de belichtingstijd is afhankelijk van het bereikte expressieniveau, de helderheid van de fluorofoor en de optiek. De blootstellingstijd moet worden gekozen om het signaal te maximaliseren en de waargenomen bleeksnelheid te minimaliseren. Het in punt 4.10 aangegeven belichtingstijdbereik is geschikt voor evenwichtsbindingsmetingen, maar kan nuttig zijn voor het meten van langzamere kinetische veranderingen10. De mogelijkheid om korte belichtingstijden te gebruiken om snellere kinetiek te volgen, wordt beperkt door eiwitexpressieniveaus en fotobleaching, in plaats van hardware. - Breng een reeks concentraties TNP-ATP (meestal bereid in badoplossing) aan om een concentratie-responscurve vast te stellen. Perfuseer elke oplossing gedurende ten minste 1 minuut om ervoor te zorgen dat een stabiele toestand wordt bereikt en spoel elke concentratie gedurende ten minste 1 minuut uit met een badoplossing.
OPMERKING: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het perfusiesysteem snel een evenwicht kan bereiken (figuur 2E) en de juiste lokale concentratie van TNP-ATP kan bereiken (figuur 2F). - Neem een blootstelling (met dezelfde duur als gebruikt in stap 4.10) bij elke concentratie en aan het einde van elke uitspoeling.
5. Spectrale analyse
OPMERKING: Deze instructies zijn geschreven voor gebruik met de analysecode "pcf.m", die te vinden is op GitHub. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. Aanvullende en alternatieve code is te vinden ophttps://github.com/smusher/KATP_paper_2019 11. We hebben de bewerkingen beschreven die door de software worden uitgevoerd, zodat de gebruiker zijn eigen code kan maken of ervoor kan kiezen om de gegevens handmatig te analyseren.
- Start het analyseprogramma door de naam van het programma ("pcf") op de opdrachtregel te typen.
- Wanneer een dialoogvenster voor geopende bestanden/mappen wordt geopend met de prompt: "Selecteer bestanden voor ROI", selecteert u de bestandsnamen die zijn gekoppeld aan de brightfield- en fluorescentieafbeeldingen van het niet-gedekte membraan. Er verschijnt een prompt op de opdrachtregel om de naam van het uitvoerbestand te typen.
- Typ de bestandsnaam en druk op enter.
- Wanneer de software de brightfield- en fluorescentiebeelden weergeeft, selecteert u een interessegebied (ROI) in het spectrale beeld dat overeenkomt met de locatie van het niet-gedakte membraanfragment of de weggesneden patch (zie sectie 6) na de softwareprompts. Selecteer een achtergrondgebied in dezelfde spectrale afbeelding (met hetzelfde golflengtebereik als in de ROI) dat overeenkomt met een gedeelte van de afdekstrook of schotel zonder membraan (figuur 3A). De software vraagt om op de bovenkant van de ROI te klikken en op Enter te drukken, op de onderkant van de ROI te klikken en op Enter te drukken en dit proces vervolgens te herhalen voor het achtergrondgebied.
- Wanneer een dialoogvenster voor het openen van bestanden en mappen wordt geopend met de prompt: "Select File for FP Spectrum", selecteert u de bestandsnaam die is gekoppeld aan het fluorescerende eiwit (FP) spectrum (optionele stap 4.9). Als er geen FP-spectrum is verkregen, selecteert u een ander spectrumbestand. Het FP-spectrum dient als kwaliteitscontrole om onderscheid te maken tussen gelabeld eiwit en achtergrondfluorescentie.
- Wanneer een dialoogvenster voor het openen van bestanden en mappen wordt geopend met de prompt: "Select Files for Analyisis", selecteert u alle bestanden die overeenkomen met de ANAP-spectra (van stap 4.10 tot 4.12), inclusief de bestanden die nodig zijn voor bleekcorrectie.
- Wanneer een geopend dialoogvenster voor bestanden/mappen wordt geopend met de prompt: "Select Files for Bleaching Collection", selecteert u de subset van bestanden uit stap 5.6 die overeenkomen met de initiële spectra die aan het begin van het experiment in een nucleotidevrije oplossing zijn verkregen of spectra die zijn verkregen tijdens het wassen in een nucleotidevrije oplossing die moet worden gebruikt voor correctie (van stap 4.10 tot 4.12).
- Lijngemiddelde van elk beeld om spectra te produceren, d.w.z. het gemiddelde van de intensiteit voor alle pixels in de y-dimensie van een ROI of achtergrondgebied op elke golflengte. (Figuur 3B). Trek het resulterende gemiddelde achtergrondspectrum af van het gemiddelde spectrum dat is verkregen uit de ROI om achtergrondfluorescentie en fluorescentie van ongebonden TNP-ATP te verwijderen (figuur 3C). Deze stappen worden automatisch uitgevoerd door de software.
- Bepaal de ANAP-intensiteit voor elke blootstelling door het gemiddelde te nemen van de intensiteit van een 5 nm-venster gecentreerd rond de ANAP-piek van de afgetrokken spectra (meestal ~ 470 nm, maar kan variëren afhankelijk van de lokale micro-omgeving van het ANAP-residu).
