Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mätning av nukleotidbindning till intakta, funktionella membranproteiner i realtid

Published: March 11, 2021 doi: 10.3791/61401
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Department of Chemistry and Neuroscience Program, Trinity College

Summary

Detta protokoll presenterar en metod för att mäta adeninnukleotidbindning till receptorer i realtid i en cellulär miljö. Bindning mäts som Förster-resonansenergiöverföring (FRET) mellan trinitrofenylnukleotidderivat och protein märkt med en icke-kanonisk, fluorescerande aminosyra.

Abstract

Vi har utvecklat en metod för att mäta bindning av adeninnukleotider till intakta, funktionella transmembranreceptorer i cellulär eller membranmiljö. Denna metod kombinerar uttryck av proteiner märkta med den fluorescerande icke-kanoniska aminosyran ANAP och FRET mellan ANAP och fluorescerande (trinitrofenyl) nukleotidderivat. Vi presenterar exempel på nukleotidbindning till ANAP-märkta KATP-jonkanaler mätt i plasmamembran utan tak och utskurna, inifrån och ut membranfläckar under spänningsklämma. Det senare möjliggör samtidiga mätningar av ligandbindning och kanalström, en direkt avläsning av proteinfunktionen. Databehandling och analys diskuteras utförligt, tillsammans med potentiella fallgropar och artefakter. Denna metod ger rika mekanistiska insikter i den ligandberoende grinden av KATP-kanaler och kan lätt anpassas till studier av andra nukleotidreglerade proteiner eller någon receptor för vilken en lämplig fluorescerande ligand kan identifieras.

Introduction

Flera viktiga klasser av protein regleras direkt genom ligandbindning. Dessa sträcker sig från lösliga enzymer till membraninbäddade proteiner inklusive receptortyrosinkinaser, G-proteinkopplade receptorer (GPCR) och jonkanaler. GPCR och kanaler står för ~34% respektive ~15% av alla nuvarande narkotikamål, respektive 1,2. Därför finns det ett stort biokemiskt såväl som medicinskt intresse för att utveckla metoder som ger mekanistiska insikter i ligand-receptorinteraktioner. Traditionella metoder för mätning av ligandbindning, inklusive fotoaffinitetsmärkning och radioligandbindningsstudier, kräver stora mängder delvis renat protein och utförs vanligtvis under icke-fysiologiska förhållanden och tidsskalor. En idealisk metod skulle kräva endast små mängder protein, skulle kunna utföras på intakta proteiner uttryckta i en cellulär eller membranmiljö, skulle kunna övervakas i realtid och skulle vara kompatibel med direkta avläsningar av proteinfunktion.

Förster resonance energy transfer (FRET) är en metod som detekterar närheten mellan två fluorescerande märkta molekyler3. FRET uppstår när en exciterad donatorfluorofor överför energi på ett icke-strålningssätt till en acceptormolekyl (vanligtvis en annan fluorofor). Energiöverföring resulterar i släckning av givarens fluorescensemission och sensibilisering av acceptoremissionen (om acceptorn är en fluorofor). Överföringseffektiviteten är beroende av den 6: e effekten av avståndet mellan givaren och acceptorn. Dessutom måste givaren och acceptorn vara i närheten (vanligtvis mindre än 10 nm) för att FRET ska kunna inträffa. Som sådan kan FRET utnyttjas för att mäta den direkta bindningen mellan en fluorescerande märkt proteinreceptor och en fluorescerande ligand.

Flera olika proteiner regleras eller aktiveras genom att binda intracellulära eller extracellulära adeninnukleotider (ATP, ADP, AMP, cAMP). Många transportörproteiner kräver ATP-hydrolys för sin reaktionscykel, inklusive ATP-bindande kassetttransportörer och ATPaser av P-typ som Na+/K+-pumpen 4,5. ATP-känsliga K + (KATP) kanaler, cystisk fibros transmembran konduktansregulator (CFTR) och cyklisk-nukleotidreglerade kanaler är alla jonkanaler som är gated av bindningen av intracellulära adeninnukleotider, vilket gör dem utsökt känsliga för förändringar i cellulär metabolism och signaltransduktion 6,7,8. Purinerga P2X- och P2Y-receptorer svarar på förändringar i extracellulär ATP, som kan frisättas som en neurotransmittor eller som ett resultat av vävnadsskada9. Vi har utvecklat en FRET-baserad analys för mätning av adeninnukleotidbindning till membranproteiner i realtid. Vi har tidigare tillämpat denna metod för att studera nukleotidbindning till KATP-kanaler 10,11.

För att mäta nukleotidbindning via FRET måste ett protein av intresse först märkas med en fluorofor. Den fluorescerande etiketten måste sättas in på plats specifikt i proteinet av intresse så att den är tillräckligt nära ligandbindningsstället för att FRET ska kunna inträffa, med särskild försiktighet för att säkerställa att taggen inte påverkar proteinets övergripande struktur och funktion. För att uppnå detta använder vi en teknik som utvecklats av Chatterjee et al., med användning av bärnstensstopp-kodonundertryckning för att infoga en fluorescerande icke-kanonisk aminosyra (l-3-(6-acetylnaftalen-2-ylamino)-2-aminopropionisk; ANAP) på önskad plats12. Vi mäter nukleotidbindning som FRET mellan ANAP-märkt protein och fluorescerande, trinitrofenyl (TNP) nukleotidderivat (figur 1A). Emissionsspektrumet för ANAP överlappar absorbansspektrumet för TNP-nukleotider, ett tillstånd som är nödvändigt för att FRET ska inträffa (figur 1B). Här beskriver vi två olika typer av bindningsexperiment. I den första, nukleotidbindning till den intracellulära sidan av ANAP-märkta KATP-kanaler mäts i celler som har blivit unroofed av ultraljudsbehandling lämnar vidhäftande fragment av plasmamembran på ett glas täcka slip10,11,13,14.

I den andra metoden mäts nukleotidbindning till ANAP-märkta KATP-kanaler i en membranlapp under spänningsklämma, vilket möjliggör samtidig mätning av jonströmmar och fluorescens. Genom att kombinera dessa två experimentella tillvägagångssätt kan förändringar i bindning korreleras direkt med förändringar i kanalfunktion11. Typiska resultat, potentiella fallgropar och dataanalys diskuteras.

Protocol

1. Förberedelse av täckglas

OBS: Dessa steg måste ske i en steril vävnadsodlingshuv. Mängder ges för beredning av 10 rätter.

