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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Mesure de la liaison des nucléotides aux protéines membranaires fonctionnelles intactes en temps réel

Published: March 11, 2021 doi: 10.3791/61401
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Department of Chemistry and Neuroscience Program, Trinity College

Summary

Ce protocole présente une méthode de mesure de la liaison des nucléotides adénine aux récepteurs en temps réel dans un environnement cellulaire. La liaison est mesurée par le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) entre les dérivés nucléotidiques du trinitrophényle et la protéine marquée avec un acide aminé fluorescent non canonique.

Abstract

Nous avons développé une méthode pour mesurer la liaison des nucléotides adénine à des récepteurs transmembranaires fonctionnels intacts dans un environnement cellulaire ou membranaire. Cette méthode combine l’expression de protéines marquées avec l’acide aminé fluorescent non canonique ANAP, et FRET entre ANAP et des dérivés nucléotidiques fluorescents (trinitrophényles). Nous présentons des exemples de liaison nucléotidique à des canaux ioniques KATP marqués ANAP mesurés dans des membranes plasmiques non couvertes et des plaques de membrane excisées à l’envers sous pince de tension. Ce dernier permet des mesures simultanées de la liaison au ligand et du courant de canal, une lecture directe de la fonction protéique. Le traitement et l’analyse des données font l’objet de discussions approfondies, ainsi que des pièges et des artefacts potentiels. Cette méthode fournit de riches informations mécanistes sur le contrôle dépendant du ligand des canaux KATP et peut facilement être adaptée à l’étude d’autres protéines régulées par les nucléotides ou de tout récepteur pour lequel un ligand fluorescent approprié peut être identifié.

Introduction

Plusieurs classes importantes de protéines sont directement régulées par la liaison au ligand. Celles-ci vont des enzymes solubles aux protéines intégrées dans la membrane, y compris les récepteurs tyrosine kinases, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et les canaux ioniques. Les RCPG et les canaux représentent respectivement ~34% et ~15% de toutes les cibles médicamenteuses actuelles, respectivement 1,2. Par conséquent, il existe un intérêt biochimique et médical considérable dans le développement de méthodes qui fournissent des informations mécanistes sur les interactions ligand-récepteur. Les méthodes traditionnelles de mesure de la liaison aux ligands, y compris le marquage par photoaffinité et les études de liaison aux radioligands, nécessitent de grandes quantités de protéines partiellement purifiées et sont généralement réalisées dans des conditions et des échelles de temps non physiologiques. Une méthode idéale ne nécessiterait que de petites quantités de protéines, pourrait être réalisée sur des protéines intactes exprimées dans un environnement cellulaire ou membranaire, pourrait être surveillée en temps réel et serait compatible avec les lectures directes de la fonction protéique.

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est une méthode qui détecte la proximité entre deux molécules marquées par fluorescence3. Le FRET se produit lorsqu’un fluorophore donneur excité transfère de l’énergie de manière non radiative à une molécule acceptrice (généralement un autre fluorophore). Le transfert d’énergie entraîne une extinction de l’émission de fluorescence du donneur et une sensibilisation de l’émission accepteur (si l’accepteur est un fluorophore). L’efficacité du transfert dépend de la6ème puissance de la distance entre le donneur et l’accepteur. De plus, le donneur et l’accepteur doivent être à proximité (généralement moins de 10 nm) pour que le FRET se produise. En tant que tel, FRET peut être exploité pour mesurer la liaison directe entre un récepteur protéique marqué par fluorescence et un ligand fluorescent.

Plusieurs protéines différentes sont régulées ou activées en liant des nucléotides adénine intracellulaires ou extracellulaires (ATP, ADP, AMP, cAMP). De nombreuses protéines transporteuses nécessitent une hydrolyse de l’ATP pour leur cycle de réaction, y compris les transporteurs de cassettes liant l’ATP et les ATPases de type P comme la pompe Na+/K+ 4,5. Les canaux K+ sensibles à l’ATP (KATP), le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) et les canaux régulés par les nucléotides cycliques sont tous des canaux ioniques qui sont fermés par la liaison des nucléotides adénine intracellulaires, ce qui les rend extrêmement sensibles aux changements dans le métabolisme cellulaire et la transduction du signal 6,7,8. Les récepteurs P2X et P2Y purinergiques répondent aux changements dans l’ATP extracellulaire, qui peut être libéré en tant que neurotransmetteur ou à la suite de lésions tissulaires9. Nous avons développé un test basé sur FRET pour la mesure de la liaison des nucléotides adénine aux protéines membranaires en temps réel. Nous avons précédemment appliqué cette méthode pour étudier la liaison des nucléotides aux canaux KATP 10,11.

Pour mesurer la liaison nucléotidique via FRET, une protéine d’intérêt doit d’abord être marquée avec un fluorophore. L’étiquette fluorescente doit être insérée spécifiquement dans la protéine d’intérêt de manière à ce qu’elle soit suffisamment proche du site de liaison du ligand pour que FRET se produise, en prenant soin de s’assurer que la marque n’affecte pas la structure et la fonction globales de la protéine. Pour ce faire, nous utilisons une technique développée par Chatterjee et al., utilisant la suppression du codon stop ambre pour insérer un acide aminé fluorescent non canonique (l-3-(6-acétylnaphtalène-2-ylamino)-2-aminopropionique; ANAP) sur le site souhaité12. Nous mesurons la liaison nucléotidique sous forme de FRET entre la protéine marquée par l’ANAP et les dérivés nucléotidiques fluorescents du trinitrophényle (TNP) (Figure 1A). Le spectre d’émission de l’ANAP chevauche le spectre d’absorbance des nucléotides TNP, condition nécessaire à la réalisation du FRET (figure 1B). Nous décrivons ici deux types différents d’expériences de liaison. Dans le premier, la liaison nucléotidique au côté intracellulaire des canauxK ATP marqués par ANAP est mesurée dans des cellules qui ont été découvertes par sonication laissant des fragments adhérents de membrane plasmique sur un couvercle en verre10,11,13,14.

Dans la deuxième méthode, la liaison des nucléotides aux canaux KATP marqués par ANAP est mesurée dans un patch membranaire sous pince de tension, permettant la mesure simultanée des courants ioniques et de la fluorescence. En combinant ces deux approches expérimentales, les changements de liaison peuvent être directement corrélés avec les changements de la fonction du canal11. Les résultats typiques, les pièges potentiels et l’analyse des données sont discutés.

Protocol

1. Préparation des bordereaux de couverture

NOTE: Ces étapes doivent avoir lieu dans une houlette de culture tissulaire stérile. Des quantités sont données pour la préparation de 10 plats.