OPMERKING: Figuur 3D toont 6 spectra verkregen uit opeenvolgende 10 s blootstellingen van een niet-geroofd membraanfragment dat ANAP-gelabelde kanalen tot expressie brengt. De inzet toont de gemiddelde intensiteit van de piek van elk spectrum. De software vindt automatisch de piekgolflengte in het eerste verkregen spectrum en gebruikt deze waarde overal. De intensiteit wordt automatisch berekend door de software. - Normaliseer de ANAP-intensiteiten voor elk experiment door de ANAP-intensiteit van een bepaalde blootstelling (F) te delen door de ANAP-intensiteit van de eerste blootstelling in de tijdreeks, die werd genomen in stap 4.10 (Fmax). Nogmaals, de software voert deze berekeningen automatisch uit.
- Voer de onderstaande stappen uit om gegevens te verkrijgen.
- Om te corrigeren voor ANAP-fotobleaching, past u eerst een enkel exponentieel verval aan, (F / Fmax) = A * exp (-t / τ) + (1-A), waarbij t de cumulatieve belichtingstijd is, τ de tijdconstante en A de amplitude) op de tussenliggende wasstappen tussen TNP-ATP-toepassingen of op meerdere initiële blootstellingen die worden genomen vóór het wassen op TNP-ATP (figuur 3D, inzet).
OPMERKING: De software geeft deze pasvorm weer en vraagt om deze te accepteren of af te wijzen. Als de pasvorm wordt afgekeurd, wordt een andere mogelijkheid geboden om bestanden te selecteren voor bleekcorrectie. - Deel de genormaliseerde (in stap 5.10) ANAP-spectra door de voorspelde waarde van de exponentiële fit uit stap 5.11.1 op elk tijdstip (figuur 3E).
OPMERKING: Voor het getoonde voorbeeld is de waargenomen genormaliseerde piekfluorescentie bij 50 s 0,65 en de voorspelde fluorescentie van de exponentiële fit 0,64. Om te corrigeren voor bleken, deelt u de waargenomen waarde (0,65, Figuur 3E inzet, lege cirkel) door de voorspelde waarde (0,64, Figuur 3E inzet, stippellijn) om de gecorrigeerde waarde te verkrijgen (~1, Figuur 3E inzet, gekleurde cirkel). Als bleekcorrectie adequaat is, moet de intensiteit van ANAP van alle blootstellingen die worden verkregen in afwezigheid van nucleotiden ongeveer gelijk zijn (figuur 3E). Deze berekeningen worden automatisch uitgevoerd door de software. - Verkrijg de uitvoer als een afbeelding die de gegevens plot en een spreadsheet met tabbladen met de onbewerkte spectra, afgetrokken spectra, spectra gecorrigeerd voor fotobleaching en de piekgegevens voor elk bestand, zodat verdere analyse kan worden uitgevoerd.
- Om te corrigeren voor ANAP-fotobleaching, past u eerst een enkel exponentieel verval aan, (F / Fmax) = A * exp (-t / τ) + (1-A), waarbij t de cumulatieve belichtingstijd is, τ de tijdconstante en A de amplitude) op de tussenliggende wasstappen tussen TNP-ATP-toepassingen of op meerdere initiële blootstellingen die worden genomen vóór het wassen op TNP-ATP (figuur 3D, inzet).
6. Patch-clamp fluorometrie experimenten
- Trek patchpipetten uit dikwandige borosilicaatglazen haarvaten tot een weerstand van 1,5 MΩ tot 2,5 MΩ wanneer ze worden gevuld met pipetoplossing. De samenstelling van de pipetoplossing zal variëren afhankelijk van het onderzochte eiwit.
- Breng een afdekslip met getransfecteerde cellen over op een schaal met glazen bodem van 35 mm met 2 ml badoplossing en monteer op een omgekeerde microscoop uitgerust met een hoog NA, 60x wateronderdompelingsobjectief. Perfuseer de badkamer (0,5 – 1 ml/min) met een badoplossing met behulp van een peristaltische pomp. Wat de pipetoplossing betreft, zal de badoplossing variëren afhankelijk van het onderzochte eiwit.
- Identificeer een cel die ANAP-gelabelde kanalen tot expressie brengt door te zoeken naar fluorescentie op het celmembraan.
- Vul een patchpipet met pipetoplossing. Breng zachte positieve druk aan op de pipet en plaats deze in de badkamer. Druk de pipet tegen het membraan van de cel en zuig zachtjes aan om een GΩ-afdichting te verkrijgen (figuur 4A).
- Snijd de pleister weg door de pipethouder snel van de cel af te bewegen (figuur 4A).
OPMERKING: Het exciseren van de pleister op deze manier moet een binnenstebuiten gekeerde pleister vormen, waarbij de cytosolische domeinen van het eiwit worden blootgesteld aan het perfusiesysteem. Als de locatie van de nucleotidebindingsplaats die wordt onderzocht niet cytosolisch is, zal het nodig zijn om buiten-uit-pleisters of hele celopnamen te gebruiken om PCF-experimenten uit te voeren. - Breng de punt van de patchpipet dicht bij de punt van het perfusiesysteem en controleer of de pleister zich in de spleet van het spectrometermasker bevindt (figuur 4A).
- Pas TNP-ATP en beeldspectra toe zoals in stap 4.10-4.12, terwijl u tegelijkertijd de ionische stroomrespons op nucleotidetoepassing registreert.
OPMERKING: Het pipetglas kan ruimtelijke aberraties en reflecties in de verkregen afbeeldingen introduceren. Deze aberraties hebben echter geen invloed op de vorm van de verkregen spectra en gereflecteerd excitatielicht kan gemakkelijk worden gescheiden van fluorescentie met behulp van de spectrograaf of een langdoorlaatemissiefilter. - Analyseer de spectra. Spectra die zijn afgebeeld van weggesneden vlekken kunnen overaftrek van ongebonden TNP-ATP-fluorescentie vertonen als gevolg van de uitsluiting van TNP-ATP uit het glas van de patchpipet (figuur 4C-E). Deze overaftrekking heeft geen invloed op het ANAP-emissiespectrum en kan dus worden genegeerd.