  1. Placera tio autoklaverade, 30 mm borosilikattäckglas glider individuellt i tio 35 mm obehandlade sterila skålar och skölj en gång med 2 ml sterilt, destillerat vatten.
  2. Späd 1 ml 0,1% w/v poly-L-lysinlösning i sterilt, destillerat vatten till en total volym på 10 ml (slutlig koncentration på 0,01% vikt/volym). Blanda väl, pipettera sedan 1 ml på varje täcke och inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter.
  3. Aspirera poly-L-lysin och tvätta varje täckglas två gånger med minst 2 ml sterilt destillerat vatten. Låt stå tills det är helt torrt, dvs minst 3 timmar.

2. Sådd HEK-293T-celler

OBS: Dessa steg måste ske i en vävnadsodlingshuv. HEK-293T-celler valdes för sin låga nuvarande bakgrund och lätthet att växa i odling. Detta protokoll kan anpassas till andra celltyper.

  1. Skölj en 80-90% sammanflytande T75-kolv HEK-293T-celler en gång med 12 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innan du inkuberar med 2 ml trypsin i 2-5 minuter, eller tills cellerna är helt fristående och nästan helt dissocierade.
  2. Resuspendera cellerna genom att tillsätta 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin. Pipettera försiktigt mot kolvens botten för att bryta upp kvarvarande cellklumpar.
  3. Tillsätt 2 ml kompletterad DMEM till önskat antal 35 mm skålar med belagda täckglas. Tillsätt 100 μL återsuspenderade celler till varje skål. Inkubera över natten vid 37 °C.

3. Transfektion

OBS: Dessa steg måste ske i en vävnadsodlingshuv. Mängder ges för transfektion av 10 rätter. För platsspecifik ANAP-inkorporering måste DNA-kodonet på den plats som är avsedd för märkning ersättas med det gula (TAG) stoppkodonet. Denna konstruktion samtransfekteras med två plasmider: pANAP och peRF1-E55D12,15. pANAP kodar för flera kopior av ett ANAP-specifikt tRNA/tRNA-syntetaspar. I närvaro av ANAP producerar transfektion av denna plasmid tRNA laddat med ANAP som känner igen det gula stoppkodonet. peRF1-E55D kodar för en dominant negativ ribosomal frisättningsfaktor som ökar utbytet av ANAP-märkt protein i full längd.

  1. Förbered ett 1,5 ml rör med 10 μg pANAP, 10 μg peRF1-E55D och DNA för konstruktionen avsedd för märkning med ANAP. Häll till en slutlig volym på 500 μl med okompletterad DMEM.
  2. Bered 3 μl lipidbaserat transfektionsreagens (se materialtabell) i ett separat rör för varje 1 μg DNA och bringa till en slutlig volym på 500 μl med okompletterat DMEM.
  3. Kombinera DNA- och transfektionsreagensblandningarna i ett enda rör och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
  4. Tillsätt 400 μl av 1 mM ANAP-stammen (trifluoracetatsalt i 30 mM NaOH) till 20 ml kompletterat DMEM för en slutlig koncentration på 20 μM ANAP. Byt ut det gamla mediet från de pläterade cellerna med 2 ml ANAP-innehållande media per skål.
  5. Pipettera 10% av DNA-transfektionsblandningen på varje maträtt. Inkubera vid 33 °C i 2–4 dagar före experimenten. Inkubation vid 33 °C saktar ner celldelningen och ökar proteinutbytet per cell16.

4. Experiment med otäckt membran

  1. Använd ett par pincett för att bryta en täckslip med transfekterade celler i mindre fragment.
  2. Följ en av procedurerna nedan för att ta bort takceller.
    1. Om du använder förbelagda täckglas, skölj ett fragment med PBS och placera det sedan på botten av en 35 mm skål som innehåller 2 ml PBS. Kort sonikat med hjälp av en sond sonicator (50 W, 20% -40% amplitud, 3 mm sond) placerad 3-5 mm ovanför provet för att unroof celler och lämna vidhäftande plasmamembranfragment (Figur 2A, C).
      OBS: Sonicator kraft, varaktighet och sondhöjd över provet kan alla varieras för att få ett högt utbyte av otäckta membran utan att helt denudera täckglaset.
    2. Om du inte använder förbelagda täckglas, skölj ett täckfragment med PBS och doppa sedan in i ett rör som innehåller 0,1% w / v poly-L-lysin i ~ 30 s innan kort ultraljudsbehandling (som i steg 4.2.1) för att lossa takceller och lämna efter plasmamembranfragment utan tak / delvis utan tak (figur 2A, C, D). Kortvarig exponering för poly-L-lysin har visat sig förbättra följsamheten till täckglaset13.
  3. Placera det ultraljudsbehandlade fragmentet i en täckglasbotten 35 mm skål innehållande 2 ml badlösning och montera på ett inverterat mikroskop utrustat med ett högt NA, 60x vattennedsänkningsmål. Mikroskopets kameraport är ansluten till en spektrograf i serie med en högkänslig CCD-kamera. Analysera badkammaren (0,5 – 1 ml/min) med buffert med hjälp av en peristaltisk pump. Buffertens sammansättning varierar beroende på proteinet som studeras.
    OBS: Om användaren inte har tillgång till ett objektiv med långt arbetsavstånd kan det vara omöjligt att fokusera på de otäckta membranfragmenten på grund av den extra höjden på täckglidningen. Ett alternativ är att fröceller direkt på skålar med poly-L-lysinglasbottnar (se materialtabell för ett exempel). Detta kommer också att minska potentiella avvikelser i bilden i samband med fokusering genom två glasbitar. Dessa avvikelser påverkar inte formen på de förvärvade spektra.
  4. Identifiera membranfragment utan tak som uttrycker den ANAP-märkta kanalen genom att leta efter kanalfluorescens (figur 2C, D).
    OBS: Det rekommenderas att använda en extra fluorescerande etikett (där emissionsspektrumet kan särskiljas från ANAP-emissionsspektrumet) för att identifiera membran utan tak som innehåller proteinet av intresse. Experimenten i figur 2C,D utfördes på ANAP-märkta kanaler med C-terminala fluorescerande proteintaggar.
  5. Koppla delvis in spektrometernmasken (höj ~ 10%) mellan kameraporten på mikroskopet och spektrografen. Maskens skugga visas på kamerabilden. Rikta in det otäckta membranet med spektrometernmasken genom att justera mikroskopsteget. Skaffa ett ljusfält och fluorescensbild av det otäckta membranet. Dessa kommer att användas för att välja en region av intresse för analys.
  6. För spetsen på mikrovolymperfusionssystemet nära det otäckta membranet.
    OBS: För att minska bakgrundsfluorescensen ersattes utflödet av perfusionssystemet med en anpassad spets gjord av borosilikatglas.
  7. För att avbilda fluorescensspektra, excitera membranet med en 385 nm LED genom ett 390/18 nm bandpassexcitationsfilter och en 416 nm kantdikroikum. Samla upp avgivet ljus genom ett 400 nm långpassfilter (figur 2B).
  8. Koppla in spektrometern och se till att det utsända ljuset passerar igenom. Koppla in spektrometerns galler (300 spår/mm). Med gallren på plats kommer ljuset som diffrakteras av spektrometern att projiceras på CCD-kamerans chip för att producera spektralbilder (figur 3A). Dessa bilder behåller rumslig information i y-dimensionen . X-dimensionen ersätts med våglängd.
  9. Valfritt, om proteinet av intresse är märkt med ett fluorescerande protein, skaffa en spektralbild av det fluorescerande proteinet med lämplig filteruppsättning.
  10. Ta en eller flera 0,1-10 s exponeringar i början av experimentet medan du perfuserar nukleotidfri buffertlösning. Dessa kommer att användas för att korrigera och normalisera data under resten av experimentet (se avsnitt 5 nedan).
    OBS: Valet av exponeringstid beror på den uppnådda uttrycksnivån, fluoroforens ljusstyrka och optiken. Exponeringstid bör väljas för att maximera signalen och minimera den observerade blekningshastigheten. Det exponeringstidsintervall som anges i 4.10 är lämpligt för jämviktsbindningsmätningar men kan vara användbart för att mäta långsammare kinetiska förändringar10. Möjligheten att använda korta exponeringstider för att spåra snabbare kinetik kommer att begränsas av proteinuttrycksnivåer och fotoblekning, snarare än hårdvara.
  11. Applicera ett intervall av koncentrationer av TNP-ATP (vanligtvis beredd i badlösning) för att upprätta en koncentrations-responskurva. Perfusera varje lösning i minst 1 minut för att säkerställa att ett stabilt tillstånd uppnås och tvätta ut varje koncentration med badlösning i minst 1 min.
    OBS: Det är viktigt att säkerställa att perfusionssystemet snabbt kan nå jämvikt (figur 2E) och uppnå rätt lokal koncentration av TNP-ATP (figur 2F).
  12. Ta en exponering (med samma varaktighet som i steg 4.10) vid varje koncentration och i slutet av varje washout.