  1. Placer dix verres de recouvert borosilicaté autoclavé de 30 mm individuellement dans dix plats stériles non traités de 35 mm et rincer une fois avec 2 ml d’eau distillée stérile.
  2. Diluer 1 mL de solution de poly-L-lysine à 0,1 % p/v dans de l’eau distillée stérile jusqu’à obtenir un volume total de 10 mL (concentration finale de 0,01 % p/v). Bien mélanger, puis pipeter 1 mL sur chaque lamelle de couvercle et incuber à température ambiante pendant 20 min.
  3. Aspirer la poly-L-lysine et laver chaque couvercle deux fois avec au moins 2 ml d’eau distillée stérile. Laisser complètement sec, c’est-à-dire au moins 3 h.

2. Ensemencement des cellules HEK-293T

NOTE: Ces étapes doivent avoir lieu dans un capuchon de culture tissulaire. Les cellules HEK-293T ont été choisies pour leur faible courant de fond et leur facilité de culture en culture. Ce protocole peut être adapté à d’autres types de cellules.

  1. Rincer une fiole T75 confluente à 80-90% de cellules HEK-293T une fois avec 12 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant d’incuber avec 2 ml de trypsine pendant 2-5 minutes, ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement détachées et presque complètement dissociées.
  2. Remettez les cellules en suspension en ajoutant 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complétés par 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Pipeter doucement contre le fond de la fiole pour briser les touffes de cellules restantes.
  3. Ajouter 2 mL de DMEM supplémenté au nombre désiré de boîtes de 35 mm contenant des couvercles enduits. Ajouter 100 μL de cellules en suspension dans chaque boîte. Incuber pendant une nuit à 37 °C.

3. Transfection

NOTE: Ces étapes doivent avoir lieu dans un capuchon de culture tissulaire. Des quantités sont données pour la transfection de 10 plats. Pour l’incorporation d’ANAP propre au site, le codon d’ADN à la position prévue pour l’étiquetage doit être remplacé par le codon stop ambre (TAG). Cette construction est co-transfectée avec deux plasmides : pANAP et peRF1-E55D12,15. pANAP code plusieurs copies d’une paire ARNt/ARNt synthétase spécifique à l’ANAP. En présence d’ANAP, la transfection de ce plasmide produit un ARNt chargé d’ANAP qui reconnaît le codon stop ambre. peRF1-E55D code pour un facteur de libération ribosomique négatif dominant qui augmente le rendement de la protéine complète marquée par ANAP.

  1. Préparer un tube de 1,5 mL contenant 10 μg de pANAP, 10 μg de peRF1-E55D et de l’ADN pour la construction destinée à être marquée avec ANAP. Porter à un volume final de 500 μL avec du DMEM non supplémenté.
  2. Dans un tube séparé, préparer 3 μL de réactif de transfection à base de lipides (voir le tableau des matériaux) pour chaque 1 μg d’ADN et porter à un volume final de 500 μL avec du DMEM non supplémenté.
  3. Combiner les mélanges d’ADN et de réactifs de transfection dans un seul tube et incuber pendant 20 min à température ambiante.
  4. Ajouter 400 μL du stock ANAP de 1 mM (sel de trifluoroacétate dans 30 mM de NaOH) à 20 mL de DMEM supplémenté pour une concentration finale de 20 μM d’ANAP. Remplacez l’ancien média des cellules plaquées par 2 mL de média contenant du PANI par boîte.
  5. Pipeter 10% du mélange de transfection d’ADN sur chaque boîte. Incuber à 33 °C pendant 2 à 4 jours avant les expériences. L’incubation à 33 °C ralentit la division cellulaire et augmente le rendement en protéines par cellule16.

4. Expériences sur les membranes sans toit

  1. Utilisez une paire de pinces pour briser un couvercle avec des cellules transfectées en fragments plus petits.
  2. Suivez l’une des procédures ci-dessous pour déverrouiller les cellules.
    1. Si vous utilisez des bordereaux de couverture préenduits, rincez un fragment avec du PBS, puis placez-le au fond d’un plat de 35 mm contenant 2 ml de PBS. Sonicer brièvement à l’aide d’un sonicateur de sonde (50 W, amplitude de 20 % à 40 %, sonde de 3 mm) placé à 3-5 mm au-dessus de l’échantillon pour déboucher les cellules et laisser derrière eux des fragments de membrane plasmique adhérents (Figure 2A,C).
      REMARQUE: La puissance, la durée et la hauteur de la sonde du sonicateur au-dessus de l’échantillon peuvent toutes être modifiées pour obtenir un rendement élevé de membranes non couvertes sans dénuder complètement la lamelle de couverture.
    2. Si vous n’utilisez pas de lamelles de couverture pré-revêtues, rincez un fragment de glissement de couvercle avec du PBS, puis plongez dans un tube contenant 0,1% p/v de poly-L-lysine pendant ~30 s avant de sonifier brièvement (comme à l’étape 4.2.1) pour déboucher les cellules du toit et laisser derrière eux des fragments de membrane plasmique non couverts / partiellement non couverts (Figure 2A, C, D). Il a été démontré que de brèves expositions à la poly-L-lysine améliorent l’adhérence à la lamellede couverture 13.
  3. Placer le fragment soniqué dans une antenne de 35 mm à fond de verre contenant 2 ml de solution de bain et monter sur un microscope inversé équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau à haute NA et 60x. Le port de caméra du microscope est connecté à un spectrographe en série avec une caméra CCD haute sensibilité. Perfuser la chambre du bain (0,5 – 1 mL/min) avec un tampon à l’aide d’une pompe péristaltique. La composition du tampon variera en fonction de la protéine étudiée.
    REMARQUE: Si l’utilisateur n’a pas accès à un objectif avec une longue distance de travail, il peut être impossible de se concentrer sur les fragments de membrane non couverts en raison de la hauteur supplémentaire de la glissière de couverture. Une alternative consiste à ensemencer les cellules directement sur des boîtes avec un fond en verre poly-L-lysine (voir le tableau des matériaux pour un exemple). Cela réduira également les aberrations potentielles dans l’image associées à la mise au point à travers deux morceaux de verre. Ces aberrations n’affectent pas la forme des spectres acquis.
  4. Identifier les fragments de membrane non couverts exprimant le canal marqué ANAP en recherchant la fluorescence du canal (Figure 2C,D).
    REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser une étiquette fluorescente supplémentaire (où le spectre d’émission se distingue du spectre d’émission du PANA) pour aider à identifier les membranes non couvertes contenant la protéine d’intérêt. Les expériences de la figure 2C,D ont été réalisées sur des canaux marqués ANAP avec des marqueurs de protéines fluorescentes C-terminal.
  5. Engagez partiellement le masque du spectromètre (augmentez ~10%) entre le port de la caméra sur le microscope et le spectrographe. L’ombre du masque apparaîtra sur l’image de la caméra. Alignez la membrane non couverte avec le masque du spectromètre, en ajustant l’étage du microscope. Acquérir une image de champ clair et de fluorescence de la membrane non couverte. Ceux-ci seront utilisés pour sélectionner une région d’intérêt à analyser.
  6. Rapprochez l’extrémité du système de perfusion microvolume de la membrane non couverte.
    REMARQUE: Pour réduire la fluorescence de fond, le débit sortant du système de perfusion a été remplacé par un embout personnalisé en verre borosilicate.
  7. Pour imager les spectres de fluorescence, excitez la membrane avec une LED de 385 nm à travers un filtre d’excitation passe-bande 390/18 nm et un dichroïque de bord de 416 nm. Recueillir la lumière émise à travers un filtre d’émission passe-long de 400 nm (figure 2B).
  8. Engagez le masque du spectromètre et assurez-vous que la lumière émise est traversée. Enclenchez les réseaux du spectromètre (300 rainures/mm). Une fois les réseaux en place, la lumière diffractée par le spectromètre sera projetée sur la puce de la caméra CCD pour produire des images spectrales (Figure 3A). Ces images conservent les informations spatiales dans la dimension y . La dimension x est remplacée par la longueur d’onde.
  9. Éventuellement, si la protéine d’intérêt est marquée avec une protéine fluorescente, acquérir une image spectrale de la protéine fluorescente à l’aide du jeu de filtres approprié.
  10. Prendre une ou plusieurs expositions de 0,1 à 10 s au début de l’expérience tout en perfusant une solution tampon sans nucléotides. Ceux-ci seront utilisés pour corriger et normaliser les données tout au long du reste de l’expérience (voir la section 5 ci-dessous).
    REMARQUE: Le choix du temps d’exposition dépendra du niveau d’expression atteint, de la luminosité du fluorophore et de l’optique. Le temps d’exposition doit être choisi pour maximiser le signal et minimiser le taux de blanchiment observé. La plage de temps d’exposition indiquée au point 4.10 convient aux mesures de liaison à l’équilibre, mais peut être utile pour mesurer des changements cinétiques plus lents10. La capacité d’utiliser des temps d’exposition courts pour suivre une cinétique plus rapide sera limitée par les niveaux d’expression des protéines et le photoblanchiment, plutôt que par le matériel.
  11. Appliquer une gamme de concentrations de TNP-ATP (habituellement préparé dans une solution de bain) pour établir une courbe concentration-réponse. Perfuser chaque solution pendant au moins 1 min pour s’assurer qu’un état d’équilibre est atteint et laver chaque concentration avec la solution de bain pendant au moins 1 min.
    NOTE: Il est important de s’assurer que le système de perfusion peut rapidement atteindre l’équilibre (Figure 2E) et atteindre la concentration locale correcte de TNP-ATP (Figure 2F).
  12. Prendre une exposition (de la même durée que celle utilisée à l’étape 4.10) à chaque concentration et à la fin de chaque lavage.