OPMERKING: Aangezien het fluorescentiesignaal in weggesneden plekken lager zal zijn dan in niet-overdekte membranen, is het belangrijk om een blootstellingstijd te gebruiken die voldoende signaal-tot-ruis geeft zonder ANAP te snel te bleken.
Representative Results
Figuur 2 toont de experimentele basisopstelling voor het meten van nucleotidebinding aan fluorescerende eiwitten in niet-overdekte membraanfragmenten verkregen door ultrasoonapparaat (figuur 2A,B). Twee verschillende benaderingen werden gebruikt om niet-geroofde membranen te verkrijgen, waarbij cellen direct werden gekweekt op poly-L-lysine-gecoate afdekstroken of cellen op onbehandeld glas werden gekweekt en kort werden blootgesteld aan poly-L-lysine (0,1% in water) voordat ze werden losgemaakt. Figuur 2C toont een typisch niet-gedekt membraanfragment van een HEK-293T-cel die KATP-kanalen tot expressie brengt die zijn gelabeld met oranje fluorescerend eiwit (OFP). Niet-gedekte membranen waren vrijwel onzichtbaar in heldere veldbeelden en werden geïdentificeerd door de fluorescentie van gelabelde membraaneiwitten of door tegenkleuring met een membraankleurstof zoals octadecylrhodamine B13. Naast niet-geroofde membranen produceerde ultrasoonapparaat van HEK-293T-cellen ook gedeeltelijk niet-geroofde celfragmenten (figuur 2D)10,17. Deze fragmenten waren zichtbaar in een helder veld. Dit kan het gevolg zijn van gegolfde plasmamembranen die slechts slecht hechten aan het dekglas. Als alternatief kunnen deze fragmenten blaasjes en membranen van intracellulaire organellen bevatten. Als zodanig verdient het de voorkeur om alleen beelden te verkrijgen van "echte" niet-geroofde membranen, omdat gelabeld doeleiwit geassocieerd met intracellulaire membranen tussenliggende stadia van posttranslationele verwerking en assemblage kan weerspiegelen. Het kweken van cellen op poly-L-lysine-gecoat glas wordt aanbevolen, omdat dit resulteerde in een hogere opbrengst van "echte" niet-geroofde membranen bij ultrasoonapparaat.
Een microvolumeperfusiesysteem werd toegepast op fluorescerende nucleotiden om de hoeveelheden die nodig zijn in een typisch experiment te minimaliseren (figuur 2B). De meegeleverde polyimide-gecoate glazen punt werd vervangen door een met de hand getrokken borosilicaatglaspunt in onze perfusieopstelling, waardoor de fluorescentie-achtergrond werd verminderd. Om de accumulatie van nucleotiden rond de niet-overdekte membranen die in beeld werden gebracht te minimaliseren, werd de hele badkamer langzaam doordrenkt met buffer. Als zodanig wilden we de snelheid van de oplossingsverandering van ons microvolumeperfusiesysteem meten en verifiëren of we in staat waren om de beoogde ligandconcentratie in ons interessegebied te bereiken, d.w.z. dat het ligand van ons perfusiesysteem niet direct in de badmedia werd verdund voordat het niet-overdekte membraan werd bereikt. Om deze mogelijkheden te controleren, werd het in- en uitspoelen van een 50 μM-oplossing van tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) uit ons microvolumeperfusiesysteem gericht op het oppervlak van een met water doordrenkte schaal met glazen bodem gemeten (figuur 2E). De kinetiek van de oplossingsuitwisseling was reproduceerbaar en goed beschreven door een enkel exponentieel verval met tijdconstanten van minder dan 1 s voor zowel wash-in als wash-out. Dergelijke oplossingsuitwisselingstijden beperken ons vermogen om kinetiek van ligandbinding en -ontbinding te meten in onze huidige opstelling. Om te controleren of we in staat waren om de gewenste ligandconcentratie aan het oppervlak van de afdeklaag te bereiken, vergeleken we de fluorescentie-intensiteit van 50 μM TMRM die door ons microvolumeperfusiesysteem aan de afdekstrook werd geleverd met 50 μM TMRM in een stilstaand bad (figuur 2F). Er werd geen verschil in intensiteit waargenomen, om te controleren of de juiste ligandconcentraties aan het oppervlak van de afdeklaag met ons microvolumeperfusiesysteem kunnen worden bereikt, zelfs wanneer het bad is doordrenkt.
Figuur 3A toont een spectraal beeld verkregen uit ANAP-gelabelde K ATP-kanalen in een niet-geroofd membraan van een HEK-239T-cel blootgesteld aan 5 μM TNP-ATP. Om dergelijke beelden te verkrijgen, werd het uitgezonden licht van het niet-overdekte membraan door een spectrometer in serie geleid met een CCD-camera. De uitgezonden fluorescentie werd van roosters gediffracteerd en op de camerachip geprojecteerd, waardoor spectra werden geproduceerd. De resulterende beelden behouden ruimtelijke informatie in de y-dimensie, maar de x-dimensie werd vervangen door golflengte. Het interessegebied (ROI), dat overeenkomt met het niet-overdekte membraan, is oranje omlijnd. Twee gebieden van hoge intensiteit zijn duidelijk zichtbaar in het beeld, overeenkomend met de piekemissie van ANAP en TNP-ATP. Dit werd het best gewaardeerd in het golflengte-per-golflengte-gemiddelde (over de gehele ROI) spectrum weergegeven in figuur 3B. De piek ~470 nm komt overeen met ANAP opgenomen in KATP; de piek ~535 nm komt overeen met TNP-ATP. Om te corrigeren voor achtergrondfluorescentie en directe excitatie van TNP-ATP in oplossing, werd uit elke afbeelding een achtergrondgebied (figuur 3A, grijs) geselecteerd. Het gemiddelde achtergrondspectrum is weergegeven in figuur 3B. Het uiteindelijke spectrum werd verkregen door het gemiddelde achtergrondspectrum af te trekken van het gemiddelde ROI-spectrum (figuur 3C).