5. Spektral analys

Dessa instruktioner är skrivna för användning med analyskoden "pcf.m", som finns på GitHub. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. Ytterligare och alternativ kod finns på https://github.com/smusher/KATP_paper_201911. Vi har beskrivit de operationer som utförs av programvaran här så att användaren kan skapa sin egen kod eller välja att analysera data manuellt.

  1. Starta analysprogrammet genom att skriva programmets namn ("pcf") på kommandoraden.
  2. När en öppen fil/mapp-dialogruta öppnas med uppmaningen: "Välj filer för ROI", välj filnamnen som är associerade med ljusfälts- och fluorescensbilderna för det otäckta membranet. En uppmaning visas på kommandoraden för att skriva namnet på utdatafilen.
  3. Skriv filnamnet och tryck enter.
  4. När programvaran visar ljusfälts- och fluorescensbilderna väljer du ett område av intresse (ROI) i spektralbilden som motsvarar placeringen av det otäckta membranfragmentet eller den utskurna lappen (se avsnitt 6) enligt programvaruanvisningarna. Välj ett bakgrundsområde i samma spektralbild (som representerar samma våglängdsområde som i ROI) som motsvarar en sektion av täckplåt eller skål utan membran fäst (figur 3A). Programvaran uppmanar att klicka på toppen av ROI och tryck på Enter, klicka längst ner på ROI och tryck på Enter och upprepa sedan denna process för bakgrundsregionen.
  5. När en öppen fil/mapp öppnas med uppmaningen: "Välj fil för FP-spektrum", välj filnamnet som är associerat med fluorescerande proteinspektrum (FP) (valfritt steg 4.9). Om inget FP-spektrum förvärvades väljer du en annan spektrumfil. FP-spektrumet fungerar som kvalitetskontroll för att skilja mellan märkt protein och bakgrundsfluorescens.
  6. När en öppen fil/mapp öppnas med prompten: "Välj filer för analys", välj alla filer som motsvarar ANAP-spektra (från steg 4.10 till 4.12), inklusive de filer som behövs för blekningskorrigering.
  7. När en öppen fil/mapp-dialogruta öppnas med prompten: "Välj filer för blekningsinsamling", välj den delmängd av filerna från steg 5.6 som motsvarar initiala spektra förvärvade i nukleotidfri lösning i början av experimentet eller spektra som förvärvats under tvättar i nukleotidfri lösning som ska användas för korrigering (från steg 4.10 till 4.12).
  8. Linjemedelvärde för varje bild för att producera spektra, dvs genomsnittlig intensitet för alla pixlar i y-dimensionen av en ROI eller bakgrundsregion vid varje våglängd. (Figur 3B). Subtrahera det resulterande genomsnittliga bakgrundsspektrumet från det genomsnittliga spektrumet som förvärvats från ROI för att avlägsna bakgrundsfluorescens och fluorescens från obundet TNP-ATP (figur 3C). Dessa steg utförs automatiskt av programvaran.
  9. Bestäm ANAP-intensiteten för varje exponering genom att beräkna medelvärdet av intensiteten för ett 5 nm-fönster centrerat kring ANAP-toppen för de subtraherade spektra (vanligtvis ~ 470 nm men kan variera beroende på den lokala mikromiljön för ANAP-resten).
    OBS: Figur 3D visar 6 spektra erhållna från på varandra följande 10 s exponeringar av ett otäckt membranfragment som uttrycker ANAP-märkta kanaler. Infällningen visar den genomsnittliga intensiteten för toppen av varje spektrum. Programvaran hittar automatiskt toppvåglängden i det första förvärvade spektrumet och använder detta värde hela tiden. Intensiteten beräknas automatiskt av programvaran.
  10. Normalisera ANAP-intensiteterna för varje experiment genom att dividera ANAP-intensiteten för en given exponering (F) med ANAP-intensiteten för den första exponeringen i tidsserien, som togs i steg 4.10 (Fmax). Återigen utför programvaran dessa beräkningar automatiskt.
  11. Utför stegen nedan för att hämta data.
    1. För att korrigera för ANAP-fotoblekning, passa först ett enda exponentiellt sönderfall, (F / Fmax) = A * exp (-t / τ) + (1-A), där t är den kumulativa exponeringstiden, τ är tidskonstanten och A är amplituden) till antingen de mellanliggande tvättstegen mellan TNP-ATP-applikationer eller till flera initiala exponeringar som tagits före tvätt på TNP-ATP (figur 3D, infälld).
      OBS: Programvaran kommer att visa denna passform och uppmanas att acceptera eller avvisa den. Om passformen avvisas kommer en annan möjlighet att välja filer för blekningskorrigering.
    2. Dela de normaliserade (i steg 5.10) ANAP-spektra med det förutsagda värdet på exponentiell anpassning från steg 5.11.1 vid varje tidpunkt (figur 3E).
      OBS: För det visade exemplet är den observerade normaliserade toppfluorescensen vid 50 s 0,65 och den förutsagda fluorescensen från exponentiell passform är 0,64. För att korrigera för blekning, dela det observerade värdet (0,65, figur 3E infälld, tom cirkel) med det förutsagda värdet (0,64, figur 3E infälld, streckad linje) för att producera det korrigerade värdet (~ 1, figur 3E infälld, färgad cirkel). Om blekningskorrigeringen är tillräcklig bör intensiteten av ANAP från all exponering som förvärvats i frånvaro av nukleotider vara ungefär lika (figur 3E). Dessa beräkningar utförs automatiskt av programvaran.
    3. Hämta utdata som en bild som plottar data och ett flikkalkylblad som innehåller råspektra, subtraherade spektra, spektra korrigerade för fotoblekning och toppdata för varje fil så att ytterligare analys kan utföras.