5. Analyse spectrale

REMARQUE: Ces instructions sont écrites pour être utilisées avec le code d’analyse « pcf.m », qui peut être trouvé sur GitHub. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. Un code supplémentaire et alternatif peut être trouvé à la https://github.com/smusher/KATP_paper_201911. Nous avons décrit ici les opérations effectuées par le logiciel afin que l’utilisateur puisse créer son propre code ou choisir d’analyser les données manuellement.

  1. Démarrez le programme d’analyse en tapant le nom du programme (« pcf ») dans la ligne de commande.
  2. Lorsqu’une boîte de dialogue d’ouverture de fichier/dossier s’ouvre avec l’invite : « Sélectionner les fichiers pour le retour sur investissement », sélectionnez les noms de fichiers associés aux images de fond clair et de fluorescence de la membrane non couverte. Une invite apparaîtra dans la ligne de commande pour taper le nom du fichier de sortie.
  3. Tapez le nom du fichier et appuyez sur Entrée.
  4. Lorsque le logiciel affiche les images de fond clair et de fluorescence, sélectionnez une région d’intérêt (ROI) dans l’image spectrale correspondant à l’emplacement du fragment de membrane non couvert ou du patch excisé (voir section 6) en suivant les invites du logiciel. Sélectionnez une région d’arrière-plan dans la même image spectrale (représentant la même gamme de longueurs d’onde que dans le ROI) correspondant à une section de couvercle ou d’antenne parabolique sans membrane attachée (Figure 3A). Le logiciel vous invitera à cliquer sur le haut du retour sur investissement et à appuyer sur Entrée, cliquez sur le bas du retour sur investissement et appuyez sur Entrée, puis répétez ce processus pour la région d’arrière-plan.
  5. Lorsqu’une boîte de dialogue d’ouverture de fichier/dossier s’ouvre avec l’invite : « Sélectionner un fichier pour le spectre FP », sélectionnez le nom de fichier associé au spectre des protéines fluorescentes (FP) (étape facultative 4.9). Si aucun spectre FP n’a été acquis, sélectionnez un autre fichier de spectre. Le spectre FP sert de contrôle de la qualité pour distinguer la protéine marquée de la fluorescence de fond.
  6. Lorsqu’une boîte de dialogue d’ouverture de fichier/dossier s’ouvre avec l’invite : « Sélectionner les fichiers pour l’analyse », sélectionnez tous les fichiers correspondant aux spectres ANAP (des étapes 4.10 à 4.12), y compris les fichiers nécessaires à la correction de l’eau de Javel.
  7. Lorsqu’une boîte de dialogue d’ouverture de fichier/dossier s’ouvre avec l’invite : « Sélectionner les fichiers pour la collecte de blanchiment », sélectionnez le sous-ensemble de fichiers de l’étape 5.6 correspondant aux spectres initiaux acquis en solution sans nucléotides au début de l’expérience ou aux spectres acquis lors des lavages dans une solution exempte de nucléotides à utiliser pour la correction (des étapes 4.10 à 4.12).
  8. Moyenne linéaire de chaque image pour produire des spectres, c’est-à-dire moyenne de l’intensité pour tous les pixels de la dimension y d’un ROI ou d’une région d’arrière-plan à chaque longueur d’onde. (figure 3B). Soustrayez le spectre de fond moyen résultant du spectre moyen acquis à partir du retour sur investissement pour éliminer la fluorescence de fond et la fluorescence du TNP-ATP non lié (Figure 3C). Ces étapes sont effectuées automatiquement par le logiciel.
  9. Déterminer l’intensité du PANA pour chaque exposition en faisant la moyenne de l’intensité d’une fenêtre de 5 nm centrée autour du pic ANAP des spectres soustraits (généralement ~470 nm, mais peut varier en fonction du microenvironnement local du résidu ANAP).
    REMARQUE : La figure 3D montre 6 spectres obtenus à partir d’expositions consécutives de 10 s d’un fragment de membrane non couvert exprimant des canaux marqués ANAP. L’encart montre l’intensité moyenne du pic de chaque spectre. Le logiciel trouvera automatiquement la longueur d’onde de crête dans le premier spectre acquis et utilisera cette valeur tout au long. L’intensité sera calculée automatiquement par le logiciel.
  10. Normaliser les intensités ANAP pour chaque expérience en divisant l’intensité ANAP d’une exposition donnée (F) par l’intensité ANAP de la première exposition dans la série chronologique, qui a été prise à l’étape 4.10 (Fmax). Encore une fois, le logiciel effectue ces calculs automatiquement.
  11. Effectuez les étapes ci-dessous pour obtenir des données.
    1. Pour corriger le photoblanchiment ANAP, ajuster d’abord une seule décroissance exponentielle, (F/Fmax) = A*exp(-t/τ)+(1-A), où t est le temps d’exposition cumulé, τ est la constante de temps et A est l’amplitude) soit aux étapes intermédiaires de lavage entre les applications de TNP-ATP, soit à plusieurs expositions initiales prises avant le lavage sur TNP-ATP (Figure 3D, encart ).
      REMARQUE: Le logiciel affichera cet ajustement et vous invitera à l’accepter ou à le rejeter. Si l’ajustement est rejeté, une autre occasion sera offerte de sélectionner les dossiers à corriger par blanchiment.
    2. Diviser les spectres ANAP normalisés (à l’étape 5.10) par la valeur prédite de l’ajustement exponentiel à partir de l’étape 5.11.1 à chaque point temporel (figure 3E).
      NOTE: Pour l’exemple montré, la fluorescence maximale normalisée observée à 50 s est de 0,65 et la fluorescence prédite de l’ajustement exponentiel est de 0,64. Pour corriger le blanchiment, divisez la valeur observée (0,65, figure 3E en médaillon, cercle vide) par la valeur prédite (0,64, figure 3E en médaillon, ligne pointillée) pour obtenir la valeur corrigée (~1, figure 3E encart de couleur). Si la correction du blanchiment est adéquate, l’intensité de l’ANAP pour toutes les expositions acquises en l’absence de nucléotides devrait être approximativement égale (figure 3E). Ces calculs sont effectués automatiquement par le logiciel.
    3. Obtenez la sortie sous la forme d’une image traçant les données et d’une feuille de calcul à onglets contenant les spectres bruts, les spectres soustraits, les spectres corrigés pour le photoblanchiment et les données de pic pour chaque fichier afin que des analyses plus approfondies puissent être effectuées.