ANAP is gevoelig voor fotoblekende artefacten. Figuur 3D toont de vermindering van piek ANAP-fluorescentie na meerdere blootstellingen. De piekfluorescentie van verschillende blootstellingen in afwezigheid van TNP-ATP (of van wasbeurten tussen concentraties TNP-ATP) werd aangebracht op een enkelvoudig exponentieel verval en dit werd gebruikt om te corrigeren voor fotobleaching artefacten (figuur 3E). Het uitvoeren van concentratie-responsexperimenten van zowel lage naar hoge als hoge tot lage nucleotideconcentraties wordt aanbevolen. Als bleekcorrectie geen extra artefacten introduceert, moeten de resultaten vergelijkbaar zijn11.
Figuur 5A toont representatieve spectrale beelden van een niet-geroofd membraan verkregen uit een cel die ANAP-gelabelde K ATP-kanalen tot expressie brengt in afwezigheid en aanwezigheid vanTNP-ATP. De gecorrigeerde spectra zijn weergegeven in figuur 5B. Bij het observeren van emissiespectra was er een duidelijke scheiding tussen de fluorescentie-emissie van donor en acceptor. Aangezien enige niet-specifieke binding van TNP-ATP aan naïeve plasmamembranen van niet-getransfecteerde HEK-293T-cellen werd waargenomen, wordt aanbevolen FRET te kwantificeren als een vermindering van de fluorescentie van de donor (ANAP)10,11. Deze piek was specifiek voor de gelabelde receptor.
Voor liganden die een conformatieverandering in hun receptor induceren, bieden bindingsstudies in isolatie geen directe, mechanistisch zinvolle informatie over het ligandbindingsproces18. De concentratie-responsrelatie voor ligandbinding hangt niet alleen af van de intrinsieke bindingsaffiniteit, maar ook van de conformatieverandering veroorzaakt door ligandbinding en de inherente neiging van de receptor om conformatie te veranderen in afwezigheid van ligand. Om de processen die ligand-receptorinteracties onderstrepen beter te begrijpen, kunnen bindingsmetingen worden gecombineerd met experimenten die een uitlezing van de eiwitfunctie bieden. Hiertoe zijn ionkanalen een ideaal modelsysteem, omdat hun stromen kunnen worden gemeten met sub-ms tijdresolutie tot op het niveau van één molecuul met behulp van spanningsklem. Historisch gezien hebben gepaarde stroom- en fluorescentiemetingen belangrijke inzichten opgeleverd in het openen en sluiten (gating) van spannings- en ligand-gated ionkanalen 19,20,21. Er zijn experimenten uitgevoerd om tegelijkertijd ionische stromen en fluorescerende cyclische nucleotidebinding aan verschillende cyclische nucleotide-gereguleerde kanalente meten 22,23,24. Deze studies gebruikten een ligand dat de kwantumopbrengst bij binding verhoogde. Fluorescentie van ongebonden ligand in het volume van de oplossing in de buurt van de pleister kan worden afgetrokken door de pleisters in beeld te brengen met behulp van confocale microscopie22,23. In onze studies werd de binding gemeten met behulp van de reductie in ANAP-fluorescentie. Omdat dit signaal specifiek is voor het kanaal en FRET tussen ANAP en TNP-ATP sterk afstandsafhankelijk is (half maximaal bij ~43 Å), werd besmetting van ons signaal door niet-specifiek gebonden en ongebonden nucleotiden vermeden.
Figuur 4A toont een typisch patch-clamp fluorometrie (PCF) experiment. Een hoge weerstand (GΩ) afdichting werd gevormd tussen een met zoutoplossing gevulde borosilicaatglazen pipet (aangesloten op een spanningsklemversterker) en een cel die ANAP-gelabelde KATP tot expressie brengt. Na de vorming van de afdichting werd de pipet weggetrokken van de cel, waardoor toegang tot de intracellulaire nucleotidebindingsplaatsen mogelijk werd. De pipet werd vervolgens over het microscoopobjectief geplaatst, gecentreerd op de spleet van het spectrometermasker en de uitstroom van het microvolumeperfusiesysteem (gemodificeerd met een borosilicaatglazen punt) werd dicht bij de pipet gebracht (figuur 4D). De spanning werd geregeld en de stromen werden gemeten van de kanalen in de patch. Representatieve stromen en spectra van ANAP-gelabelde KATP-kanalen worden weergegeven in figuur 4B, kleurgecodeerd om de spectra aan te passen aan de stromen. Emissiespectra werden gecorrigeerd voor achtergrond en bleken als voor niet-overdekte membranen.