6. Experiment med patch-clamp-fluorometri

  1. Dra patchpipetter från tjockväggiga borosilikatglaskapillärer till ett motstånd på 1,5 MΩ till 2,5 MΩ när de fylls med pipettlösning. Pipettlösningens sammansättning varierar beroende på proteinet som studeras.
  2. Överför en täckslip med transfekterade celler på en täckglasbotten 35 mm skål innehållande 2 ml badlösning och montera på ett inverterat mikroskop utrustat med ett högt NA, 60x vattennedsänkningsmål. Applicera badkammaren (0,5 – 1 ml/min) med badlösning med hjälp av en peristaltisk pump. När det gäller pipettlösningen varierar badlösningen beroende på proteinet som studeras.
  3. Identifiera en cell som uttrycker ANAP-märkta kanaler genom att leta efter fluorescens vid cellmembranet.
  4. Fyll en plåsterpipett med pipettlösning. Applicera försiktigt positivt tryck på pipetten och placera i badkammaren. Tryck pipetten mot cellens membran och applicera försiktig sugning för att uppnå en GΩ-tätning (figur 4A).
  5. Punktmarkera plåstret genom att snabbt flytta pipetthållaren bort från cellen (figur 4A).
    OBS: Att skära bort plåstret på detta sätt bör bilda ett inifrån och ut-plåster, med proteinets cytosoliska domäner exponerade för perfusionssystemet. Om platsen för nukleotidbindningsstället som studeras inte är cytosolisk, kommer det att vara nödvändigt att använda yttre fläckar eller helcellsinspelningar för att utföra PCF-experiment.
  6. För spetsen på plåsterpipetten nära perfusionssystemets spets och kontrollera att plåstret ligger inom spektromettermaskens slits (figur 4A).
  7. Applicera TNP-ATP och bildspektra som i steg 4.10-4.12, samtidigt som jonströmssvaret på nukleotidapplikation registreras.
    OBS: Pipettglaset kan införa rumsliga avvikelser och reflektioner i de förvärvade bilderna. Dessa avvikelser påverkar emellertid inte formen på de förvärvade spektra och reflekterat excitationsljus separeras lätt från fluorescens med hjälp av antingen spektrografen eller ett långpassemissionsfilter.
  8. Analysera spektra. Spektra avbildade från utskurna fläckar kan uppvisa översubtraktion av obunden TNP-ATP-fluorescens på grund av uteslutning av TNP-ATP från plåsterpipettens glas (figur 4C-E). Denna översubtraktion påverkar inte ANAP-emissionsspektrumet och kan därför ignoreras.
    OBS: Eftersom fluorescenssignalen i utskurna fläckar kommer att vara lägre än i membran utan tak är det viktigt att använda en exponeringstid som ger tillräckligt hög signal-till-brus utan att bleka ANAP för snabbt.

Representative Results

Figur 2 visar den grundläggande experimentella inställningen för mätning av nukleotidbindning till fluorescerande proteiner i membranfragment utan tak erhållna genom ultraljudsbehandling (Figur 2A, B). Två olika tillvägagångssätt användes för att erhålla otäckta membran, direkt odla celler på poly-L-lysinbelagda täckglas eller odla celler på obehandlat glas och exponera dem kort för poly-L-lysin (0,1% i vatten) före avtakning. Figur 2C visar ett typiskt membranfragment utan tak från en HEK-293T-cell som uttrycker KATP-kanaler märkta med orange fluorescerande protein (OFP). Membran utan tak var praktiskt taget osynliga i ljusfältsbilder och identifierades genom fluorescens av märkta membranproteiner eller genom motfärgning med ett membranfärgämne som oktadecyl rhodamin B13. Förutom otäckta membran producerade ultraljudsbehandling av HEK-293T-celler också delvis otäckta cellfragment (Figur 2D) 10,17. Dessa fragment var synliga i ljusfält. Detta kan vara resultatet av rufsiga plasmamembran som bara är dåligt vidhäftande mot täckglaset. Alternativt kan dessa fragment innehålla vesiklar och membran från intracellulära organeller. Som sådan är det att föredra att endast skaffa bilder från "sanna" membran utan tak, eftersom märkt målprotein associerat med intracellulära membran kan återspegla mellanliggande stadier av posttranslationell bearbetning och montering. Odling av celler på poly-L-lysinbelagt glas rekommenderas eftersom detta resulterade i ett högre utbyte av "sanna" otakade membran vid ultraljudsbehandling.

Ett mikrovolymperfusionssystem applicerades på fluorescerande nukleotider för att minimera de kvantiteter som behövs i ett typiskt experiment (figur 2B). Den medföljande polyimidbelagda glasspetsen ersattes med en handdragen borosilikatglasspets i vår perfusionsuppsättning, vilket minskade fluorescensbakgrunden. För att minimera nukleotidackumulering runt de otäckta membranen som avbildades, perfuserades hela badkammaren långsamt med buffert. Som sådan ville vi mäta hastigheten på lösningsförändringen från vårt mikrovolymperfusionssystem och verifiera att vi kunde uppnå den avsedda ligandkoncentrationen i vår intresseregion, dvs att liganden från vårt perfusionssystem inte späddes direkt i badmediet innan den nådde det otäckta membranet. För att kontrollera dessa möjligheter mättes in- och ursköljning av en 50 μM lösning av tetrametylrodamin-5-maleimid (TMRM) från vårt mikrovolymperfusionssystem riktat mot ytan av en täckglasbottenskål perfuserad med vatten (figur 2E). Lösningens utbyteskinetik var reproducerbar och väl beskriven av ett enda exponentiellt sönderfall med tidskonstanter mindre än 1 s för både in- och urtvättning. Sådana lösningsutbytestider begränsar vår förmåga att mäta kinetiken för ligandbindning och obindning i vår nuvarande installation. För att verifiera att vi kunde uppnå önskad ligandkoncentration vid ytan av täckglidningen jämförde vi fluorescensintensiteten på 50 μM TMRM som levererades till täckglidningen av vårt mikrovolymperfusionssystem med 50 μM TMRM i ett stillastående bad (figur 2F). Ingen skillnad i intensitet observerades, vilket verifierade att lämpliga ligandkoncentrationer vid ytan av täckglidningen med vårt mikrovolymperfusionssystem kan uppnås, även när badet är perfuserat.