6. Expériences de fluorométrie patch-clamp

  1. Tirer les pipettes patch des capillaires en verre borosilicaté à paroi épaisse à une résistance de 1,5 MΩ à 2,5 MΩ lorsqu’elles sont remplies d’une solution de pipette. La composition de la solution de pipette variera en fonction de la protéine étudiée.
  2. Transférer un couvercle avec des cellules transfectées sur une antenne à fond de verre de 35 mm contenant 2 ml de solution de bain et monter sur un microscope inversé équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau à haute NA et 60x. Perfuser la chambre du bain (0,5 – 1 mL/min) avec une solution de bain à l’aide d’une pompe péristaltique. Quant à la solution pour pipette, la solution de bain variera en fonction de la protéine étudiée.
  3. Identifier une cellule exprimant des canaux marqués ANAP en recherchant la fluorescence au niveau de la membrane cellulaire.
  4. Remplir une pipette patch avec une solution de pipette. Appliquez une légère pression positive sur la pipette et placez-la dans la chambre de bain. Pressez la pipette contre la membrane de la cellule et appliquez une aspiration douce pour obtenir un joint GΩ (Figure 4A).
  5. Extrayez le patch en éloignant rapidement le support de pipette de la cellule (Figure 4A).
    REMARQUE: L’excision du patch de cette manière devrait former un patch à l’envers, avec les domaines cytosoliques de la protéine exposés au système de perfusion. Si l’emplacement du site de liaison nucléotidique à l’étude n’est pas cytosolique, il sera nécessaire d’utiliser des patchs extérieurs ou des enregistrements de cellules entières pour effectuer des expériences PCF.
  6. Rapprocher l’extrémité de la pipette du patch de l’extrémité du système de perfusion et vérifier que la percutante se trouve dans la fente du masque du spectromètre (Figure 4A).
  7. Appliquer le TNP-ATP et les spectres d’image comme dans les étapes 4.10-4.12, tout en enregistrant simultanément la réponse du courant ionique à l’application de nucléotides.
    REMARQUE: Le verre de la pipette peut introduire des aberrations spatiales et des reflets dans les images acquises. Cependant, ces aberrations n’affecteront pas la forme des spectres acquis et la lumière d’excitation réfléchie est facilement séparée de la fluorescence à l’aide du spectrographe ou d’un filtre d’émission passe-long.
  8. Analysez les spectres. Les spectres imagés à partir de patchs excisés peuvent présenter une sursoustraction de la fluorescence TNP-ATP non liée en raison de l’exclusion du TNP-ATP du verre de la pipette patch (Figure 4C-E). Cette surtraction n’affecte pas le spectre d’émission ANAP et peut donc être ignorée.
    REMARQUE: Comme le signal de fluorescence dans les zones excisées sera plus faible que dans les membranes non couvertes, il est important d’utiliser un temps d’exposition qui donne un rapport signal/bruit suffisamment élevé sans blanchir l’ANAP trop rapidement.

Representative Results

La figure 2 illustre la configuration expérimentale de base pour mesurer la liaison des nucléotides aux protéines fluorescentes dans des fragments de membrane non couverts obtenus par sonication (Figure 2A,B). Deux approches différentes ont été utilisées pour obtenir des membranes non couvertes par le toit, en cultivant directement des cellules sur des lamelles de couverture recouvertes de poly-L-lysine ou en cultivant des cellules sur du verre non traité et en les exposant brièvement à la poly-L-lysine (0,1% dans l’eau) avant de déboucher. La figure 2C représente un fragment de membrane typique non couvert d’une cellule HEK-293T exprimant des canaux KATP marqués avec une protéine fluorescente orange (OFP). Les membranes non couvertes étaient pratiquement invisibles sur les images en fond clair et ont été identifiées par fluorescence de protéines membranaires marquées ou par contre-coloration avec un colorant membranaire comme l’octadécyl rhodamine B13. En plus des membranes non couvertes, la sonication des cellules HEK-293T a également produit des fragments de cellules partiellement non couverts (Figure 2D)10,17. Ces fragments étaient visibles en champ clair. Cela pourrait être le résultat de membranes plasmiques ébouriffées qui ne sont que peu adhérentes au verre de couverture. Alternativement, ces fragments peuvent contenir des vésicules et des membranes d’organites intracellulaires. En tant que tel, il est préférable d’acquérir des images uniquement à partir de « vraies » membranes non couvertes, car la protéine cible marquée associée aux membranes intracellulaires peut refléter les étapes intermédiaires du traitement et de l’assemblage post-traductionnels. La culture de cellules sur du verre revêtu de poly-L-lysine est recommandée car cela a entraîné un rendement plus élevé de « vraies » membranes non couvertes lors de la sonication.