Figuur 1: ANAP en TNP-ATP vormen een geschikt FRET-paar. a) Structuren van ANAP en TNP-ATP. De fluorescerende moieties worden uitgelicht. (B) Absorptie- en fluorescentie-emissiespectra van ANAP en TNP-ATP. Overlap tussen ANAP-emissie en TNP-ATP-absorptie is vereist voor FRET. Aangepast van Puljung et al. (gepubliceerd onder de Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Meten van nucleotidebinding in niet-overdekte plasmamembranen. (A) Schema voor de bereiding van niet-geroofde plasmamembranen uit aanhangende cellen die een fluorescerend membraaneiwit tot expressie brengen. Er worden instructies gegeven voor cellen die zijn gekweekt op poly-L-lysine-gecoate of onbehandelde afdekstroken. (B) Experimentele opstelling voor het meten van nucleotidebinding in niet-overdekte membranen. (C) Heldere veld- en fluorescerende beelden van een volledig onbedekt plasmamembraan afgeleid van een cel die oranje fluorescerend eiwit (OFP) tot expressie brengt, gelabelde KATP-kanalen. Het sterretje markeert de positie van het membraan, dat bijna onzichtbaar is in het heldere veldbeeld. OFP werd enthousiast met een brede 565 nm LED door een 531/40 nm band-pass filter en 562 nm rand dichroic en uitgestraald licht werd opgevangen door een 593/40 nm band-pass filter. (D) Helder veld en fluorescerende beelden van een gedeeltelijk niet-gedekt membraanfragment afgeleid van een cel die oranje fluorescerend eiwit (OFP) tot expressie brengt, gelabelde KATP-kanalen. (E) Oplossingsuitwisselingstijdverloop verkregen met behulp van de in B beschreven installatie. Er worden vijf technische replica's weergegeven. Het microvolumeperfusiesysteem werd geladen met 50 μM tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM). Het bad was doordrenkt met water met een snelheid van ~ 0,5 ml / min. Gegevens van de wash-on (toenemende fluorescentie) en wash-out (afnemende fluorescentie) tijdsverloop waren geschikt voor een enkel exponentieel verval van de vorm F = A*exp(-x/τ) + y0. De tijdconstante (τ) voor wash-in was ~0,6 s. De tijdconstante voor wash-out was ~1,0 s. TMRM werd geëxciteerd met een brede 565 nm LED door een 540/25 nm band-pass filter en 565 nm edge dichroic en uitgestraald licht werd opgevangen door een 605/55 nm band-pass filter. F) Vergelijking van de fluorescentie-intensiteit van een 50 μM-oplossing van TMRM toegepast met behulp van het microvolumeperfusiesysteem zoals in B en een stilstaand bad met 50 μM TMRM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Achtergrondaftrek en bleekcorrectie. (A) Spectraal beeld (ruimtelijke informatie in de y-dimensie, golflengte in de x-dimensie) van een niet-gedekt plasmamembraan van een cel die ANAP-gelabelde KATP-kanalen tot expressie brengt. 5 μM TNP-ATP werd toegepast met behulp van de opstelling beschreven in figuur 2B. De oranje doos geeft het interessegebied (ROI) aan, overeenkomend met het niet-overdekte membraan. Het grijze vak geeft het achtergrondgebied aan dat wordt gebruikt voor het corrigeren van het spectrum. (B) Emissiespectra afgeleid van golflengte-voor-golflengtegemiddelden van de ROI en achtergrondgebieden in A. (C) Spectrum afgeleid door het gemiddelde achtergrondspectrum af te trekken van het gemiddelde ROI-spectrum in B. Het venster van 5 nm rond de ANAP-piek dat wordt gebruikt om de gemiddelde intensiteit te bepalen, wordt weergegeven als een grijs gearceerd gebied. (D) Spectra verkregen uit zes opeenvolgende 10-s blootstellingen van een niet-geroofd plasmamembraan van een cel die ANAP-gelabelde KATP-kanalen tot expressie brengt. Let op de afname van fluorescentie als gevolg van fotobleaching. De inzet toont de genormaliseerde piekfluorescentie fit met een enkel exponentieel verval van de vorm F/Fmax = A*exp(-t/τ) + (1-A). De symbolen in de inzet zijn kleurgecodeerd om overeen te komen met de spectra. (E) Dezelfde spectra als in D gecorrigeerd voor fotobleaching. De inzet toont de genormaliseerde piekfluorescentie van D als open cirkels, waarbij de gecorrigeerde piekfluorescentie wordt weergegeven met behulp van gevulde cirkels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gelijktijdige metingen van nucleotidebinding en kanaalstromen met behulp van patch-clamp fluorometrie (PCF). (A) Schema met de experimentele opstelling voor het meten van nucleotidebinding en ionische stromen. (B) Voorbeeldstromen (links) en spectra (rechts) verkregen uit een membraanvlek die is weggesneden uit een cel die ANAP-gelabelde KATP-kanalen tot expressie brengt. Stromen werden geregistreerd met een houdpotentiaal van -60 mV, gedigitaliseerd bij 20 kHz en gefilterd bij 5 kHz. Het grijs gearceerde gebied komt overeen met het golflengtebereik waaruit de ANAP-intensiteit werd gekwantificeerd. Aangepast van Usher et al. (gepubliceerd onder de Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. (C) Spectrum verkregen uit een membraanpleister die is weggesneden uit een cel die ANAP-gelabelde K ATP-kanalen tot expressie brengt die zijn blootgesteld aan 1 mM TNP-ATP. Let op de negatieve piek die overeenkomt met het golflengtebereik waarover TNP-ATP-fluorescentie wordt waargenomen. Het grijs gearceerde gebied geeft het golflengtebereik aan dat wordt gebruikt om ANAP-fluorescentie te kwantificeren, zoals in B. Aangepast van Usher et al. (gepubliceerd onder de Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. (D) Helder veld en fluorescerende beelden van een patchpipet blootgesteld aan 1 mM TNP-ATP. Het sterretje markeert de punt van de pipet. (E) Spectrale afbeelding van dezelfde patchpipet in 1 mM TNP-ATP. Het