Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling av nukleotidbinding til intakte, funksjonelle membranproteiner i sanntid

Published: March 11, 2021 doi: 10.3791/61401
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Department of Chemistry and Neuroscience Program, Trinity College

Summary

Denne protokollen presenterer en metode for måling av adeninnukleotidbinding til reseptorer i sanntid i et cellulært miljø. Binding måles som Förster resonans energioverføring (FRET) mellom trinitrofenylnukleotidderivater og protein merket med en ikke-kanonisk, fluorescerende aminosyre.

Abstract

Vi har utviklet en metode for å måle binding av adeninnukleotider til intakte, funksjonelle transmembranreseptorer i et cellulært eller membranmiljø. Denne metoden kombinerer ekspresjon av proteiner merket med den fluorescerende ikke-kanoniske aminosyren ANAP, og FRET mellom ANAP og fluorescerende (trinitrofenyl) nukleotidderivater. Vi presenterer eksempler på nukleotidbinding til ANAP-merkede K ATP-ionekanaler målt i utaket plasmamembraner og skåret ut, innvendig ut membranlapper under spenningsklemme. Sistnevnte tillater samtidige målinger av ligandbinding og kanalstrøm, en direkte avlesning av proteinfunksjonen. Databehandling og analyse diskuteres mye, sammen med potensielle fallgruver og gjenstander. Denne metoden gir rik mekanistisk innsikt i ligandavhengig gating av KATP-kanaler og kan lett tilpasses studiet av andre nukleotidregulerte proteiner eller en hvilken som helst reseptor som en egnet fluorescerende ligand kan identifiseres for.

Introduction

Flere viktige proteinklasser reguleres direkte av ligandbinding. Disse spenner fra løselige enzymer til membraninnebygde proteiner, inkludert reseptortyrosinkinaser, G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) og ionkanaler. GPCR og kanaler står for ~34% og ~15% av alle gjeldende narkotikamål, henholdsvis 1,2. Derfor er det en betydelig biokjemisk, så vel som medisinsk interesse for å utvikle metoder som gir mekanistisk innsikt i ligand-reseptorinteraksjoner. Tradisjonelle metoder for måling av ligandbinding, inkludert fotoaffinitetsmerking og radioligandbindingsstudier, krever store mengder delvis renset protein og utføres vanligvis under ikke-fysiologiske forhold og tidsskalaer. En ideell metode ville kreve bare små mengder protein, kunne utføres på intakte proteiner uttrykt i et cellulært eller membranmiljø, kunne overvåkes i sanntid, og ville være kompatibel med direkte avlesninger av proteinfunksjon.

Förster resonans energy transfer (FRET) er en metode som oppdager nærheten mellom to fluorescerende merkede molekyler3. FRET oppstår når en eksitert donorfluorofor overfører energi på en ikke-radiativ måte til et akseptormolekyl (vanligvis en annen fluorofor). Energioverføring resulterer i slukking av donorfluorescensutslipp og sensibilisering av akseptorutslippet (hvis akseptoren er en fluorofor). Overføringseffektiviteten er avhengig av 6. kraft av avstanden mellom giveren og akseptoren. Videre må donor og akseptor være i nærheten (vanligvis mindre enn 10 nm) for at FRET skal forekomme. Som sådan kan FRET utnyttes til å måle den direkte bindingen mellom en fluorescerende merket proteinreseptor og en fluorescerende ligand.

Flere forskjellige proteiner reguleres eller aktiveres ved å binde intracellulære eller ekstracellulære adeninnukleotider (ATP, ADP, AMP, cAMP). Mange transportørproteiner krever ATP-hydrolyse for deres reaksjonssyklus, inkludert ATP-bindende kassetttransportører og P-type ATPaser som Na + / K + pumpe 4,5. ATP-sensitive K + (KATP) kanaler, cystisk fibrose transmembran konduktansregulator (CFTR) og syklisk nukleotidregulerte kanaler er alle ionkanaler som er styrt ved binding av intracellulære adeninnukleotider, noe som gjør dem utsøkt følsomme for endringer i cellulær metabolisme og signaltransduksjon 6,7,8 . Purinerge P2X- og P2Y-reseptorer reagerer på endringer i ekstracellulær ATP, som kan frigjøres som en nevrotransmitter eller som følge av vevskader9. Vi har utviklet en FRET-basert analyse for måling av adeninnukleotidbinding til membranproteiner i sanntid. Vi har tidligere brukt denne metoden til å studere nukleotidbinding til KATP-kanaler 10,11.

For å måle nukleotidbinding via FRET, må et protein av interesse først merkes med en fluorofor. Den fluorescerende taggen må settes inn stedsspesifikt i proteinet av interesse slik at det er nær nok til ligandbindingsstedet for FRET å forekomme, med spesiell forsiktighet tatt for å sikre at taggen ikke påvirker proteinets generelle struktur og funksjon. For å oppnå dette bruker vi en teknikk utviklet av Chatterjee et al., ved bruk av rav stopp-kodonundertrykkelse for å sette inn en fluorescerende ikke-kanonisk aminosyre (l-3-(6-acetylnaftalen-2-ylamino)-2-aminopropionisk; ANAP) på ønsket sted12. Vi måler nukleotidbinding som FRET mellom ANAP-merket protein og fluorescerende, trinitrofenyl (TNP) nukleotidderivater (figur 1A). Emisjonsspekteret for ANAP overlapper med absorbansspekteret til TNP-nukleotider, en tilstand som er nødvendig for at FRET skal forekomme (figur 1B). Her skisserer vi to forskjellige typer bindingseksperiment. I det første måles nukleotidbinding til den intracellulære siden av ANAP-merkede KATP-kanaler i celler som har blitt unroofed ved sonikering, og etterlater vedheftende fragmenter av plasmamembran på et glassdeksel 10,11,13,14.

I den andre metoden måles nukleotidbinding til ANAP-merkede KATP-kanaler i et membranplaster under spenningsklemme, noe som muliggjør samtidig måling av ioniske strømmer og fluorescens. Ved å kombinere disse to eksperimentelle tilnærmingene kan endringer i binding korreleres direkte med endringer i kanalfunksjon11. Typiske resultater, potensielle fallgruver og dataanalyse diskuteres.

Protocol

1. Klargjøring av dekklapper

MERK: Disse trinnene må finne sted i en hette for steril vevskultur. Mengder er gitt til fremstilling av 10 retter.

  1. Plasser ti autoklaverte, 30 mm borosilikatglassglass som glir individuelt inn i ti 35 mm ubehandlede sterile retter og skyll en gang med 2 ml sterilt, destillert vann.
  2. Fortynn 1 ml 0,1 % w/v poly-L-lysinoppløsning til sterilt, destillert vann til et totalt volum på 10 ml (endelig konsentrasjon på 0,01 % w/v). Bland godt, deretter pipett 1 ml på hver dekselslip og inkuber ved romtemperatur i 20 minutter.
  3. Aspirer poly-L-lysin og vask hvert deksel to ganger med minst 2 ml sterilt destillert vann. La stå til det er helt tørt, dvs. minst 3 timer.