Un système de perfusion microvolume a été appliqué aux nucléotides fluorescents afin de minimiser les quantités nécessaires dans une expérience typique (figure 2B). La pointe en verre revêtue de polyimide fournie a été remplacée par une pointe en verre borosilicaté tirée à la main dans notre installation de perfusion, ce qui a réduit le fond de fluorescence. Pour minimiser l’accumulation de nucléotides autour des membranes non couvertes imagées, toute la chambre de bain a été lentement perfusée avec un tampon. En tant que tel, nous voulions mesurer le taux de changement de solution de notre système de perfusion microvolume et vérifier que nous étions en mesure d’atteindre la concentration de ligand prévue dans notre région d’intérêt, c’est-à-dire que le ligand de notre système de perfusion n’était pas dilué directement dans le milieu de bain avant d’atteindre la membrane non couverte. Pour tenir compte de ces possibilités, on a mesuré le lavage et le lavage d’une solution de 50 μM de tétraméthylrhodamine-5-maléimide (TMRM) provenant de notre système de perfusion microvolume dirigée vers la surface d’une antenne à fond de verre perfusée avec de l’eau (Figure 2E). La cinétique d’échange de solution était reproductible et bien décrite par une seule décroissance exponentielle avec des constantes de temps inférieures à 1 s pour le lavage et le rinçage. De tels temps d’échange de solution limitent notre capacité à mesurer la cinétique de liaison et de déliaison du ligand dans notre configuration actuelle. Pour vérifier que nous avons pu atteindre la concentration de ligand souhaitée à la surface de la lamelle de couverture, nous avons comparé l’intensité de fluorescence de 50 μM TMRM délivrée à la glissière de couverture par notre système de perfusion microvolume à 50 μM TMRM dans un bain immobile (Figure 2F). Aucune différence d’intensité n’a été observée, ce qui a permis de vérifier que des concentrations de ligands appropriées à la surface de la glissière de couverture avec notre système de perfusion microvolume peuvent être atteintes, même lorsque le bain est perfusé.

La figure 3A montre une image spectrale obtenue à partir de canaux K ATP marqués ANAP dans une membrane non couverte d’une cellule HEK-239T exposée à 5 μM DE TNP-ATP. Pour obtenir de telles images, la lumière émise par la membrane non couverte a été dirigée à travers un spectromètre en série avec une caméra CCD. La fluorescence émise a été diffractée à partir des réseaux et projetée sur la puce de la caméra, produisant des spectres. Les images résultantes conservent les informations spatiales dans la dimension y, mais la dimension x a été remplacée par la longueur d’onde. La région d’intérêt (ROI), correspondant à la membrane non couverte est délimitée en orange. Deux régions de haute intensité sont évidentes dans l’image, correspondant au pic d’émission de l’ANAP et du TNP-ATP. Cela a été mieux apprécié dans le spectre moyen longueur d’onde par longueur d’onde (sur l’ensemble du retour sur investissement) illustré à la figure 3B. Le pic ~470 nm correspond à l’ANAP incorporé dans KATP ; le pic ~535 nm correspond au TNP-ATP. Pour corriger la fluorescence de fond et l’excitation directe du TNP-ATP en solution, une région d’arrière-plan (figure 3A, gris) a été sélectionnée dans chaque image. Le spectre de fond moyenné est illustré à la figure 3B. Le spectre final a été obtenu en soustrayant le spectre de fond moyen du spectre moyen du retour sur investissement (Figure 3C).

L’ANAP est sujette au photoblanchiment des artefacts. La figure 3D montre la réduction du pic de fluorescence ANAP après des expositions multiples. La fluorescence maximale de plusieurs expositions en l’absence de TNP-ATP (ou des lavages entre les concentrations de TNP-ATP) a été ajustée à une désintégration exponentielle unique et a été utilisée pour corriger les artefacts de photoblanchiment (figure 3E). Il est recommandé d’effectuer des expériences concentration-réponse à partir de concentrations de nucléotides faibles à élevées et élevées à faibles. Si la correction du blanchiment n’introduit pas d’artefacts supplémentaires, les résultats devraient être comparables11.

La figure 5A montre des images spectrales représentatives d’une membrane non couverte obtenue à partir d’une cellule exprimant des canaux K ATP marqués ANAP en l’absence et en présence de TNP-ATP. Les spectres corrigés sont représentés à la figure 5B. En observant les spectres d’émission, il y avait une séparation claire entre l’émission de fluorescence donneuse et acceptrice. Comme une certaine liaison non spécifique du TNP-ATP aux membranes plasmiques naïves des cellules HEK-293T non transfectées a été observée, il est recommandé de quantifier le FRET comme une réduction de la fluorescence du donneur (ANAP)10,11. Ce pic était spécifique au récepteur marqué.

Pour les ligands qui induisent un changement conformationnel dans leur récepteur, les études de liaison isolées ne fournissent pas d’informations directes et mécaniquement significatives sur le processus de liaison du ligand18. La relation concentration-réponse pour la liaison au ligand dépend non seulement de l’affinité intrinsèque de liaison, mais aussi du changement conformationnel induit par la liaison au ligand et de la propension inhérente du récepteur à changer de conformation en l’absence de ligand. Pour mieux comprendre les processus qui soulignent les interactions ligand-récepteur, les mesures de liaison peuvent être associées à des expériences qui fournissent une lecture de la fonction protéique. À cette fin, les canaux ioniques sont un système modèle idéal, car leurs courants peuvent être mesurés avec une résolution temporelle inférieure à ms jusqu’au niveau de la molécule unique à l’aide d’une pince de tension. Historiquement, les mesures de courant et de fluorescence appariées ont fourni des informations significatives sur l’ouverture et la fermeture (gating) des canaux ioniques voltage et ligand-dépendants 19,20,21. Des expériences ont été menées pour mesurer simultanément les courants ioniques et la liaison des nucléotides cycliques fluorescents à divers canaux cycliques régulés par les nucléotides22,23,24. Ces études ont utilisé un ligand qui a augmenté son rendement quantique lors de la liaison. La fluorescence du ligand non lié dans le volume de solution près du patch peut être soustraite en imageant les patchs par microscopie confocale22,23. Dans nos études, la liaison a été mesurée en utilisant la réduction de la fluorescence ANAP. Comme ce signal est spécifique au canal et que FRET entre ANAP et TNP-ATP dépend fortement de la distance (moitié maximale à ~43 Å), la contamination de notre signal par des nucléotides non spécifiquement liés et non liés a été évitée.