sterretje markeert de positie van de pipet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: TNP-ATP-binding aan ANAP-gelabelde KATP-kanalen. (A) Spectrale beelden van een niet-geroofd plasmamembraan van een cel die ANAP-gelabelde K ATP-kanalen tot expressie brengt in afwezigheid van TNP-ATP of in de aanwezigheid van 50 μM of 1 mM TNP-ATP. Intensiteiten worden weergegeven als een heatmap. (B) Golflengte-per-golflengte-gemiddelde spectra van de beelden in A die het blussen van ANAP-fluorescentie door TNP-ATP laten zien. De gearceerde gebieden vertegenwoordigen twee verschillende banddoorlaatfilters die kunnen worden gebruikt om ANAP-blussing te meten als er geen spectrometer beschikbaar is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Uitdoven van ANAP-gelabelde K ATP-kanalen doorTNP-ATP in niet-overdekte membranen en PCF. Overlay van gegevens van Usher et al. (gepubliceerd onder de Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. De gegevens pasten in de Hill-vergelijking: F / F max = E max + (1 – E max) / (1+10(EC50 –[TNP-ATP])*h). F is de gemeten fluorescentie, F max is de maximale fluorescentie bij afwezigheid van nucleotide, Emax is de maximale blussing bij verzadigende nucleotideconcentraties en h is de Hill-helling. EC50, (de nucleotideconcentratie waarbij de doving half maximaal is) en [TNP-ATP] zijn logwaarden. Niet-overdekte membranen: EC50 = -4,59 (25,7 μM), h = 0,82, Emax = 0,93. PCF: EC50 = -4,11 (77,6 μM), h = 0,87, Emax = 1,00. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
We hebben een methode ontwikkeld om adeninenucleotidebinding in real time te meten aan intacte membraaneiwitten. Onze methode bouwt voort op verschillende andere gevestigde technieken, waaronder het labelen van eiwitten met ANAP met behulp van amber stop codononderdrukking 12, celontsluiting 14 en spanningsklemfluorometrie / PCF 19,20,21,22,23,24,25 . De synthese van deze benaderingen maakt het mogelijk om nucleotidebinding met hoge ruimtelijke en temporele resolutie te meten. Inderdaad, in ons vorige werk waren we in staat om onderscheid te maken tussen verschillende bindingsplaatsen op hetzelfde eiwitcomplex met behulp van deze benadering10,11. Belangrijk is dat deze techniek direct kan worden toegepast op kleine hoeveelheden eiwit in een cellulaire omgeving onder omstandigheden die de eiwitfunctie behouden. Door onze bindingsmethode te gebruiken in combinatie met directe, elektrofysiologische uitlezing van ionkanaalstromen kunnen we rijke inzichten verkrijgen in de moleculaire onderbouwing van channel gating11.
Omdat spectrometers een niet-standaard laboratoriumapparaat zijn, kan de ANAP-intensiteit ook in relatieve isolatie worden bewaakt met behulp van banddoorlaatfilters. Figuur 5B toont de spectrale eigenschappen van twee van dergelijke filters. Het 470/10 nm band-pass filter schermt effectief het fluorescentiesignaal van TNP-ATP af en overlapt goed met de piek ANAP-fluorescentie. De piektransmissie van dit filter is echter slechts ongeveer 50%, wat het moeilijk kan maken om goede signalen te verkrijgen van dimmembranen (of in weggesneden membraanvlekken onder spanningsklem). Een andere optie is een 460/60 nm band-pass filter. Er is iets meer overlap tussen het 460/60 nm filter en de voet van de TNP-ATP emissiepiek in vergelijking met het 470/10 nm filter. De 460/60 nm-bandpas heeft echter een transmissie van 90-95% over een breed bereik van de ANAP-piek, waarvan zou worden verwacht dat het het fluorescentie-emissiesignaal zal versterken.
ANAP is een milieugevoelige fluorofoor 12,26,27. De piekemissie en kwantumopbrengst variëren afhankelijk van de plaats van opname op het eiwit van belang en kunnen veranderen als het eiwit van conformatie verandert. Dergelijke veranderingen zouden onmiddellijk duidelijk zijn uit emissiespectra, maar zouden niet zo duidelijk zijn wanneer de ANAP-intensiteit wordt gemeten met behulp van filters. In ieder geval zijn passende controles vereist om aan te tonen dat het fluorescentiesignaal niet varieert als gevolg van veranderingen in de lokale omgeving rond ANAP na de nucleotidebinding. Controle-experimenten met niet-gelabelde nucleotiden kunnen helpen verifiëren dat eventuele veranderingen in ANAP-intensiteit het gevolg zijn van FRET tussen ANAP- en TNP-nucleotiden. TNP-nucleotiden kunnen niet-specifiek binden aan de membranen afkomstig van niet-getransfecteerde cellen (hetzij aan het plasmamembraan of aan inheemse membraaneiwitten)10. We kwantificeren binding als een afname in de donorfluorescentie, omdat dit signaal specifiek is voor het gelabelde kanaal. We raden echter aan om aanvullende controle-experimenten uit te voeren voor elk agonist/receptorpaar, bijvoorbeeld het muteren van de nucleotidebindingsplaats indien bekend, om te verifiëren dat de verandering in donorfluorescentie echt het resultaat is van directe binding aan de gelabelde receptor11. Ten slotte wordt aanbevolen om te werken met constructies die naast het ANAP-label ook een fluorescerend eiwitlabel bevatten. Dit helpt om gelabelde receptorfluorescentie te onderscheiden van achtergrond / autofluorescentie. Achtergrondfluorescentie kan van ANAP worden onderscheiden door de piek en vorm van emissiespectra10, maar dergelijke bepalingen kunnen erg moeilijk zijn wanneer alleen filtersets worden gebruikt. Bovendien kunnen cellen en niet-gedekte membranen die fluorescerende receptoren tot expressie brengen, worden geïdentificeerd met behulp van de fluorescerende eiwittag zonder ANAP te hoeven prikkelen en overmatig fotobleken te riskeren.