2. Såing HEK-293T-celler

MERK: Disse trinnene må finne sted i en vevskulturhette. HEK-293T-celler ble valgt for sin lave strømbakgrunn og enkle dyrking i kultur. Denne protokollen kan tilpasses andre celletyper.

  1. Skyll en 80-90% sammenflytende T75-kolbe med HEK-293T-celler en gang med 12 ml fosfatbufret saltvann (PBS) før du inkuberer med 2 ml trypsin i 2-5 minutter, eller til cellene er helt løsrevet og nesten fullstendig dissosiert.
  2. Resuspender cellene ved å tilsette 10 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10 % føtal bovint serum, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Pipett forsiktig mot bunnen av kolben for å bryte opp gjenværende klumper av celler.
  3. Tilsett 2 ml supplert DMEM til ønsket antall 35 mm fat som inneholder belagte dekksedler. Tilsett 100 μL resuspenderte celler til hver tallerken. Inkuber over natten ved 37 °C.

3. Transfeksjon

MERK: Disse trinnene må finne sted i en vevskulturhette. Mengder er gitt for transfeksjon av 10 retter. For stedsspesifikk ANAP-inkorporering må DNA-kodonet i posisjonen beregnet for merking erstattes med det gule (TAG) stoppkodonet. Denne konstruksjonen er co-transfektet med to plasmider: pANAP og peRF1-E55D12,15. pANAP koder for flere kopier av et ANAP-spesifikt tRNA/tRNA-syntetasepar. I nærvær av ANAP produserer transfeksjon av dette plasmidet tRNA ladet med ANAP som gjenkjenner det gule stoppkodonet. peRF1-E55D koder for en dominant negativ ribosomal frigjøringsfaktor som øker utbyttet av full-lengde, ANAP-merket protein.

  1. Forbered et 1,5 ml rør med 10 μg pANAP, 10 μg peRF1-E55D og DNA for konstruksjonen beregnet for merking med ANAP. Bring til et endelig volum på 500 μL med usupplert DMEM.
  2. I et separat rør, klargjør 3 μL lipidbasert transfeksjonsreagens (se materialtabell) for hver 1 μg DNA og bring til et endelig volum på 500 μL med utilsatt DMEM.
  3. Kombiner DNA- og transfeksjonsreagensblandingene i et enkelt rør og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
  4. Tilsett 400 μL av 1 mM ANAP-stammaterialet (trifluoracetatsalt i 30 mM NaOH) til 20 ml tilsatt DMEM for en endelig konsentrasjon på 20 μM ANAP. Bytt ut de gamle mediene fra de belagte cellene med 2 ml av det ANAP-holdige mediet per tallerken.
  5. Pipette 10% av DNA-transfeksjonen blandes på hver tallerken. Inkuber ved 33 °C i 2-4 dager før forsøk. Inkubasjon ved 33 °C bremser celledelingen og øker proteinutbyttet per celle16.

4. Membraneksperimenter uten tak

  1. Bruk en tang til å bryte en deksellapp med transfekterte celler i mindre fragmenter.
  2. Følg en av prosedyrene nedenfor for å løsne takceller.
    1. Hvis du bruker forhåndsbelagte dekselslipp, skyll et fragment med PBS, og legg det på bunnen av en 35 mm tallerken som inneholder 2 ml PBS. Kort sonikere ved hjelp av en sonde sonde sonde (50 W, 20% -40% amplitude, 3 mm sonde) plassert 3-5 mm over prøven for å unroof celler og etterlate adherente plasmamembranfragmenter (figur 2A, C).
      MERK: Sonikatoreffekt, varighet og sondehøyde over prøven kan alle varieres for å oppnå et høyt utbytte av utakede membraner uten helt denuding dekselet.
    2. Hvis du ikke bruker forhåndsbelagte dekselslipp, skyll et dekselglidefragment med PBS, dypp deretter inn i et rør som inneholder 0,1% w / v poly-L-lysin i ~ 30 s før du kort sonikerer (som i trinn 4.2.1) for å unroof celler og etterlate unroofed / delvis unroofed plasmamembranfragmenter (figur 2A, C, D). Kortvarige eksponeringer for poly-L-lysin har vist seg å forbedre etterlevelsen av dekkseddelen13.
  3. Plasser det sonikerte fragmentet i en dekselglassbunn 35 mm tallerken som inneholder 2 ml badeoppløsning og monter på et omvendt mikroskop utstyrt med et høyt NA, 60x vann nedsenking mål. Kameraporten til mikroskopet er koblet til en spektrograf i serie med et CCD-kamera med høy følsomhet. Perfus badekammeret (0,5 – 1 ml/min) med buffer ved hjelp av en peristaltisk pumpe. Sammensetningen av bufferen vil variere avhengig av proteinet som studeres.
    MERK: Hvis brukeren ikke har tilgang til et objektiv med lang arbeidsavstand, kan det være umulig å fokusere på membranfragmentene uten tak på grunn av den ekstra høyden på dekselet. Et alternativ er å frø celler direkte på fat med poly-L-lysin glassbunn (se Materialfortegnelse for et eksempel). Dette vil også redusere potensielle avvik i bildet forbundet med å fokusere gjennom to glassbiter. Disse avvikene påvirker ikke formen på spektrene som er oppnådd.
  4. Identifiser membranfragmenter uten tak som uttrykker den ANAP-merkede kanalen ved å se etter kanalfluorescens (figur 2C,D).
    MERK: Det anbefales å bruke en ekstra fluorescerende etikett (der utslippsspekteret kan skilles fra ANAP-utslippsspekteret) for å identifisere utakede membraner som inneholder proteinet av interesse. Forsøkene i figur 2C,D ble utført på ANAP-merkede kanaler med C-terminale fluorescerende proteinmerker.
  5. Koble spektrometermasken delvis inn (hev ~10 %) mellom kameraporten på mikroskopet og spektrografen. Skyggen av masken vises på kamerabildet. Juster membranen uten tak med spektrometermasken ved å justere mikroskoptrinnet. Skaff deg et lyst felt og fluorescensbilde av den utakede membranen. Disse vil bli brukt til å velge en region av interesse for analyse.
  6. Før spissen av mikrovolumperfusjonssystemet nær membranen uten tak.
    MERK: For å redusere bakgrunnsfluorescensen ble utstrømningen av perfusjonssystemet erstattet med en tilpasset spiss laget av borosilikatglass.
  7. For å avbilde fluorescensspektra, opphiss membranen med en 385 nm LED gjennom et 390/18 nm båndpass-eksitasjonsfilter og en 416 nm kantdikroisk. Samle utsendt lys gjennom et 400 nm langpassfilter (figur 2B).
  8. Koble til spektrometermasken og sørg for at det utstrålede lyset føres gjennom. Koble til spektrometerristene (300 spor/mm). Med gitterene på plass, vil lyset diffracted av spektrometeret projiseres på brikken til CCD-kameraet for å produsere spektrale bilder (figur 3A). Disse bildene beholder romlig informasjon i y-dimensjonen . X-dimensjonen erstattes med bølgelengde.
  9. Eventuelt, hvis proteinet av interesse er merket med et fluorescerende protein, skaff deg et spektralbilde av det fluorescerende proteinet ved å bruke riktig filtersett.
  10. Ta en eller flere 0,1-10 s eksponeringer ved starten av forsøket mens du perfuserer nukleotidfri bufferløsning. Disse vil bli brukt til å korrigere og normalisere data gjennom resten av eksperimentet (se avsnitt 5 nedenfor).
    MERK: Valg av eksponeringstid vil avhenge av oppnådd uttrykksnivå, fluoroforens lysstyrke og optikken. Eksponeringstid bør velges for å maksimere signalet og minimere den observerte blekingshastigheten. Eksponeringstidsområdet gitt i 4,10 er egnet for likevektsbindingsmålinger, men kan være nyttig for å måle langsommere kinetiske endringer10. Evnen til å bruke korte eksponeringstider for å spore raskere kinetikk vil være begrenset av proteinuttrykksnivåer og fotobleking, i stedet for maskinvare.
  11. Påfør en rekke konsentrasjoner av TNP-ATP (vanligvis fremstilt i badeoppløsning) for å etablere en konsentrasjon-responskurve. Perfus hver oppløsning i minst 1 min for å sikre at en jevn tilstand er nådd, og vask ut hver konsentrasjon med badeoppløsning i minst 1 min.
    MERK: Det er viktig å sikre at perfusjonssystemet raskt kan nå likevekt (figur 2E) og oppnå riktig lokal konsentrasjon av TNP-ATP (figur 2F).
  12. Ta en eksponering (med samme varighet som brukt i trinn 4.10) ved hver konsentrasjon og ved slutten av hver utvasking.