La figure 4A montre une expérience typique de fluorométrie à pince patch-clamp (PCF). Un joint à haute résistance (GΩ) a été formé entre une pipette en verre borosilicaté remplie de solution saline (connectée à un amplificateur de pince de tension) et une cellule exprimant le KATP marqué ANAP. Après la formation du joint, la pipette a été retirée de la cellule, permettant l’accès aux sites de liaison aux nucléotides intracellulaires. La pipette a ensuite été positionnée au-dessus de l’objectif du microscope, centrée sur la fente du masque du spectromètre et l’écoulement du système de perfusion microvolume (modifié avec une pointe en verre borosilicate) a été rapproché de la pipette (Figure 4D). La tension a été contrôlée et les courants ont été mesurés à partir des canaux du patch. Les courants et spectres représentatifs des canaux KATP marqués ANAP sont représentés à la figure 4B, codés par couleur pour faire correspondre les spectres aux courants. Les spectres d’émission ont été corrigés pour tenir compte du bruit de fond et du blanchiment, comme pour les membranes non couvertes.

Figure 1
Figure 1 : ANAP et TNP-ATP forment une paire FRET appropriée. a) Structures de l’ANAP et du TNP-ATP. Les fractions fluorescentes sont mises en évidence. (B) Spectres d’émission d’absorbance et de fluorescence de l’ANAP et du TNP-ATP. Un chevauchement entre l’émission d’ANAP et l’absorbance du TNP-ATP est nécessaire pour le FRET. Adapté de Puljung et al. (publié sous licence Creative Commons Attribution, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Mesure de la liaison aux nucléotides dans les membranes plasmiques non couvertes. (A) Schéma pour la préparation de membranes plasmiques non couvertes à partir de cellules adhérentes exprimant une protéine membranaire fluorescente. Des instructions sont fournies pour les cellules cultivées sur des lamelles de couverture recouvertes de poly-L-lysine ou non traitées. (B) Installation expérimentale pour mesurer la liaison aux nucléotides dans les membranes non couvertes. (C) Images en champ clair et fluorescentes d’une membrane plasmique complètement découverte dérivée d’une cellule exprimant des canaux KATP marqués par une protéine fluorescente orange (OFP). L’astérisque marque la position de la membrane, qui est presque invisible dans l’image en champ clair. OFP a été enthousiasmé par une large LED de 565 nm à travers un filtre passe-bande de 531/40 nm et un dichroïque de bord de 562 nm et la lumière émise a été collectée à travers un filtre passe-bande 593/40 nm. (D) Images en champ clair et fluorescentes d’un fragment de membrane partiellement non couvert dérivé d’une cellule exprimant des canaux KATP marqués par une protéine fluorescente orange (OFP). (E) Cours de temps d’échange de solution acquis à l’aide de la configuration décrite en B. Cinq répétitions techniques sont présentées. Le système de perfusion microvolume était chargé de 50 μM de tétraméthylrhodamine-5-maléimide (TMRM). Le bain a été perfusé avec de l’eau à un débit de ~0,5 mL/min. Les données des cycles de lavage (augmentation de la fluorescence) et de lavage (diminution de la fluorescence) correspondaient à une seule décroissance exponentielle de la forme F = A*exp(-x/τ) + y0. La constante de temps (τ) pour le lavage était de ~0,6 s. La constante de temps pour le lavage était de ~1,0 s. TMRM était excité par une large LED de 565 nm à travers un filtre passe-bande 540/25 nm et un dichroïque de bord de 565 nm et la lumière émise était recueillie à travers un filtre passe-bande 605/55 nm. (F) Comparaison de l’intensité de fluorescence d’une solution 50 μM de TMRM appliquée en utilisant le système de perfusion microvolumique comme dans B et un bain étanche contenant 50 μM TMRM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Soustraction de fond et correction du blanchiment. (A) Image spectrale (information spatiale dans la dimension y, longueur d’onde dans la dimension x) d’une membrane de plasma non couverte à partir d’une cellule exprimant des canaux KATP marqués ANAP. Le TNP-ATP de 5 μM A ÉTÉ APPLIQUÉ SELON LA CONFIGURATION DÉCRITE À LA FIGURE 2B. La boîte orange indique la région d’intérêt (ROI), correspondant à la membrane non couverte. La case grise indique la région d’arrière-plan utilisée pour corriger le spectre. (B) Spectres d’émission dérivés des moyennes longueur d’onde par longueur d’onde du ROI et des régions de fond dans A. (C) Spectre obtenu en soustrayant le spectre de fond moyen du spectre moyen de retour sur investissement dans B. La fenêtre de 5 nm autour du pic ANAP utilisée pour déterminer l’intensité moyenne est représentée par une zone ombragée en gris. (D) Spectres acquis à partir de six expositions consécutives de 10 s d’une membrane plasmique non couverte à partir d’une cellule exprimant des canaux KATP marqués ANAP. Notez la diminution de la fluorescence résultant du photoblanchiment. L’encart montre que la fluorescence de crête normalisée correspond à une seule décroissance exponentielle de la forme F/Fmax = A*exp(-t/τ) + (1-A). Les symboles de l’encart sont codés par couleur pour correspondre aux spectres. (E) Les mêmes spectres que dans D corrigés pour le photoblanchiment. L’encart montre la fluorescence de pic normalisée de D sous forme de cercles ouverts, avec la fluorescence de pic corrigée affichée à l’aide de cercles remplis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Mesures simultanées de la liaison aux nucléotides et des courants de canal à l’aide de la fluorométrie patch-clamp (PCF). (A) Schéma montrant le dispositif expérimental de mesure de la liaison nucléotidique et des courants ioniques. (B) Exemples de courants (à gauche) et de spectres (à droite) acquis à partir d’une plaque membranaire excisée d’une cellule exprimant des canaux KATP marqués par ANAP. Les courants ont été enregistrés à un potentiel de rétention de -60 mV, numérisés à 20 kHz et filtrés à 5 kHz. La zone ombragée en gris correspond à la gamme de longueurs d’onde à partir de laquelle l’intensité de l’ANAP a été quantifiée. Adapté de Usher et al. (publié sous la licence Creative Commons Attribution, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. (C) Spectre acquis à partir d’un patch membranaire excisé d’une cellule exprimant des canaux K ATP marqués par ANAP exposés à 1 mM DE TNP-ATP. Notez le pic négatif correspondant à la gamme de longueurs d’onde sur laquelle la fluorescence TNP-ATP est observée. La zone ombragée en gris indique la gamme de longueurs d’onde utilisée pour quantifier la fluorescence ANAP comme dans B. Adapté de Usher et al. (publié sous la licence Creative Commons Attribution, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. D) Images en champ clair et fluorescentes d’une pipette patch exposée à 1 mM DE TNP-ATP. L’astérisque marque l’extrémité de la pipette. E) Image spectrale de la même pipette patch dans 1 mM DE TNP-ATP. L’astérisque marque la position de la pipette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Liaison TNP-ATP aux canaux KATP marqués ANAP. (A) Images spectrales d’une membrane plasmique non couverte provenant d’une cellule exprimant des canaux K ATP marqués ANAP en l’absence de TNP-ATP ou en présence de 50 μM ou 1 mM DE TNP-ATP. Les intensités sont indiquées sous forme de carte thermique. (B) Spectres moyens longueur d’onde par longueur d’onde à partir des images de A montrant l’extinction de la fluorescence ANAP par TNP-ATP. Les zones ombrées représentent deux filtres passe-bande différents qui peuvent être utilisés pour mesurer la trempe ANAP si un spectromètre n’est pas disponible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Trempe des canaux K ATP marqués ANAP parTNP-ATP dans les membranes non couvertes et PCF. Superposition de données d’Usher et al. (publiées sous la licence Creative Commons Attribution, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. Les données étaient adaptées à l’équation de Hill : F / F max = E max + (1 – E max) / (1+10(EC50 –[TNP-ATP])*h). F est la fluorescence mesurée, F max est la fluorescence maximale en l’absence de nucléotide, Emax est la trempe maximale aux concentrations de nucléotides saturés et h est la pente de Hill. CE50, (la concentration de nucléotides à laquelle la trempe est la moitié maximale) et [TNP-ATP] sont des valeurs logarithmiques. Membranes non couvertes : CE50 = -4,59 (25,7 μM), h = 0,82, Emax = 0,93. PCF : CE50 = -4,11 (77,6 μM), h = 0,87, Emax = 1,00. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous avons développé une méthode pour mesurer la liaison des nucléotides adénine en temps réel aux protéines membranaires intactes. Notre méthode s’appuie sur plusieurs autres techniques établies, y compris le marquage des protéines avec ANAP en utilisant la suppression du codon stop ambre 12, le déverrouillage de la cellule 14 et la fluorométrie à pince de tension / PCF 19,20,21,22,23,24,25 . La synthèse de ces approches permet de mesurer la liaison nucléotidique avec une résolution spatiale et temporelle élevée. En effet, dans nos travaux précédents, nous avons pu distinguer différents sites de liaison sur le même complexe protéique en utilisant cette approche10,11. Il est important de noter que cette technique peut être directement appliquée à de petites quantités de protéines dans un environnement cellulaire dans des conditions qui préservent la fonction protéique. L’utilisation de notre méthode de liaison en conjonction avec la lecture électrophysiologique directe des courants des canaux ioniques nous permet d’obtenir des informations riches sur les fondements moléculaires de la gatingde canal 11.

Comme les spectromètres sont un équipement de laboratoire non standard, l’intensité de l’ANAP peut également être surveillée dans un isolement relatif à l’aide de filtres passe-bande. La figure 5B illustre les propriétés spectrales de deux de ces filtres. Le filtre passe-bande 470/10 nm filtre efficacement le signal de fluorescence du TNP-ATP et chevauche bien la fluorescence ANAP maximale. Cependant, la transmittance maximale de ce filtre n’est que d’environ 50%, ce qui peut rendre difficile l’obtention de bons signaux à partir de membranes sombres (ou dans des plaques de membrane excisées sous pince de tension). Une autre option est un filtre passe-bande 460/60 nm. Il y a un peu plus de chevauchement entre le filtre 460/60 nm et le pied du pic d’émission TNP-ATP par rapport au filtre 470/10 nm. Cependant, le passe-bande 460/60 nm a une transmittance de 90 à 95 % sur une large gamme de crête de l’ANAP, ce qui devrait augmenter le signal d’émission de fluorescence.

L’ANAP est un fluorophore 12,26,27 sensible à l’environnement. Le pic d’émission et le rendement quantique varient en fonction du site d’incorporation de la protéine d’intérêt et peuvent changer à mesure que la protéine change de conformation. De tels changements seraient immédiatement évidents à partir des spectres d’émission, mais ne le seraient pas autant lorsque l’intensité du PANA est mesurée à l’aide de filtres. Dans tous les cas, des contrôles appropriés sont nécessaires pour démontrer que le signal de fluorescence ne varie pas en raison de changements dans l’environnement local autour de l’ANAP après la liaison aux nucléotides. Les expériences de contrôle avec des nucléotides non marqués peuvent aider à vérifier que tout changement dans l’intensité de l’ANAP est le résultat de FRET entre ANAP et TNP-nucléotides. Les nucléotides TNP peuvent se lier de manière non spécifique aux membranes dérivées de cellules non transfectées (soit à la membrane plasmique, soit aux protéines membranaires natives)10. Nous quantifions la liaison comme une diminution de la fluorescence du donneur, car ce signal est spécifique au canal marqué. Cependant, nous recommandons d’effectuer des expériences de contrôle supplémentaires pour chaque paire agoniste/récepteur, par exemple en mutant le site de liaison nucléotidique s’il est connu, afin de vérifier que le changement de fluorescence du donneur est vraiment le résultat d’une liaison directe au récepteurmarqué 11. Enfin, il est recommandé de travailler avec des constructions qui contiennent une étiquette de protéine fluorescente en plus de l’étiquette ANAP. Cela permet de différencier la fluorescence des récepteurs marqués de la fluorescence de fond/autofluorescence. La fluorescence de fond peut être distinguée de l’ANAP par le pic et la forme des spectres d’émission10, mais de telles déterminations peuvent être très difficiles lorsque seuls des jeux de filtres sont utilisés. De plus, les cellules et les membranes non couvertes exprimant des récepteurs fluorescents peuvent être identifiées à l’aide de l’étiquette de protéine fluorescente sans avoir à exciter l’ANAP et à risquer un photoblanchiment excessif.

Dans bon nombre de nos enregistrements PCF, nous avons observé un fort pic négatif dans nos spectres à des concentrations élevées de TNP-ATP (Figure 4C). Ce pic négatif est un artefact de notre protocole de soustraction de fond. La figure 4D montre des images en fond clair et fluorescentes d’une pipette patch exposée à 1 mM DE TNP-ATP. Une ombre à l’extrémité de la pipette est évidente, résultant de l’exclusion du TNP-ATP du volume des parois de la pipette, ce qui est le plus évident dans le plan de focalisation. L’image spectrale de la figure 4E montre une bande sombre, correspondant à cette ombre. Lorsqu’une région au-dessus ou au-dessous de cette bande sombre est utilisée pour la soustraction de fond, elle produit un pic négatif. Il est important de noter que ce pic s’est produit sur une gamme de longueurs d’onde correspondant à l’émission de TNP-ATP et n’a pas affecté nos mesures de trempe ANAP.

La principale limite de nos expériences était d’obtenir une expression membranaire plasmatique adéquate de constructions marquées par ANAP pour mesurer la fluorescence. Il était généralement plus facile d’acquérir des spectres de haute qualité à partir de membranes non couvertes qu’en PCF, en raison de leur plus grande taille et de notre capacité à scanner rapidement une boîte entière de membranes non couvertes, contrairement au PCF où les patchs ne peuvent être obtenus qu’un à la fois. Dans nos expériences, les données provenant de membranes non couvertes et d’expériences PCF étaient similaires mais pas équivalentes (Figure 6)11. Cependant, il n’y a pas de raison a priori pour que cela soit une observation universelle, car les protéines d’une pipette patch peuvent être dans un état fonctionnel différent de celui des membranes non couvertes.

Ici, des tentatives ont été faites pour maximiser l’expression de nos constructions marquées ANAP, en particulier en abaissant la température de culture cellulaire à 33 °C10,11,16. D’après notre expérience, tenter d’identifier les sites de la protéine où le PANA serait une substitution conservatrice n’a pas systématiquement abouti à des constructions qui exprimaient bien. Nous avons eu plus de succès en analysant systématiquement des régions protéiques entières pour les sites d’incorporation de l’ANAP et en sélectionnant les candidats pour l’expression de surface10. Le système de marquage ANAP fonctionne également dans les ovocytes Xenopus laevis, ce qui permet d’exciser des plaques membranaires beaucoup plus grandes, augmentant ainsi le rapport signal/bruit26,27,28.

Alors que des niveaux d’expression plus élevés devraient entraîner des signaux plus lumineux, le nombre minimum de canaux requis pour mesurer la fluorescence dépend de plusieurs facteurs, notamment la luminosité du fluorophore, le degré de photoblanchiment, l’intensité de la lumière d’excitation et le plan de focalisation. En théorie, les estimations pourraient être faites en corrélant l’intensité de fluorescence et le courant de canal comme cela a été montré précédemment28,29. Cependant, la fiabilité de telles estimations nécessite une certaine connaissance de la conductance monocanal et de la probabilité ouverte du canal. En plus des facteurs énumérés ci-dessus, le signal de fluorescence sera également affecté par les canaux associés aux vésicules ou aux sections de la membrane plasmique collées au verre de la pipette qui ne sont pas sous pince de tension.

Cette méthode est facilement adaptée à l’étude d’autres canaux ioniques sensibles aux nucléotides. Le CFTR est structurellement similaire à la sous-unité accessoire du récepteur de la sulfonylurée de KATP30,31. Comme KATP CFTR gating est contrôlé par la liaison aux nucléotides, ce qui en fait une cible future évidente de notre méthode7. Les récepteurs P2X purinergiques sont des canaux ioniques dirigés par l’ATP9 extracellulaire. Le TNP-ATP agit comme antagoniste des récepteurs P2X32,33. Par conséquent, il ne sera pas utile pour étudier l’activation P2X, bien qu’il puisse être utilisé dans des tests de compétition avec des agonistes P2X. D’autres dérivés fluorescents de l’ATP ayant un chevauchement spectral suffisant avec l’émission d’ANAP peuvent également être utilisés pour étudier l’activation. Alexa-647-ATP est un agoniste P2Xfluorescent 34. Le R0 calculé entre Alexa-647 et ANAP est ~85 Å, ce qui signifie que la liaison directe à P2X devrait entraîner une trempe substantielle de l’ANAP incorporé dans le canal. Cependant, un R0 aussi long entraînera également une trempe d’Alexa-647-ATP liée aux sous-unités voisines et augmentera la probabilité que la liaison de nucléotides non spécifiques entraîne FRET. Comme le site de liaison du ligand dans les récepteurs P2X est extracellulaire, les mesures de liaison seraient effectuées sur des cellules intactes, dans une pince de tension de cellule entière ou dans des plaques membranaires extérieures. Notre méthode peut également être étendue pour étudier la liaison et l’activation des transporteurs et des pompes électrogéniques et non électrogéniques qui dépendent de l’ATP pour leur cycle de réaction, ainsi que des récepteurs P2Y couplés aux protéines G. Enfin, même si nous avons développé cette méthode pour mesurer la liaison aux nucléotides adénine (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), la même approche peut être utilisée pour étudier la liaison à pratiquement n’importe quel récepteur pour lequel un ligand fluorescent approprié a été identifié.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Raul Terron Exposito pour son excellente assistance technique. Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques (BB/R002517/1; MCP et FMA) et le Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T75 tissue-culture treated flask StarLab CC7682-4875
0.1% w/v poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
30 mm borosilicate cover glass slips VWR 631-0174
35 mm non-treated sterile dishes CytoOne CC7672-3340
35 mm cover glass bottom dish WPI FD35-PDL-100
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 31966021
Foetal bovine serum (FBS) Gibco 10500-064
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
TrypLE select (tryosin) Gibco 12563-011 Trypsin/EDTA reagent
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14040-091
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-035
HEK293T cells ATTC CRL-3216 Used between passages 5-30
ANAP-TFA AsisChem ASIS-0014 Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM
pANAP expression plasmid Addgene Plasmid #48696 Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein
peRF1-E55D Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor
TransIT-LT1 Mirus Bio MIR 2300 Lipopolyplex transfection reagent
Thick-walled borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15
Tetramethylrhodamine-5-maleimide Sigma-Aldrich 94506
TNP-ATP Jena Bioscience NU-221L Delivered at 10 mM in water
Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope Nikon
60x water immersion objective (1.4 NA) Nikon MRD07602
4-Wavelength High-Power LED Head ThorLabs LED4D245 385/490/565/625 nm LEDs
Four-Channel LED Driver ThorLabs DC4100
390/18 nm band-pass excitation filter ThorLabs MF390-18 For ANAP excitation
400 nm long-pass emission filter ThorLabs FEL0400 For imaging ANAP spectra
416 nm edge dichroic ThorLabs MD416 For imaging ANAP spectra
460/60 nm band-pass emission filter ThorLabs MF460-60 Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
470/10 nm band-pass emission filter ThorLabs FB470-10 Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
531/40 band-pass excitation filter Brightline FF01-531/40-25 For orange fluorescent protein (OFP) excitation
540/25 nm band-pass excitation filter Chroma D540/25X For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation
562 nm edge dichroic Semrock FF562-Di03 For imaging OFP fluorescence
565 nm edge dichroic Chroma 565DC For imaging TMRM fluorescence
593/40 nm band-pass excitation filter Brightline FF01-387/11-25 For imaging OFP fluorescence
605/55 nm band-pass emission filter Chroma D605/55M For imaging TMRM fluorescence
IsoPlane-160 Imaging Spectrometer Princeton Instruments IsoPlane-160
PIXIS 400BR_eXcelon Camera Princeton Instruments PIXIS: 400BR_eXcelon
Axopatch 200B amplifier Molecular Devices Axopatch 200B-2
Digidata 1440A digitizer Molecular Devices Digidata 1440A
Probe sonicator Sonics & Materials VC-50 For unroofing
REGLO digital peristaltic pump Ismatec ISM 832 For bath perfusion
Microvolume perfusion system ALA Scientific Instruments ALA μFlow-8 For TNP-ATP perfusion
pClamp 10.6.2 Molecular Devices Recording and analysing currents
Lightfield 5.20.1507 Princeton Instruments Acquisition software for images and spectra
Matlab Mathworks For data analysis
Python 3.8.1 Python Software Foundation For data analysis

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References

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Usher, S. G., Ashcroft, F. M.,… More

Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time. J. Vis. Exp. (169), e61401, doi:10.3791/61401 (2021).

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