In veel van onze PCF-records zagen we een sterke negatieve piek in onze spectra bij hoge TNP-ATP-concentraties (figuur 4C). Deze negatieve piek is een artefact van ons achtergrondaftrekkingsprotocol. Figuur 4D toont heldere veld- en fluorescerende beelden van een patchpipet blootgesteld aan 1 mM TNP-ATP. Een schaduw aan de pipetpunt is duidelijk als gevolg van de uitsluiting van TNP-ATP van het volume van de pipetwanden, wat het duidelijkst zichtbaar is binnen het scherpstelvlak. De spectrale afbeelding in figuur 4E toont een donkere band, die overeenkomt met deze schaduw. Wanneer een gebied boven of onder deze donkere band wordt gebruikt voor achtergrondaftrek, produceert dit een negatieve piek. Belangrijk is dat deze piek plaatsvond over een golflengtebereik dat overeenkomt met TNP-ATP-emissie en geen invloed had op onze metingen van ANAP-blussing.
De belangrijkste beperking van onze experimenten was het verkrijgen van adequate plasmamembraanexpressie van ANAP-gelabelde constructies om fluorescentie te meten. Het was over het algemeen gemakkelijker om spectra van hoge kwaliteit te verkrijgen van niet-overdekte membranen dan in PCF, vanwege hun grotere formaat en ons vermogen om snel een hele schaal met niet-overdekte membranen te scannen, in tegenstelling tot PCF waar patches slechts één voor één kunnen worden verkregen. In onze experimenten waren de gegevens van niet-overdekte membranen en PCF-experimenten vergelijkbaar, maar niet gelijkwaardig (figuur 6)11. Er is echter geen a priori reden waarom dit een universele waarneming zou moeten zijn, aangezien eiwitten in een patchpipet zich in een andere functionele toestand kunnen bevinden dan die in niet-overdekte membranen.
Hier zijn pogingen gedaan om de expressie van onze ANAP-gelabelde constructies te maximaliseren, met name het verlagen van de celkweektemperatuur tot 33 °C10,11,16. In onze ervaring resulteerde het proberen te identificeren van plaatsen in het eiwit waar ANAP een conservatieve substitutie zou zijn, niet consequent in constructies die goed tot expressie kwamen. We hadden meer succes met het systematisch scannen van hele eiwitgebieden voor ANAP-opnameplaatsen en het screenen van kandidaten op oppervlakte-expressie10. Het ANAP-etiketteringssysteem werkt ook in Xenopus laevis-eicellen, waardoor veel grotere membraanpleisters kunnen worden weggesneden, waardoor het signaal naar ruis 26,27,28 toeneemt.
Terwijl grotere expressieniveaus naar verwachting zullen resulteren in helderdere signalen, hangt het minimale aantal kanalen dat nodig is om fluorescentie te meten af van verschillende factoren, waaronder de helderheid van de fluorofoor, de mate van fotobleaching, de intensiteit van het excitatielicht en het focusvlak. In theorie kunnen schattingen worden gemaakt door de fluorescentie-intensiteit en de kanaalstroom te correleren, zoals eerder is aangetoond28,29. De betrouwbaarheid van dergelijke schattingen vereist echter enige kennis van de eenkanaalsgeleiding en de open waarschijnlijkheid van het kanaal. Naast de hierboven genoemde factoren zal het fluorescentiesignaal ook worden beïnvloed door kanalen die verband houden met blaasjes of delen van het plasmamembraan die aan het pipetglas zijn geplakt en die niet onder spanningsklem staan.
Deze methode is gemakkelijk aan te passen aan de studie van andere nucleotidegevoelige ionkanalen. CFTR is structureel vergelijkbaar met de accessoire sulfonylureumreceptorsubeenheid van KATP30,31. Net als KATP CFTR wordt gating gecontroleerd door nucleotidebinding, waardoor het een voor de hand liggend toekomstig doelwit is van onze methode7. Purinerge P2X-receptoren zijn ionkanalen die worden afgesloten door extracellulaire ATP9. TNP-ATP werkt als een antagonist voor P2X-receptoren32,33. Daarom zal het niet nuttig zijn voor het bestuderen van P2X-activering, hoewel het kan worden gebruikt in competitietests met P2X-agonisten. Als alternatief kunnen andere fluorescerende ATP-derivaten met voldoende spectrale overlap met ANAP-emissie worden gebruikt om activering te bestuderen. Alexa-647-ATP is een fluorescerende P2X-agonist34. De berekende R0 tussen Alexa-647 en ANAP is ~85 Å, wat betekent dat directe binding aan P2X zou moeten resulteren in een aanzienlijke uitdoven van ANAP die in het kanaal is opgenomen. Zo'n lange R0 zal echter ook resulteren in het uitdoven van Alexa-647-ATP gebonden aan naburige subeenheden en verhoogt de kans dat niet-specifieke nucleotidebinding zal resulteren in FRET. Omdat de ligandbindingsplaats in P2X-receptoren extracellulair is, zouden bindingsmetingen worden uitgevoerd op intacte cellen, in spanningsklemmen van de hele cel of in buitenste membraanpleisters. Onze methode kan ook worden uitgebreid met het bestuderen van binding en activering van elektrogene en niet-elektrogene transporters en pompen die afhankelijk zijn van ATP voor hun reactiecyclus, evenals G-eiwit gekoppelde P2Y-receptoren. Ten slotte, hoewel we deze methode hebben ontwikkeld om adenine-nucleotidebinding (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP) te meten, kan dezelfde benadering worden gebruikt om binding te bestuderen aan vrijwel elke receptor waarvoor een geschikte, fluorescerende ligand is geïdentificeerd.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We willen Raul Terron Exposito bedanken voor de uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/R002517/1; MCP en FMA) en de Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T75 tissue-culture treated flask | StarLab | CC7682-4875 | |
| 0.1% w/v poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 30 mm borosilicate cover glass slips | VWR | 631-0174 | |
| 35 mm non-treated sterile dishes | CytoOne | CC7672-3340 | |
| 35 mm cover glass bottom dish | WPI | FD35-PDL-100 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 31966021 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| TrypLE select (tryosin) | Gibco | 12563-011 | Trypsin/EDTA reagent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14040-091 | |
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-035 | |
| HEK293T cells | ATTC | CRL-3216 | Used between passages 5-30 |
| ANAP-TFA | AsisChem | ASIS-0014 | Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM |
| pANAP expression plasmid | Addgene | Plasmid #48696 | Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein |
| peRF1-E55D | Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) | Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 | Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio | MIR 2300 | Lipopolyplex transfection reagent |
| Thick-walled borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-15 | |
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide | Sigma-Aldrich | 94506 | |
| TNP-ATP | Jena Bioscience | NU-221L | Delivered at 10 mM in water |
| Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope | Nikon | ||
| 60x water immersion objective (1.4 NA) | Nikon | MRD07602 | |
| 4-Wavelength High-Power LED Head | ThorLabs | LED4D245 | 385/490/565/625 nm LEDs |
| Four-Channel LED Driver | ThorLabs | DC4100 | |
| 390/18 nm band-pass excitation filter | ThorLabs | MF390-18 | For ANAP excitation |
| 400 nm long-pass emission filter | ThorLabs | FEL0400 | For imaging ANAP spectra |
| 416 nm edge dichroic | ThorLabs | MD416 | For imaging ANAP spectra |
| 460/60 nm band-pass emission filter | ThorLabs | MF460-60 | Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
| 470/10 nm band-pass emission filter | ThorLabs | FB470-10 | Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
| 531/40 band-pass excitation filter | Brightline | FF01-531/40-25 | For orange fluorescent protein (OFP) excitation |
| 540/25 nm band-pass excitation filter | Chroma | D540/25X | For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation |
| 562 nm edge dichroic | Semrock | FF562-Di03 | For imaging OFP fluorescence |
| 565 nm edge dichroic | Chroma | 565DC | For imaging TMRM fluorescence |
| 593/40 nm band-pass excitation filter | Brightline | FF01-387/11-25 | For imaging OFP fluorescence |
| 605/55 nm band-pass emission filter | Chroma | D605/55M | For imaging TMRM fluorescence |
| IsoPlane-160 Imaging Spectrometer | Princeton Instruments | IsoPlane-160 | |
| PIXIS 400BR_eXcelon Camera | Princeton Instruments | PIXIS: 400BR_eXcelon | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B-2 | |
| Digidata 1440A digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Probe sonicator | Sonics & Materials | VC-50 | For unroofing |
| REGLO digital peristaltic pump | Ismatec | ISM 832 | For bath perfusion |
| Microvolume perfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA μFlow-8 | For TNP-ATP perfusion |
| pClamp 10.6.2 | Molecular Devices | Recording and analysing currents | |
| Lightfield 5.20.1507 | Princeton Instruments | Acquisition software for images and spectra | |
| Matlab | Mathworks | For data analysis | |
| Python 3.8.1 | Python Software Foundation | For data analysis |
References
- Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. Ion channels find a pathway for therapeutic success. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Higgins, C. F., Linton, K. J. The ATP switch model for ABC transporters. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).
- Toyoshima, C., Cornelius, F. New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).
- Craven, K. B., Zagotta, W. N. CNG and HCN channels: two peas, one pod. Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).
- Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).
- Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model. Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).
- Burnstock, G. Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).
- Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding. Elife. 8, 41103 (2019).
- Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry. Elife. 9, 52775 (2020).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane. Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).
- Heuser, J. The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy. Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).
- Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
- Lin, C. Y., et al. Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature. PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).
- Usukura, J., et al. Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions. Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).
- Colquhoun, D. Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors. British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
- Zheng, J., Zagotta, W. N. Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels. Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).
- Biskup, C., et al. Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels. Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).
- Kusch, J., et al. Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels. Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).
- Wu, S., et al. State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry. Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Kalstrup, T., Blunck, R. S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).
- Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).
- Liu, C., et al. Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance. Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).
- Hwang, T. C., et al. Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction. Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).
- Puljung, M. C. Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels. Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).
- Kasuya, G., et al. Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel. Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).
- Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors. Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).
- Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).