Figur 3A visar en spektralbild erhållen från ANAP-märkta KATP-kanaler i ett otäckt membran från en HEK-239T-cell exponerad för 5 μM TNP-ATP. För att erhålla sådana bilder riktades utsänt ljus från det otäckta membranet genom en spektrometer i serie med en CCD-kamera. Den utsända fluorescensen diffrakterades från galler och projicerades på kamerachipet och producerade spektra. De resulterande bilderna behåller rumslig information i y-dimensionen , men x-dimensionen ersattes med våglängden. Intresseområdet (ROI), som motsvarar det otäckta membranet, är skisserat i orange. Två regioner med hög intensitet är tydliga i bilden, vilket motsvarar topputsläppet av ANAP och TNP-ATP. Detta uppskattades bäst i våglängdsgenomsnittet (över hela ROI) -spektrumet som visas i figur 3B. Toppen ~ 470 nm motsvarar ANAP införlivad i KATP; toppen ~ 535 nm motsvarar TNP-ATP. För att korrigera för bakgrundsfluorescens och direkt excitation av TNP-ATP i lösning valdes en bakgrundsregion (figur 3A, grå) från varje bild. Det genomsnittliga bakgrundsspektrumet visas i figur 3B. Det slutliga spektrumet erhölls genom att subtrahera det genomsnittliga bakgrundsspektrumet från det genomsnittliga ROI-spektrumet (figur 3C).

ANAP är benägen att fotobleka artefakter. Figur 3D visar minskningen av maximal ANAP-fluorescens efter flera exponeringar. Toppfluorescensen från flera exponeringar i frånvaro av TNP-ATP (eller från tvättar mellan koncentrationerna av TNP-ATP) anpassades till ett enexponentiellt sönderfall och detta användes för att korrigera för fotoblekningsartefakter (figur 3E). Att utföra koncentrations-responsexperiment från både låga till höga och höga till låga nukleotidkoncentrationer rekommenderas. Om blekningskorrigering inte medför några ytterligare artefakter bör resultaten vara jämförbara11.

Figur 5A visar representativa spektralbilder från ett membran utan tak erhållet från en cell som uttrycker ANAP-märkta K ATP-kanaler i frånvaro och närvaro av TNP-ATP. De korrigerade spektra visas i figur 5B. Genom att observera emissionsspektra fanns det en tydlig åtskillnad mellan givarens och acceptorns fluorescensemission. Eftersom viss icke-specifik bindning av TNP-ATP till naiva plasmamembran från otransfekterade HEK-293T-celler observerades, rekommenderas att FRET kvantifieras som en minskning av donatorns (ANAP) fluorescens10,11. Denna topp var specifik för den märkta receptorn.

För ligander som inducerar en konformationsförändring i sin receptor ger bindningsstudier isolerat inte direkt, mekanistiskt meningsfull information om ligandbindningsprocessen18. Koncentrations-responsförhållandet för ligandbindning beror inte bara på den inneboende bindningsaffiniteten, utan också den konformationsförändring som induceras av ligandbindning och receptorns inneboende benägenhet att ändra konformation i frånvaro av ligand. För att bättre förstå de processer som understryker ligand-receptorinteraktioner kan bindningsmätningar paras ihop med experiment som ger en avläsning av proteinfunktionen. För detta ändamål är jonkanaler ett idealiskt modellsystem, eftersom deras strömmar kan mätas med sub-ms tidsupplösning ner till enmolekylnivå med spänningsklämma. Historiskt sett har parade ström- och fluorescensmätningar gett betydande insikter i öppning och stängning (gating) av spännings- och ligandstyrda jonkanaler 19,20,21. Experiment har utförts för att samtidigt mäta jonströmmar och fluorescerande cyklisk nukleotidbindning till olika cykliska nukleotidreglerade kanaler22,23,24. Dessa studier använde en ligand som ökade dess kvantutbyte vid bindning. Fluorescens från obunden ligand i lösningsvolymen nära kompressen kan subtraheras genom avbildning av plåstren med konfokalmikroskopi22,23. I våra studier mättes bindningen med hjälp av minskningen av ANAP-fluorescens. Eftersom denna signal är specifik för kanalen och FRET mellan ANAP och TNP-ATP är starkt avståndsberoende (halv maximal vid ~ 43 Å), undviks kontaminering av vår signal med icke-specifikt bundna och obundna nukleotider.

Figur 4A visar ett typiskt PCF-experiment (patch-clamp fluorometry). En hög resistanstätning (GΩ) bildades mellan en saltvattenfylld borosilikatglaspipett (ansluten till en spänningsklämförstärkare) och en cell som uttrycker ANAP-märkt KATP. Efter tätningsbildningen drogs pipetten bort från cellen, vilket möjliggjorde åtkomst till de intracellulära nukleotidbindningsställena. Pipetten placerades sedan över mikroskopmålet, centrerad på spektrometernmaskens slits och utflödet av mikrovolymperfusionssystemet (modifierat med en borosilikatglasspets) fördes nära pipetten (figur 4D). Spänningen kontrollerades och strömmar mättes från kanalerna i plåstret. Representativa strömmar och spektra från ANAP-märkta KATP-kanaler visas i figur 4B, färgkodade för att matcha spektra till strömmarna. Emissionsspektra korrigerades för bakgrund och blekning som för membran utan tak.