5. Spektral analyse

MERK: Disse instruksjonene er skrevet for bruk med analysekoden "pcf.m", som du finner på GitHub. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. Ytterligere og alternativ kode finner du påhttps://github.com/smusher/KATP_paper_2019 11. Vi har beskrevet operasjonene som utføres av programvaren her, slik at brukeren kan lage sin egen kode eller velge å analysere dataene manuelt.

  1. Start analyseprogrammet ved å skrive inn programmets navn ("pcf") på kommandolinjen.
  2. Når en åpen fil-/mappedialogboks åpnes med ledeteksten: "Velg filer for avkastning", velger du filnavnene som er knyttet til lysfelt- og fluorescensbildene av membranen uten tak. En ledetekst vises på kommandolinjen for å skrive inn navnet på utdatafilen.
  3. Skriv inn filnavnet og trykk enter.
  4. Når programvaren viser lysfelt- og fluorescensbilder, velger du et interesseområde (ROI) i spektralbildet som tilsvarer plasseringen av det utakede membranfragmentet eller den utskårne (se avsnitt 6) i henhold til programvareinstruksjonene. Velg et bakgrunnsområde i samme spektralbilde (som representerer samme bølgelengdeområde som i ROI) som tilsvarer en del av dekselet eller fatet uten membran festet (figur 3A). Programvaren vil be om å klikke på toppen av avkastningen og trykke Enter, klikk nederst på avkastningen og trykk Enter og gjenta deretter denne prosessen for bakgrunnsregionen.
  5. Når en åpen fil-/mappedialogboks åpnes med ledeteksten: "Velg fil for FP-spektrum", velger du filnavnet som er knyttet til det fluorescerende proteinspekteret (FP) (valgfritt trinn 4.9). Hvis ingen FP-spektrum ble anskaffet, velger du en annen spektrumfil. FP-spekteret fungerer som kvalitetskontroll for å skille mellom merket protein og bakgrunnsfluorescens.
  6. Når en åpen fil / mappedialogboks åpnes med ledeteksten: "Velg filer for analyse", velg alle filene som tilsvarer ANAP-spektrene (fra trinn 4.10 til 4.12), inkludert filene som trengs for blekemiddelkorreksjon.
  7. Når en åpen fil-/mappedialogboks åpnes med ledeteksten: "Velg filer for blekingssamling", velger du delsettet av filer fra trinn 5.6 som tilsvarer innledende spektra oppnådd i nukleotidfri løsning ved begynnelsen av forsøket eller spektra oppnådd under vask i nukleotidfri løsning som skal brukes til korreksjon (fra trinn 4.10 til 4.12).
  8. Linjegjennomsnitt hvert bilde for å produsere spektra, dvs. gjennomsnittlig intensitet for alle piksler i y-dimensjonen til en avkastning eller bakgrunnsregion ved hver bølgelengde. (Figur 3B). Trekk det resulterende gjennomsnittlige bakgrunnsspekteret fra det gjennomsnittlige spekteret som er oppnådd fra avkastningen for å fjerne bakgrunnsfluorescens og fluorescens fra ubundet TNP-ATP (figur 3C). Disse trinnene utføres automatisk av programvaren.
  9. Bestem ANAP-intensiteten for hver eksponering ved å beregne gjennomsnittet av intensiteten til et 5 nm vindu sentrert rundt ANAP-toppen av de subtraherte spektrene (vanligvis ~ 470 nm, men kan variere avhengig av det lokale mikromiljøet til ANAP-resten).
    MERK: Figur 3D viser 6 spektra oppnådd fra påfølgende 10 s eksponeringer av et utaket membranfragment som uttrykker ANAP-merkede kanaler. Innfellingen viser den gjennomsnittlige intensiteten til toppen av hvert spektrum. Programvaren vil automatisk finne toppbølgelengden i det første spekteret som er oppnådd og bruke denne verdien gjennom. Intensiteten beregnes automatisk av programvaren.
  10. Normaliser ANAP-intensitetene for hvert eksperiment ved å dividere ANAP-intensiteten til en gitt eksponering (F) med ANAP-intensiteten til den første eksponeringen i tidsserien, som ble tatt i trinn 4,10 (Fmaks). Igjen utfører programvaren disse beregningene automatisk.
  11. Utfør trinnene nedenfor for å hente data.
    1. For å korrigere for ANAP-fotobleking, må du først tilpasse et enkelt eksponentielt henfall, (F / Fmax) = A * exp (-t / τ) + (1-A), hvor t er den kumulative eksponeringstiden, τ er tidskonstanten og A er amplituden) til enten mellomvasketrinnene mellom TNP-ATP-applikasjoner eller til flere innledende eksponeringer tatt før vask på TNP-ATP (figur 3D, innfelt).
      MERK: Programvaren vil vise denne tilpasningen og be om å godta eller avvise den. Hvis tilpasningen blir avvist, vil det bli gitt en annen mulighet til å velge filer for blekingskorreksjon.
    2. Del de normaliserte (i trinn 5.10) ANAP-spektrene med den forutsagte verdien av eksponentiell tilpasning fra trinn 5.11.1 ved hvert tidspunkt (figur 3E).
      MERK: For eksempelet vist er den observerte normaliserte toppfluorescensen ved 50 s 0,65 og den forutsagte fluorescensen fra eksponentiell passform er 0,64. For å korrigere for bleking, del den observerte verdien (0,65, figur 3E innfelt, tom sirkel) med den forutsagte verdien (0,64, figur 3E innfelt, stiplet linje) for å produsere den korrigerte verdien (~ 1, figur 3E innfelt, farget sirkel). Hvis blekingskorreksjon er tilstrekkelig, bør intensiteten av ANAP fra alle eksponeringer oppnådd i fravær av nukleotider være tilnærmet lik (figur 3E). Disse beregningene utføres automatisk av programvaren.
    3. Få utdataene som et bilde som plotter dataene og et fanebasert regneark som inneholder råspektrene, subtraherte spektra, spektra korrigert for fotobleking og toppdataene for hver fil, slik at videre analyse kan utføres.

6. Patch-clamp fluorometri eksperimenter

  1. Trekk lappepipetter fra tykkveggede borosilikatglasskapillærer til en motstand på 1,5 MΩ til 2,5 MΩ når de fylles med pipetteoppløsning. Sammensetningen av pipetteoppløsningen vil variere avhengig av proteinet som studeres.
  2. Overfør et deksel med transfeksjonerte celler på en deksel glassbunn 35 mm tallerken som inneholder 2 ml badeoppløsning og monter på et omvendt mikroskop utstyrt med et høyt NA, 60x vann nedsenking mål. Perfus badekammeret (0,5 – 1 ml / min) med badeoppløsning ved hjelp av en peristaltisk pumpe. Når det gjelder pipetteoppløsningen, vil badeoppløsningen variere avhengig av proteinet som studeres.
  3. Identifiser en celle som uttrykker ANAP-merkede kanaler ved å se etter fluorescens ved cellemembranen.
  4. Fyll en patchpipette med pipetteoppløsning. Påfør forsiktig overtrykk på pipetten og sett i badekammeret. Trykk pipetten mot membranen i cellen og påfør forsiktig sug for å oppnå en GΩ-tetning (figur 4A).
  5. Skjær ut plasteret ved raskt å flytte pipetteholderen bort fra cellen (figur 4A).
    MERK: Ekskludering av plasteret på denne måten bør danne et innvendig plaster, med cytosoliske domener av proteinet utsatt for perfusjonssystemet. Hvis plasseringen av nukleotidbindingsstedet som studeres ikke er cytosolisk, vil det være nødvendig å bruke utvendige flekker eller helcelleopptak for å utføre PCF-eksperimenter.
  6. Før spissen av plasterpipetten nær spissen av perfusjonssystemet, og kontroller at plasteret er innenfor spalten på spektrometermasken (figur 4A).
  7. Bruk TNP-ATP og bildespektra som i trinn 4.10-4.12, samtidig som du registrerer ionstrømresponsen på nukleotidapplikasjon.
    MERK: Pipetteglasset kan introdusere romlige avvik og refleksjoner i de oppkjøpte bildene. Disse avvikene vil imidlertid ikke påvirke formen på de oppkjøpte spektrene, og reflektert eksitasjonslys separeres lett fra fluorescens ved hjelp av enten spektrografen eller et langpassemisjonsfilter.
  8. Analyser spektrene. Spektra avbildet fra utskårne flekker kan vise oversubtraksjon av ubundet TNP-ATP-fluorescens på grunn av utelukkelse av TNP-ATP fra glasset i patchpipetten (figur 4C-E). Denne over-subtraksjonen påvirker ikke ANAP-utslippsspekteret og kan derfor ignoreres.
    MERK: Siden fluorescenssignalet i utskårne flekker vil være lavere enn i membraner uten tak, er det viktig å bruke en eksponeringstid som gir høy nok signal-til-støy uten å bleke ANAP for raskt.

Representative Results

Figur 2 viser det grunnleggende eksperimentelle oppsettet for måling av nukleotidbinding til fluorescerende proteiner i utaket membranfragmenter oppnådd ved sonikering (figur 2A, B). To forskjellige tilnærminger ble brukt for å oppnå membraner uten tak, direkte dyrking av celler på poly-L-lysinbelagte dekkslipp eller dyrking av celler på ubehandlet glass og eksponering av dem kort for poly-L-lysin (0,1% i vann) før avtak. Figur 2C viser et typisk membranfragment uten tak fra en HEK-293T-celle som uttrykker K ATP-kanaler merket med oransje fluorescerende protein (OFP). Membraner uten tak var praktisk talt usynlige i lysfeltbilder og ble identifisert ved fluorescens av merkede membranproteiner eller ved motfarging med et membranfargestoff som oktadecylrhodamin B13. I tillegg til utakede membraner produserte sonikering av HEK-293T-celler også delvis utaket cellefragmenter (figur 2D) 10,17. Disse fragmentene var synlige i lyse felt. Dette kan være et resultat av ruffled plasmamembraner som bare er dårlig festet til dekselglasset. Alternativt kan disse fragmentene inneholde vesikler og membraner fra intracellulære organeller. Som sådan er det å foretrekke å skaffe bilder bare fra "sanne" utakede membraner, da merket målprotein assosiert med intracellulære membraner kan gjenspeile mellomstadier av posttranslasjonell behandling og montering. Dyrking av celler på poly-L-lysinbelagt glass anbefales, da dette resulterte i et høyere utbytte av "ekte" unroofed membraner ved sonikering.

Et mikrovolumperfusjonssystem ble påført fluorescerende nukleotider for å minimere mengdene som trengs i et typisk eksperiment (figur 2B). Den medfølgende polyimidbelagte glassspissen ble erstattet med en håndtrukket borosilikatglassspiss i perfusjonsoppsettet vårt, noe som reduserte fluorescensbakgrunnen. For å minimere nukleotidakkumulering rundt de ubelagte membranene som ble avbildet, ble hele badekammeret langsomt perfusert med buffer. Som sådan ønsket vi å måle hastigheten på løsningsendring fra vårt mikrovolumperfusjonssystem og verifisere at vi var i stand til å oppnå den tiltenkte ligandkonsentrasjonen i vår interesseregion, dvs. at liganden fra vårt perfusjonssystem ikke ble fortynnet direkte inn i bademediet før den nådde den utakede membranen. For å kontrollere for disse mulighetene ble innvasking og utvasking av en 50 μM-løsning av tetrametylrhodamin-5-maleimid (TMRM) fra vårt mikrovolumperfusjonssystem rettet mot overflaten av en glassbunnstallerken perfusert med vann målt (figur 2E). Løsningsbyttekinetikken var reproduserbar og godt beskrevet ved et enkelt eksponentielt henfall med tidskonstanter mindre enn 1 s for både innvasking og utvasking. Slike løsningsutvekslingstider begrenser vår evne til å måle kinetikk av ligandbinding og ubinding i vårt nåværende oppsett. For å verifisere at vi var i stand til å oppnå ønsket ligandkonsentrasjon på overflaten av dekselslippet, sammenlignet vi fluorescensintensiteten på 50 μM TMRM levert til dekselslippet av vårt mikrovolumperfusjonssystem til 50 μM TMRM i et stille bad (figur 2F). Ingen forskjell i intensitet ble observert, noe som verifiserer at passende ligandkonsentrasjoner på overflaten av dekselslippet med vårt mikrovolumperfusjonssystem kan oppnås, selv når badet er perfundert.

Figur 3A viser et spektralbilde hentet fra ANAP-merkede K ATP-kanaler i en ikke-taket membran fra en HEK-239T-celle utsatt for 5 μM TNP-ATP. For å oppnå slike bilder ble utsendt lys fra den utakede membranen rettet gjennom et spektrometer i serie med et CCD-kamera. Den utsendte fluorescensen ble diffracted av gitter og projisert på kamerabrikken, og produserte spektra. De resulterende bildene beholder romlig informasjon i y-dimensjonen, men x-dimensjonen ble erstattet med bølgelengde. Interesseområdet (ROI), som tilsvarer membranen uten tak, er skissert i oransje. To regioner med høy intensitet er tydelige i bildet, tilsvarende topputslippet av ANAP og TNP-ATP. Dette ble best verdsatt i bølgelengde-for-bølgelengde-gjennomsnittet (over hele avkastningen) spekteret vist i figur 3B. Toppen ~ 470 nm tilsvarer ANAP innlemmet i KATP; toppen ~ 535 nm tilsvarer TNP-ATP. For å korrigere for bakgrunnsfluorescens og direkte eksitasjon av TNP-ATP i oppløsning, ble et bakgrunnsområde (figur 3A, grå) valgt fra hvert bilde. Det gjennomsnittlige bakgrunnsspekteret er vist i figur 3B. Det endelige spekteret ble oppnådd ved å trekke det gjennomsnittlige bakgrunnsspekteret fra det gjennomsnittlige ROI-spekteret (figur 3C).

ANAP er utsatt for fotobleking av artefakter. Figur 3D viser reduksjonen i maksimal ANAP-fluorescens etter flere eksponeringer. Maksimal fluorescens fra flere eksponeringer i fravær av TNP-ATP (eller fra vask mellom konsentrasjoner av TNP-ATP) ble montert på et enkelt eksponentielt henfall, og dette ble brukt til å korrigere for fotoblekingsartefakter (figur 3E). Det anbefales å utføre konsentrasjonsresponseksperimenter fra både lave til høye og høye til lave nukleotidkonsentrasjoner. Dersom blekingskorreksjon ikke introduserer flere artefakter, bør resultatene være sammenlignbare11.

Figur 5A viser representative spektrale bilder fra en ikke-taket membran hentet fra en celle som uttrykker ANAP-merkede KATP-kanaler i fravær og tilstedeværelse av TNP-ATP. De korrigerte spektrene er vist i figur 5B. Ved å observere emisjonsspektra var det et klart skille mellom donor- og akseptorfluorescensutslipp. Da det ble observert en uspesifikk binding av TNP-ATP til naive plasmamembraner fra utransfekterte HEK-293T-celler, anbefales det å kvantifisere FRET som en reduksjon i donorfluorescens (ANAP)10,11. Denne toppen var spesifikk for den merkede reseptoren.

For ligander som induserer en konformasjonsendring i reseptoren, gir bindingsstudier isolert sett ikke direkte, mekanistisk meningsfull informasjon om ligandbindingsprosessen18. Konsentrasjon-responsforholdet for ligandbinding avhenger ikke bare av den indre bindingsaffiniteten, men også konformasjonsendringen indusert av ligandbinding, og reseptorens iboende tilbøyelighet til å endre konformasjon i fravær av ligand. For bedre å forstå prosessene som understreker ligand-reseptorinteraksjoner, kan bindingsmålinger parres med eksperimenter som gir en avlesning av proteinfunksjonen. For dette formål er ionkanaler et ideelt modellsystem, da deres strømmer kan måles med sub-ms tidsoppløsning ned til enkeltmolekylnivå ved hjelp av spenningsklemme. Historisk sett har parede strøm- og fluorescensmålinger gitt betydelig innsikt i åpning og lukking (gating) av spennings- og ligandstyrte ionkanaler 19,20,21. Eksperimenter har blitt utført for samtidig å måle ionestrømmer og fluorescerende syklisk nukleotidbinding til forskjellige sykliske nukleotidregulerte kanaler22,23,24. Disse studiene benyttet en ligand som økte kvanteutbyttet ved binding. Fluorescens fra ubundet ligand i volumet av oppløsningen nær plasteret kan trekkes fra ved å avbilde plastrene ved hjelp av konfokalmikroskopi22,23. I våre studier ble binding målt ved hjelp av reduksjonen i ANAP-fluorescens. Siden dette signalet er spesifikt for kanalen og FRET mellom ANAP og TNP-ATP er sterkt avstandsavhengig (halvmaksimum ved ~43 Å), ble forurensning av signalet vårt med ikke-spesifikt bundne og ubundne nukleotider unngått.

Figur 4A viser et typisk patch-clamp fluorometry (PCF) eksperiment. En høy motstand (GΩ) tetning ble dannet mellom en saltvannsfylt borosilikatglasspipette (koblet til en spenningsklemmeforsterker) og en celle som uttrykker ANAP-merket KATP. Etter tetningsdannelsen ble pipetten trukket bort fra cellen, noe som ga tilgang til de intracellulære nukleotidbindingsstedene. Pipetten ble deretter plassert over mikroskopmålet, sentrert på spalten til spektrometermasken, og utstrømningen av mikrovolumperfusjonssystemet (modifisert med en borosilikatglassspiss) ble ført nær pipetten (figur 4D). Spenning ble styrt og strømmer ble målt fra kanalene i. Representative strømmer og spektra fra ANAP-merkede KATP-kanaler er vist i figur 4B, fargekodet for å matche spektrene til strømmene. Emisjonsspektra ble korrigert for bakgrunn og bleking som for membraner uten tak.

Figure 1
Figur 1: ANAP og TNP-ATP utgjør et passende FRET-par. (A) Strukturer av ANAP og TNP-ATP. De fluorescerende delene er uthevet. (B) Absorbans og fluorescensutslippsspektra av ANAP og TNP-ATP. Overlapping mellom ANAP-utslipp og TNP-ATP-absorbans er nødvendig for FRET. Tilpasset fra Puljung et al. (publisert under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Måling av nukleotidbinding i utaket plasmamembran. (A) Skjematisk for fremstilling av utakede plasmamembraner fra adherente celler som uttrykker et fluorescerende membranprotein. Instruksjoner er gitt for celler dyrket på poly-L-lysinbelagte eller ubehandlede dekselslipp. (B) Eksperimentelt oppsett for måling av nukleotidbinding i membraner uten tak. (C) Lyse felt- og fluorescerende bilder av en helt udekket plasmamembran avledet fra en celle som uttrykker oransje fluorescerende protein (OFP) merket KATP-kanaler. Stjernen markerer posisjonen til membranen, som er nesten usynlig i lysfeltbildet. OFP ble begeistret med en bred 565 nm LED gjennom et 531/40 nm båndpassfilter og 562 nm kantdikroisk og avgitt lys ble samlet inn gjennom et 593/40 nm båndpassfilter. (D) Lyse felt- og fluorescerende bilder av et delvis udekket membranfragment avledet fra en celle som uttrykker oransje fluorescerende protein (OFP) merket KATP-kanaler. (E) Løsningsutvekslingstidskurs anskaffet ved hjelp av oppsettet beskrevet i B. Fem tekniske replikater vises. Perfusjonssystemet med mikrovolum ble lastet med 50 μM tetrametylrhodamin-5-maleimid (TMRM). Badet ble perfundert med vann med en hastighet på ~ 0,5 ml / min. Data fra tidskursene wash-on (økende fluorescens) og utvasking (avtagende fluorescens) passet med en enkelt eksponentiell henfall av formen F = A*exp(-x/τ) + y0. Tidskonstanten (τ) for innvask var ~0,6 s. Tidskonstanten for utvasking var ~1,0 s. TMRM ble begeistret med en bred 565 nm LED gjennom et 540/25 nm båndpassfilter og 565 nm kantdikroisk og avgitt lys ble samlet inn gjennom et 605/55 nm båndpassfilter. (F) Sammenligning av fluorescensintensiteten til en 50 μM-oppløsning av TMRM påført ved bruk av mikrovolumperfusjonssystemet som i B og et stillestående bad inneholdende 50 μM TMRM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bakgrunnssubtraksjon og blekingskorreksjon. (A) Spektralbilde (romlig informasjon i y-dimensjonen, bølgelengde i x-dimensjonen) av en ikke-taket plasmamembran fra en celle som uttrykker ANAP-merkede KATP-kanaler. 5 μM TNP-ATP ble påført ved hjelp av oppsettet beskrevet i figur 2B. Den oransje boksen angir interesseområdet (ROI), tilsvarende membranen uten tak. Den grå boksen angir bakgrunnsområdet som brukes til å korrigere spekteret. (B) Emisjonsspektra avledet fra bølgelengde-for-bølgelengde-gjennomsnitt av avkastningen og bakgrunnsregioner i A. (C) Spektrum avledet ved å trekke det gjennomsnittlige bakgrunnsspekteret fra det gjennomsnittlige avkastningsspekteret i B. 5 nm-vinduet rundt ANAP-toppen som brukes til å bestemme gjennomsnittsintensiteten, vises som et grått skyggelagt område. (D) Spectra ervervet fra seks påfølgende 10-s-eksponeringer av en ikke-taket plasmamembran fra en celle som uttrykker ANAP-merkede KATP-kanaler. Legg merke til reduksjonen i fluorescens som følge av fotobleking. Innfellingen viser normalisert topp fluorescenstilpasning med en enkelt eksponentiell henfall av formen F / F max = A * exp (-t / τ) + (1-A). Symbolene i innfellingen er fargekodet for å matche spektrene. (E) Samme spektra som i D korrigert for fotobleking. Innfellingen viser normalisert toppfluorescens fra D som åpne sirkler, med korrigert toppfluorescens vist ved bruk av fylte sirkler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Samtidig måling av nukleotidbinding og kanalstrøm ved bruk av patch-clamp fluorometry (PCF). (A) Skjematisk viser eksperimentelt oppsett for måling av nukleotidbinding og ionestrøm. (B) Eksempelstrømmer (venstre) og spektra (høyre) ervervet fra et membranplaster skåret ut fra en celle som uttrykker ANAP-merkede KATP-kanaler. Strømmer ble registrert med et holdepotensial på -60 mV, digitalisert ved 20 kHz og filtrert ved 5 kHz. Det grå skyggelagte området tilsvarer bølgelengdeområdet hvorfra ANAP-intensiteten ble kvantifisert. Tilpasset fra Usher et al. (publisert under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 11. (C) Spektrum oppnådd fra et membranplaster skåret ut fra en celle som uttrykker ANAP-merkede K ATP-kanaler utsatt for 1 mM TNP-ATP. Legg merke til den negative toppen som tilsvarer bølgelengdeområdet over hvilket TNP-ATP-fluorescens observeres. Det grå skyggelagte området angir bølgelengdeområdet som brukes til å kvantifisere ANAP-fluorescens som i B. Tilpasset fra Usher et al. (publisert under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 11. (D) Lyse felt- og fluorescerende bilder av en patchpipette utsatt for 1 mM TNP-ATP. Stjernen markerer pipettens spiss. (E) Spektralbilde av samme patchpipette i 1 mM TNP-ATP. Stjernen markerer pipettens posisjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: TNP-ATP-binding til ANAP-merkede KATP-kanaler. (A) Spektrale bilder av en plasmamembran uten tak fra en celle som uttrykker ANAP-merkede K ATP-kanaler i fravær av TNP-ATP eller i nærvær av 50 μM eller 1 mM TNP-ATP. Intensiteter vises som et varmekart. (B) Bølgelengde-for-bølgelengde-gjennomsnittlig spektra fra bildene i A som viser slukking av ANAP-fluorescens av TNP-ATP. De skyggelagte områdene representerer to forskjellige båndpassfiltre som kan brukes til å måle ANAP-slukking hvis et spektrometer ikke er tilgjengelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Slokking av ANAP-merkede K ATP-kanaler medTNP-ATP i membraner uten tak og PCF. Overlegg av data fra Usher et al. (publisert under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. Data passet til Hill-ligningen: F / F max = E max + (1 - E max) / (1 + 10 (EC50 - [TNP-ATP]) * h). F er den målte fluorescensen, F max er den maksimale fluorescensen i fravær av nukleotid, Emax er den maksimale slukkingen ved mettende nukleotidkonsentrasjoner, og h er Hill-skråningen. EC50, (nukleotidkonsentrasjonen hvor slukking er halvmaksimum) og [TNP-ATP] er loggverdier. Membraner uten tak: EC50 = -4,59 (25,7 μM), h = 0,82, Emax = 0,93. PCF: EC50 = -4,11 (77,6 μM), h = 0,87, Emax = 1,00. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Vi har utviklet en metode for å måle adeninnukleotidbinding i sanntid til intakte membranproteiner. Vår metode bygger på flere andre etablerte teknikker, inkludert merking av proteiner med ANAP ved bruk av ravstoppkodonundertrykkelse12, celleavtak 14 og spenningsklemmefluorometri/PCF 19,20,21,22,23,24,25 . Syntesen av disse tilnærmingene muliggjør måling av nukleotidbinding med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Faktisk, i vårt tidligere arbeid, var vi i stand til å skille mellom forskjellige bindingssteder på samme proteinkompleks ved hjelp av denne tilnærmingen10,11. Det er viktig at denne teknikken kan brukes direkte på små mengder protein i et cellulært miljø under forhold som opprettholder proteinfunksjonen. Ved å bruke vår bindingsmetode i forbindelse med direkte, elektrofysiologisk avlesning av ionekanalstrømmer, kan vi få rik innsikt i molekylære grunnlaget for kanalgating11.

Siden spektrometre ikke er standard laboratorieutstyr, kan ANAP-intensiteten også overvåkes i relativ isolasjon ved hjelp av båndpassfiltre. Figur 5B viser spektralegenskapene til to slike filtre. 470/10 nm båndpassfilteret skjermer effektivt fluorescenssignalet fra TNP-ATP og overlapper godt med topp ANAP-fluorescens. Topptransmisjonen til dette filteret er imidlertid bare rundt 50%, noe som kan gjøre det vanskelig å oppnå gode signaler fra svake membraner (eller i utskårne membranlapper under spenningsklemme). Et annet alternativ er et 460/60 nm båndpassfilter. Det er litt mer overlapping mellom 460/60 nm-filteret og foten av TNP-ATP-utslippstoppen sammenlignet med 470/10 nm-filteret. Imidlertid har 460/60 nm båndpass en transmittans på 90-95% over et bredt spekter av ANAP-toppen, noe som forventes å øke fluorescensutslippssignalet.

ANAP er en miljøfølsom fluorofor 12,26,27. Topputslippet og kvanteutbyttet varierer avhengig av inkorporeringsstedet på proteinet av interesse og kan endres etter hvert som proteinet endrer konformasjon. Slike endringer vil være umiddelbart tydelige fra utslippsspektra, men vil ikke være like åpenbare når ANAP-intensiteten måles ved hjelp av filtre. Under alle omstendigheter er det nødvendig med hensiktsmessige kontroller for å demonstrere at fluorescenssignalet ikke varierer på grunn av endringer i lokalmiljøet rundt ANAP etter nukleotidbindingen. Kontrolleksperimenter med umerkede nukleotider kan bidra til å verifisere at eventuelle endringer i ANAP-intensitet er et resultat av FRET mellom ANAP og TNP-nukleotider. TNP-nukleotider kan binde seg ikke-spesifikt til membranene avledet fra utransfekterte celler (enten til plasmamembranen eller til innfødte membranproteiner)10. Vi kvantifiserer binding som en reduksjon i donorfluorescens, da dette signalet er spesifikt for den merkede kanalen. Vi anbefaler imidlertid å utføre ytterligere kontrolleksperimenter for hvert agonist/reseptorpar, for eksempel mutere nukleotidbindingsstedet hvis kjent, for å verifisere at endringen i donorfluorescens virkelig er et resultat av direkte binding til den merkede reseptoren11. Til slutt anbefales det å jobbe med konstruksjoner som inneholder en fluorescerende proteinkode i tillegg til ANAP-etiketten. Dette bidrar til å skille merket reseptorfluorescens fra bakgrunn/autofluorescens. Bakgrunnsfluorescens kan skilles fra ANAP ved toppen og formen til utslippsspektra10, men slike bestemmelser kan være svært vanskelige når bare filtersett brukes. I tillegg kan celler og utakede membraner som uttrykker fluorescerende reseptorer identifiseres ved hjelp av fluorescerende proteinkode uten å måtte opphisse ANAP og risikere overdreven fotobleking.

I mange av våre PCF-registreringer observerte vi en sterk negativ topp i spektrene våre ved høye TNP-ATP-konsentrasjoner (figur 4C). Denne negative toppen er en artefakt av vår bakgrunns subtraksjonsprotokoll. Figur 4D viser lysfelt- og fluorescerende bilder av en patchpipette utsatt for 1 mM TNP-ATP. En skygge på pipettespissen er tydelig, som følge av utelukkelse av TNP-ATP fra volumet av pipetteveggene, som er mest tydelig innenfor fokusplanet. Spektralbildet i figur 4E viser et mørkt bånd som svarer til denne skyggen. Når et område over eller under dette mørke båndet brukes til bakgrunnssubtraksjon, gir det en negativ topp. Det er viktig at denne toppen skjedde over et bølgelengdeområde som tilsvarer TNP-ATP-utslipp og ikke påvirket våre målinger av ANAP-slukking.

Den største begrensningen i våre eksperimenter var å oppnå tilstrekkelig plasmamembranekspresjon av ANAP-merkede konstruksjoner for å måle fluorescens. Det var generelt lettere å skaffe spektra av høy kvalitet fra membraner uten tak enn i PCF, på grunn av deres større størrelse og vår evne til raskt å skanne en hel tallerken med membraner uten tak, i motsetning til PCF hvor flekker bare kan fås en om gangen. I våre eksperimenter var dataene fra membraner uten tak og PCF-eksperimenter like, men ikke ekvivalente (figur 6) 11. Det er imidlertid ingen a priori grunn til at dette skal være en universell observasjon, da proteiner i en patchpipette kan være i en annen funksjonell tilstand enn de i membraner uten tak.

Her er det gjort forsøk på å maksimere uttrykket av våre ANAP-merkede konstruksjoner, spesielt ved å senke cellekulturtemperaturen til 33 °C10,11,16. Etter vår erfaring resulterte forsøk på å identifisere steder i proteinet der ANAP ville være en konservativ substitusjon, ikke konsekvent i konstruksjoner som uttrykte godt. Vi hadde mer suksess med systematisk skanning av hele proteinregioner for ANAP-inkorporeringssteder og screening av kandidater for overflateuttrykk10. ANAP-merkingssystemet fungerer også i Xenopus laevis-oocytter, noe som gjør det mulig å skåret ut mye større membranplaster, og dermed øke signalet til støy26,27,28.

Mens større uttrykksnivåer forventes å resultere i lysere signaler, avhenger det minste antall kanaler som kreves for å måle fluorescens av flere faktorer, inkludert fluoroforens lysstyrke, graden av fotobleking, intensiteten av eksitasjonslyset og fokusplanet. I teorien kan estimater gjøres ved å korrelere fluorescensintensiteten og kanalstrømmen som tidligere har blitt vist28,29. Påliteligheten av slike estimater krever imidlertid noe kunnskap om enkeltkanalkonduktansen og kanalens åpne sannsynlighet. I tillegg til faktorene nevnt ovenfor, vil fluorescenssignalet også bli påvirket av kanaler assosiert med vesikler eller deler av plasmamembranen som sitter fast på pipettglasset som ikke er under spenningsklemme.

Denne metoden er lett tilpasset studiet av andre nukleotidfølsomme ionekanaler. CFTR er strukturelt lik tilbehørsulfonylureareseptorunderenheten til KATP30,31. Som KATP CFTR gating styres av nukleotidbinding, noe som gjør det til et åpenbart fremtidig mål for vår metode7. Purinerge P2X-reseptorer er ionekanaler styrt av ekstracellulær ATP9. TNP-ATP fungerer som en antagonist for P2X-reseptorer32,33. Derfor vil det ikke være nyttig for å studere P2X-aktivering, selv om det kan brukes i konkurranseanalyser med P2X-agonister. Alternativt kan andre fluorescerende ATP-derivater med tilstrekkelig spektral overlapping med ANAP-utslipp brukes til å studere aktivering. Alexa-647-ATP er en fluorescerende P2X-agonist34. Den beregnede R0 mellom Alexa-647 og ANAP er ~ 85 Å, noe som betyr at direkte binding til P2X skal resultere i betydelig slukking av ANAP innlemmet i kanalen. Imidlertid vil en så lang R0 også resultere i slukking fra Alexa-647-ATP bundet til nærliggende underenheter og øker sannsynligheten for at ikke-spesifikk nukleotidbinding vil resultere i FRET. Siden ligandbindingsstedet i P2X-reseptorer er ekstracellulært, vil bindingsmålinger utføres på intakte celler, i helcellespenningsklemme eller i utvendige membranplaster. Vår metode kan også utvides til å studere binding og aktivering av elektrogene og ikke-elektrogene transportører og pumper som er avhengige av ATP for deres reaksjonssyklus, samt G-proteinkoblede P2Y-reseptorer. Til slutt, selv om vi har utviklet denne metoden for å måle adenin nukleotidbinding (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), kan den samme tilnærmingen brukes til å studere binding til nesten hvilken som helst reseptor som en egnet, fluorescerende ligand er identifisert for.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke Raul Terron Exposito for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB / R002517 / 1; MCP og FMA) og Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T75 tissue-culture treated flask StarLab CC7682-4875
0.1% w/v poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
30 mm borosilicate cover glass slips VWR 631-0174
35 mm non-treated sterile dishes CytoOne CC7672-3340
35 mm cover glass bottom dish WPI FD35-PDL-100
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 31966021
Foetal bovine serum (FBS) Gibco 10500-064
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
TrypLE select (tryosin) Gibco 12563-011 Trypsin/EDTA reagent
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14040-091
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-035
HEK293T cells ATTC CRL-3216 Used between passages 5-30
ANAP-TFA AsisChem ASIS-0014 Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM
pANAP expression plasmid Addgene Plasmid #48696 Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein
peRF1-E55D Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor
TransIT-LT1 Mirus Bio MIR 2300 Lipopolyplex transfection reagent
Thick-walled borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15
Tetramethylrhodamine-5-maleimide Sigma-Aldrich 94506
TNP-ATP Jena Bioscience NU-221L Delivered at 10 mM in water
Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope Nikon
60x water immersion objective (1.4 NA) Nikon MRD07602
4-Wavelength High-Power LED Head ThorLabs LED4D245 385/490/565/625 nm LEDs
Four-Channel LED Driver ThorLabs DC4100
390/18 nm band-pass excitation filter ThorLabs MF390-18 For ANAP excitation
400 nm long-pass emission filter ThorLabs FEL0400 For imaging ANAP spectra
416 nm edge dichroic ThorLabs MD416 For imaging ANAP spectra
460/60 nm band-pass emission filter ThorLabs MF460-60 Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
470/10 nm band-pass emission filter ThorLabs FB470-10 Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
531/40 band-pass excitation filter Brightline FF01-531/40-25 For orange fluorescent protein (OFP) excitation
540/25 nm band-pass excitation filter Chroma D540/25X For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation
562 nm edge dichroic Semrock FF562-Di03 For imaging OFP fluorescence
565 nm edge dichroic Chroma 565DC For imaging TMRM fluorescence
593/40 nm band-pass excitation filter Brightline FF01-387/11-25 For imaging OFP fluorescence
605/55 nm band-pass emission filter Chroma D605/55M For imaging TMRM fluorescence
IsoPlane-160 Imaging Spectrometer Princeton Instruments IsoPlane-160
PIXIS 400BR_eXcelon Camera Princeton Instruments PIXIS: 400BR_eXcelon
Axopatch 200B amplifier Molecular Devices Axopatch 200B-2
Digidata 1440A digitizer Molecular Devices Digidata 1440A
Probe sonicator Sonics & Materials VC-50 For unroofing
REGLO digital peristaltic pump Ismatec ISM 832 For bath perfusion
Microvolume perfusion system ALA Scientific Instruments ALA μFlow-8 For TNP-ATP perfusion
pClamp 10.6.2 Molecular Devices Recording and analysing currents
Lightfield 5.20.1507 Princeton Instruments Acquisition software for images and spectra
Matlab Mathworks For data analysis
Python 3.8.1 Python Software Foundation For data analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. Ion channels find a pathway for therapeutic success. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).
  2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
  3. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  4. Higgins, C. F., Linton, K. J. The ATP switch model for ABC transporters. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).
  5. Toyoshima, C., Cornelius, F. New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).
  6. Craven, K. B., Zagotta, W. N. CNG and HCN channels: two peas, one pod. Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).
  7. Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).
  8. Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model. Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).
  9. Burnstock, G. Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).
  10. Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding. Elife. 8, 41103 (2019).
  11. Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry. Elife. 9, 52775 (2020).
  12. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  13. Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane. Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).
  14. Heuser, J. The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy. Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).
  15. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  16. Lin, C. Y., et al. Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature. PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).
  17. Usukura, J., et al. Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions. Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).
  18. Colquhoun, D. Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors. British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).
  19. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  20. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  21. Zheng, J., Zagotta, W. N. Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels. Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).
  22. Biskup, C., et al. Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels. Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).
  23. Kusch, J., et al. Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels. Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).
  24. Wu, S., et al. State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry. Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).
  25. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  26. Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).
  27. Kalstrup, T., Blunck, R. S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).
  28. Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).
  29. Liu, C., et al. Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance. Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).
  30. Hwang, T. C., et al. Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction. Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).
  31. Puljung, M. C. Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels. Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).
  32. Kasuya, G., et al. Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel. Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).
  33. Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors. Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).
  34. Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 169 ligandbinding membranprotein ionekanal nukleotid metode patchklemme fluorescens spektra reseptor
Måling av nukleotidbinding til intakte, funksjonelle membranproteiner i sanntid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Usher, S. G., Ashcroft, F. M.,… More

Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time. J. Vis. Exp. (169), e61401, doi:10.3791/61401 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter