Summary
이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.
Abstract
우리는 세포 또는 막 환경에서 손상되지 않은 기능적 막횡단 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드의 결합을 측정하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 ANAP와 형광(트리니트로페닐) 뉴클레오티드 유도체 사이에 형광 비표준 아미노산 ANAP와 FRET로 태그된 단백질의 발현을 결합합니다. 우리는 지붕이 없는 원형질막에서 측정된 ANAP 태그가 부착된 KATP 이온 채널에 대한 뉴클레오티드 결합의 예를 제시하고 전압 클램프 하에서 절제된 내부 멤브레인 패치를 제시합니다. 후자는 리간드 결합과 채널 전류를 동시에 측정하여 단백질 기능을 직접 판독할 수 있습니다. 데이터 처리 및 분석은 잠재적인 함정 및 인공물과 함께 광범위하게 논의됩니다. 이 방법은 KATP 채널의 리간드 의존성 게이팅에 대한 풍부한 기계론적 통찰력을 제공하며 다른 뉴클레오티드-조절된 단백질 또는 적합한 형광 리간드가 확인될 수 있는 임의의 수용체의 연구에 용이하게 적용될 수 있다.
Introduction
단백질의 몇 가지 중요한 부류는 리간드 결합에 의해 직접 조절됩니다. 여기에는 수용성 효소에서 수용체 티로신 키나아제, G 단백질 결합 수용체(GPCR) 및 이온 채널을 포함한 막 내장 단백질에 이르기까지 다양합니다. GPCR과 채널은 현재 모든 약물 표적의 ~34% 및 ~15%를 각각차지합니다 1,2. 따라서 리간드-수용체 상호 작용에 대한 기계론적 통찰력을 제공하는 방법을 개발하는 데 상당한 생화학적 및 의학적 관심이 있습니다. 광친화성 표지 및 방사성 리간드 결합 연구를 포함한 리간드 결합 측정을 위한 전통적인 방법은 다량의 부분적으로 정제된 단백질을 필요로 하며 일반적으로 비생리학적 조건 및 시간 척도 하에서 수행됩니다. 이상적인 방법은 소량의 단백질만 필요로 하고, 세포 또는 막 환경에서 발현되는 온전한 단백질에 대해 수행할 수 있고, 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 단백질 기능의 직접 판독과 호환됩니다.
Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 형광 태그가 부착된 두 분자3 사이의 근접성을 감지하는 방법입니다. FRET는 여기된 기증자 형광단이 비방사 방식으로 수용체 분자(일반적으로 다른 형광단)에 에너지를 전달할 때 발생합니다. 에너지 전달은 공여체 형광 방출의 소멸 및 수용체 방출의 감작을 초래합니다(수용체가 형광단인 경우). 전달 효율은 공여체와 수용체 사이의 거리의6승에 의존한다. 또한 FRET가 발생하려면 기증자와 수용자가 근접(보통 10nm 미만)에 있어야 합니다. 따라서 FRET는 형광 표지된 단백질 수용체와 형광 리간드 사이의 직접적인 결합을 측정하는 데 활용될 수 있습니다.
몇몇 상이한 단백질은 세포내 또는 세포외 아데닌 뉴클레오티드(ATP, ADP, AMP, cAMP)에 결합하여 조절되거나 활성화된다. 많은 수송체 단백질은 ATP 결합 카세트 수송체 및 Na+/K+ 펌프 4,5와 같은 P형 ATPase를 포함하여 반응 주기를 위해 ATP 가수분해를 필요로 합니다. ATP-민감성 K+ (KATP) 채널, 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절제(CFTR) 및 고리형 뉴클레오티드 조절 채널은 모두 세포내 아데닌 뉴클레오티드의 결합에 의해 개폐되는 이온 채널로, 세포 대사 및 신호 전달의 변화에 매우 민감합니다 6,7,8 . 퓨린성 P2X 및 P2Y 수용체는 세포외 ATP의 변화에 반응하며, 이는 신경전달물질로 방출되거나 조직 손상으로 인해 방출될 수 있다9. 우리는 막 단백질에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정하기 위한 FRET 기반 분석법을 개발했습니다. 우리는 이전에 KATP 채널10,11에 대한 뉴클레오티드 결합을 연구하기 위해 이 방법을 적용했습니다.
FRET를 통한 뉴클레오티드 결합을 측정하려면 먼저 관심 단백질에 형광단을 부착해야 합니다. 형광 태그는 FRET가 발생할 수 있는 리간드 결합 부위에 충분히 가깝도록 관심 단백질에