Figure 1
Figur 1: ANAP och TNP-ATP utgör ett lämpligt FRET-par. a) ANAP:s och TNP-ATP:s strukturer. De fluorescerande delarna är markerade. b) Absorbans- och fluorescensemissionsspektra för ANAP och TNP-ATP. Överlappning mellan ANAP-utsläpp och TNP-ATP-absorbans krävs för FRET. Anpassad från Puljung et al. (publicerad under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)10. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Mätning av nukleotidbindning i plasmamembran utan tak. (A) Schematisk för beredning av plasmamembran utan tak från vidhäftande celler som uttrycker ett fluorescerande membranprotein. Instruktioner ges för celler odlade på poly-L-lysinbelagda eller obehandlade täckglas. (B) Experimentell uppställning för mätning av nukleotidbindning i membran utan tak. (C) Ljusfält och fluorescerande bilder av ett plasmamembran utan tak härrörande från en cell som uttrycker orange fluorescerande protein (OFP) märkta KATP-kanaler. Asterisken markerar membranets position, som är nästan osynlig i ljusfältsbilden. OFP var exciterad med en bred 565 nm LED genom ett 531/40 nm bandpassfilter och 562 nm kantdikroisk och utsänt ljus samlades in genom ett 593/40 nm bandpassfilter. (D) Ljusfält och fluorescerande bilder av ett delvis taklöst membranfragment härrörande från en cell som uttrycker orange fluorescerande protein (OFP) märkta KATP-kanaler. (E) Lösningsutbytestidskurs som erhållits med hjälp av den inställning som beskrivs i B. Fem tekniska replikat visas. Mikrovolymperfusionssystemet laddades med 50 μM tetrametylrodamin-5-maleimid (TMRM). Badet perfuserades med vatten med en hastighet av ~ 0,5 ml / min. Data från tidskurerna för tvätt (ökande fluorescens) och wash-out (minskande fluorescens) passade med ett enda exponentiellt sönderfall av formen F = A*exp(-x/τ) + y0. Tidskonstanten (τ) för intvätt var ~0,6 s. Tidskonstanten för wash-out var ~1,0 s. TMRM exciterades med en bred 565 nm LED genom ett 540/25 nm bandpassfilter och 565 nm kantdikroisk och avgivet ljus samlades in genom ett 605/55 nm bandpassfilter. F) Jämförelse av fluorescensintensiteten hos en 50 μM TMRM-lösning applicerad med mikrovolymperfusionssystemet som i B och ett icke-kolsyrade bad innehållande 50 μM TMRM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Bakgrundssubtraktion och blekningskorrigering. (A) Spektralbild (rumslig information i y-dimensionen, våglängd i x-dimensionen) av ett plasmamembran utan tak från en cell som uttrycker ANAP-märkta KATP-kanaler. 5 μM TNP-ATP applicerades med den inställning som beskrivs i figur 2B. Den orange rutan anger intresseområdet (ROI), som motsvarar det otäckta membranet. Den grå rutan anger bakgrundsområdet som används för att korrigera spektrumet. (B) Emissionsspektra härledda från våglängdsmedelvärden för ROI och bakgrundsregioner i A. (C) Spektrum härlett genom att subtrahera det genomsnittliga bakgrundsspektrumet från det genomsnittliga ROI-spektrumet i B. 5 nm-fönstret runt ANAP-toppen som används för att bestämma medelintensiteten visas som ett grått skuggat område. (D) Spektra förvärvade från sex på varandra följande 10-s exponeringar av ett otäckt plasmamembran från en cell som uttrycker ANAP-märkta KATP-kanaler. Notera minskningen av fluorescens till följd av fotoblekning. Infällningen visar den normaliserade toppfluorescenspassningen med ett enda exponentiellt sönderfall av formen F/Fmax = A*exp(-t/τ) + (1-A). Symbolerna i insatsen är färgkodade för att matcha spektra. E) Samma spektra som i D korrigerat för fotoblekning. Infällningen visar den normaliserade toppfluorescensen från D som öppna cirklar, med korrigerad toppfluorescens som visas med fyllda cirklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Samtidiga mätningar av nukleotidbindning och kanalströmmar med patch-clampfluorometri (PCF). (A) Schema som visar experimentuppställningen för mätning av nukleotidbindning och jonströmmar. (B) Exempel på strömmar (vänster) och spektra (höger) förvärvade från en membranlapp som skärs ut från en cell som uttrycker ANAP-märkta KATP-kanaler. Strömmar registrerades vid en innehavspotential på -60 mV, digitaliserades vid 20 kHz och filtrerades vid 5 kHz. Det gråskuggade området motsvarar det våglängdsområde från vilket ANAP-intensiteten kvantifierades. Anpassad från Usher et al. (publicerad under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. (C) Spektrum som erhållits från ett membranplåster som skärs ut från en cell som uttrycker ANAP-märkta KATP-kanaler exponerade för 1 mM TNP-ATP. Notera den negativa toppen som motsvarar våglängdsområdet över vilket TNP-ATP-fluorescens observeras. Det grå skuggade området betecknar våglängdsområdet som används för att kvantifiera ANAP-fluorescens som i B. Anpassad från Usher et al. (publicerad under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. d) Ljusfält och fluorescerande bilder av en lapppipett exponerad för 1 mM TNP-ATP. Asterisken markerar pipettens spets. (E) Spektralbild av samma patchpipett i 1 mM TNP-ATP. Asterisken markerar pipettens position. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: TNP-ATP-bindning till ANAP-märkta KATP-kanaler. (A) Spektralbilder av ett plasmamembran utan tak från en cell som uttrycker ANAP-märkta K ATP-kanaler i frånvaro av TNP-ATP eller i närvaro av 50 μM eller 1 MM TNP-ATP. Intensiteter visas som en värmekarta. (B) Våglängd-för-våglängd-medelvärde från bilderna i A som visar släckning av ANAP-fluorescens med TNP-ATP. De skuggade områdena representerar två olika bandpassfilter som kan användas för att mäta ANAP-släckning om en spektrometer inte är tillgänglig. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Kylning av ANAP-märkta K ATP-kanaler medTNP-ATP i otäckta membran och PCF. Överlagring av data från Usher et al. (publicerad under Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)11. Data passade till Hill-ekvationen : F / F max = E max + (1 - E max) / (1 + 10 (EC50 -[TNP-ATP]) * h). F är den uppmätta fluorescensen, F max är den maximala fluorescensen i frånvaro av nukleotid, Emax är den maximala släckningen vid mättande nukleotidkoncentrationer och h är Hill-lutningen. EC50, (nukleotidkoncentrationen vid vilken släckningen är halv maximal) och [TNP-ATP] är logaritmiska värden. Membran utan tak: EC50 = -4,59 (25,7 μM), h = 0,82, Emax = 0,93. PCF: EC50 = -4,11 (77,6 μM), h = 0,87, Emax = 1,00. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Vi har utvecklat en metod för att mäta adeninnukleotidbindning i realtid till intakta membranproteiner. Vår metod bygger på flera andra etablerade tekniker inklusive märkning av proteiner med ANAP med hjälp av amber stop codon suppression 12, cell unroofing 14 och voltage-clamp fluorometry/PCF 19,20,21,22,23,24,25 . Syntesen av dessa tillvägagångssätt möjliggör mätning av nukleotidbindning med hög rumslig och tidsmässig upplösning. I vårt tidigare arbete kunde vi faktiskt skilja mellan olika bindningsställen på samma proteinkomplex med hjälp av detta tillvägagångssätt10,11. Viktigt är att denna teknik kan tillämpas direkt på små mängder protein i en cellulär miljö under förhållanden som bevarar proteinfunktionen. Genom att använda vår bindningsmetod i kombination med direkt, elektrofysiologisk avläsning av jonkanalströmmar kan vi få rika insikter i den molekylära grunden för kanalgrind11.

Eftersom spektrometrar är en icke-standardiserad laboratorieutrustning kan ANAP-intensiteten också övervakas i relativ isolering med hjälp av bandpassfilter. Figur 5B visar spektralegenskaperna hos två sådana filter. 470/10 nm bandpassfiltret skärmar effektivt ut fluorescenssignalen från TNP-ATP och överlappar väl med topp-ANAP-fluorescensen. Topptransmittansen för detta filter är dock bara cirka 50%, vilket kan göra det svårt att få bra signaler från svaga membran (eller i utskurna membranfläckar under spänningsklämma). Ett annat alternativ är ett 460/60 nm bandpassfilter. Det finns något mer överlappning mellan 460/60 nm-filtret och foten på TNP-ATP-utsläppstoppen jämfört med 470/10 nm-filtret. Emellertid har 460/60 nm bandpasset en transmittans på 90-95% över ett brett område av ANAP-toppen, vilket kan förväntas öka fluorescensemissionssignalen.

ANAP är en miljökänslig fluorofor 12,26,27. Topputsläppet och kvantutbytet varierar beroende på platsen för införlivande på proteinet av intresse och kan förändras när proteinet ändrar konformation. Sådana förändringar skulle omedelbart framgå av emissionsspektra men skulle inte vara lika uppenbara när ANAP-intensiteten mäts med filter. Under alla omständigheter krävs lämpliga kontroller för att visa att fluorescenssignalen inte varierar på grund av förändringar i den lokala miljön runt ANAP efter nukleotidbindningen. Kontrollexperiment med omärkta nukleotider kan hjälpa till att verifiera att eventuella förändringar i ANAP-intensitet är resultatet av FRET mellan ANAP- och TNP-nukleotider. TNP-nukleotider kan binda ospecifikt till membran härledda från icke-transfekterade celler (antingen till plasmamembranet eller till naturliga membranproteiner)10. Vi kvantifierar bindning som en minskning i givarens fluorescens, eftersom denna signal är specifik för den märkta kanalen. Vi rekommenderar dock att du utför ytterligare kontrollexperiment för varje agonist/receptorpar, till exempel muterar nukleotidbindningsstället om det är känt, för att verifiera att förändringen i donatorfluorescens verkligen är resultatet av direkt bindning till den märkta receptorn11. Slutligen rekommenderas att arbeta med konstruktioner som innehåller en fluorescerande proteintagg utöver ANAP-etiketten. Detta hjälper till att skilja märkt receptorfluorescens från bakgrund / autofluorescens. Bakgrundsfluorescens kan särskiljas från ANAP genom toppen och formen av emissionsspektra10, men sådana bestämningar kan vara mycket svåra när endast filteruppsättningar används. Dessutom kan celler och icke-takade membran som uttrycker fluorescerande receptorer identifieras med hjälp av det fluorescerande proteinmärket utan att behöva excitera ANAP och riskera överdriven fotoblekning.

I många av våra PCF-poster observerade vi en stark negativ topp i våra spektra vid höga TNP-ATP-koncentrationer (figur 4C). Denna negativa topp är en artefakt av vårt bakgrundssubtraktionsprotokoll. Figur 4D visar ljusfälts- och fluorescerande bilder av en patchpipett utsatt för 1 mM TNP-ATP. En skugga vid pipettspetsen är uppenbar, vilket beror på att TNP-ATP utesluts från pipettväggarnas volym, vilket är tydligast inom fokusplanet. Den spektrala bilden i figur 4E visar ett mörkt band som motsvarar denna skugga. När ett område ovanför eller under detta mörka band används för bakgrundssubtraktion ger det en negativ topp. Viktigt är att denna topp inträffade över ett våglängdsområde som motsvarar TNP-ATP-emission och påverkade inte våra mätningar av ANAP-släckning.

Den största begränsningen av våra experiment var att erhålla adekvat plasmamembranuttryck av ANAP-märkta konstruktioner för att mäta fluorescens. Det var i allmänhet lättare att förvärva högkvalitativa spektra från otäckta membran än i PCF, på grund av deras större storlek och vår förmåga att snabbt skanna en hel skål med otäckta membran, till skillnad från PCF där fläckar bara kan erhållas en i taget. I våra experiment var data från otäckta membran och PCF-experiment liknande men inte likvärdiga (figur 6)11. Det finns dock ingen anledning a priori till varför detta skulle vara en universell observation eftersom proteiner i en patchpipett kan vara i ett annat funktionellt tillstånd än de i otäckta membran.

Här har försök gjorts för att maximera uttrycket av våra ANAP-märkta konstruktioner, särskilt sänka cellodlingstemperaturen till 33 °C10,11,16. Enligt vår erfarenhet resulterade försök att identifiera platser i proteinet där ANAP skulle vara en konservativ substitution inte konsekvent i konstruktioner som uttryckte sig bra. Vi hade större framgång med att systematiskt skanna hela proteinregioner för ANAP-inkorporeringsplatser och screena kandidater för ytuttryck10. ANAP-märkningssystemet fungerar också i Xenopus laevis oocyter, vilket gör att mycket större membranplåster kan skäras ut, vilket ökar signalen till brus26,27,28.

Medan större uttrycksnivåer förväntas resultera i ljusare signaler, beror det minsta antalet kanaler som krävs för att mäta fluorescens på flera faktorer, inklusive fluoroforens ljusstyrka, graden av fotoblekning, intensiteten hos excitationsljuset och fokusplanet. I teorin kan uppskattningar göras genom att korrelera fluorescensintensiteten och kanalströmmen som tidigare visats28,29. Tillförlitligheten hos sådana uppskattningar kräver dock viss kunskap om enkanalskonduktansen och kanalens öppna sannolikhet. Förutom de faktorer som anges ovan kommer fluorescenssignalen också att påverkas av kanaler associerade med vesiklar eller delar av plasmamembranet som sitter fast vid pipettglaset som inte är under spänningsklämma.

Denna metod är lätt anpassad till studier av andra nukleotidkänsliga jonkanaler. CFTR liknar strukturellt den accessoriska sulfonureidreceptorunderenheten till KATP30,31. Liksom KATP CFTR styrs gating av nukleotidbindning, vilket gör det till ett uppenbart framtida mål för vår metod7. Purinerga P2X-receptorer är jonkanaler som styrs av extracellulär ATP9. TNP-ATP verkar som en antagonist för P2X-receptorer32,33. Därför kommer det inte att vara användbart för att studera P2X-aktivering, även om det kan användas i tävlingsanalyser med P2X-agonister. Alternativt kan andra fluorescerande ATP-derivat med tillräcklig spektral överlappning med ANAP-emission användas för att studera aktivering. Alexa-647-ATP är en fluorescerande P2X-agonist34. Den beräknade R0 mellan Alexa-647 och ANAP är ~ 85 Å, vilket innebär att direkt bindning till P2X bör resultera i betydande släckning av ANAP införlivad i kanalen. En sådan lång R0 kommer emellertid också att resultera i släckning från Alexa-647-ATP bunden till angränsande underenheter och ökar sannolikheten för att icke-specifik nukleotidbindning kommer att resultera i FRET. Eftersom ligandbindningsstället i P2X-receptorer är extracellulärt skulle bindningsmätningar utföras på intakta celler, i helcellsspänningsklämma eller i membranplåster utanför och ut. Vår metod kan också utvidgas till att studera bindning och aktivering av elektrogena och icke-elektrogena transportörer och pumpar som är beroende av ATP för sin reaktionscykel samt G-proteinkopplade P2Y-receptorer. Slutligen, även om vi har utvecklat denna metod för att mäta adeninnukleotidbindning (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), kan samma tillvägagångssätt användas för att studera bindning till praktiskt taget vilken receptor som helst för vilken en lämplig, fluorescerande ligand har identifierats.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi vill tacka Raul Terron Exposito för utmärkt teknisk hjälp. Detta arbete finansierades av forskningsrådet för bioteknik och biologiska vetenskaper (BB/R002517/1; MCP och FMA) och Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T75 tissue-culture treated flask StarLab CC7682-4875
0.1% w/v poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
30 mm borosilicate cover glass slips VWR 631-0174
35 mm non-treated sterile dishes CytoOne CC7672-3340
35 mm cover glass bottom dish WPI FD35-PDL-100
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 31966021
Foetal bovine serum (FBS) Gibco 10500-064
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
TrypLE select (tryosin) Gibco 12563-011 Trypsin/EDTA reagent
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14040-091
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-035
HEK293T cells ATTC CRL-3216 Used between passages 5-30
ANAP-TFA AsisChem ASIS-0014 Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM
pANAP expression plasmid Addgene Plasmid #48696 Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein
peRF1-E55D Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor
TransIT-LT1 Mirus Bio MIR 2300 Lipopolyplex transfection reagent
Thick-walled borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15
Tetramethylrhodamine-5-maleimide Sigma-Aldrich 94506
TNP-ATP Jena Bioscience NU-221L Delivered at 10 mM in water
Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope Nikon
60x water immersion objective (1.4 NA) Nikon MRD07602
4-Wavelength High-Power LED Head ThorLabs LED4D245 385/490/565/625 nm LEDs
Four-Channel LED Driver ThorLabs DC4100
390/18 nm band-pass excitation filter ThorLabs MF390-18 For ANAP excitation
400 nm long-pass emission filter ThorLabs FEL0400 For imaging ANAP spectra
416 nm edge dichroic ThorLabs MD416 For imaging ANAP spectra
460/60 nm band-pass emission filter ThorLabs MF460-60 Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
470/10 nm band-pass emission filter ThorLabs FB470-10 Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
531/40 band-pass excitation filter Brightline FF01-531/40-25 For orange fluorescent protein (OFP) excitation
540/25 nm band-pass excitation filter Chroma D540/25X For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation
562 nm edge dichroic Semrock FF562-Di03 For imaging OFP fluorescence
565 nm edge dichroic Chroma 565DC For imaging TMRM fluorescence
593/40 nm band-pass excitation filter Brightline FF01-387/11-25 For imaging OFP fluorescence
605/55 nm band-pass emission filter Chroma D605/55M For imaging TMRM fluorescence
IsoPlane-160 Imaging Spectrometer Princeton Instruments IsoPlane-160
PIXIS 400BR_eXcelon Camera Princeton Instruments PIXIS: 400BR_eXcelon
Axopatch 200B amplifier Molecular Devices Axopatch 200B-2
Digidata 1440A digitizer Molecular Devices Digidata 1440A
Probe sonicator Sonics & Materials VC-50 For unroofing
REGLO digital peristaltic pump Ismatec ISM 832 For bath perfusion
Microvolume perfusion system ALA Scientific Instruments ALA μFlow-8 For TNP-ATP perfusion
pClamp 10.6.2 Molecular Devices Recording and analysing currents
Lightfield 5.20.1507 Princeton Instruments Acquisition software for images and spectra
Matlab Mathworks For data analysis
Python 3.8.1 Python Software Foundation For data analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. Ion channels find a pathway for therapeutic success. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).
  2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
  3. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  4. Higgins, C. F., Linton, K. J. The ATP switch model for ABC transporters. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).
  5. Toyoshima, C., Cornelius, F. New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).
  6. Craven, K. B., Zagotta, W. N. CNG and HCN channels: two peas, one pod. Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).
  7. Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).
  8. Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model. Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).
  9. Burnstock, G. Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).
  10. Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding. Elife. 8, 41103 (2019).
  11. Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry. Elife. 9, 52775 (2020).
  12. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  13. Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane. Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).
  14. Heuser, J. The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy. Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).
  15. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  16. Lin, C. Y., et al. Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature. PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).
  17. Usukura, J., et al. Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions. Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).
  18. Colquhoun, D. Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors. British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).
  19. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  20. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  21. Zheng, J., Zagotta, W. N. Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels. Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).
  22. Biskup, C., et al. Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels. Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).
  23. Kusch, J., et al. Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels. Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).
  24. Wu, S., et al. State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry. Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).
  25. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  26. Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).
  27. Kalstrup, T., Blunck, R. S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).
  28. Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).
  29. Liu, C., et al. Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance. Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).
  30. Hwang, T. C., et al. Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction. Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).
  31. Puljung, M. C. Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels. Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).
  32. Kasuya, G., et al. Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel. Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).
  33. Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors. Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).
  34. Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 169 ligandbindning membranprotein jonkanal nukleotid metod lappklämma fluorescens spektra receptor
Mätning av nukleotidbindning till intakta, funktionella membranproteiner i realtid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Usher, S. G., Ashcroft, F. M.,… More

Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time. J. Vis. Exp. (169), e61401, doi:10.3791/61401 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter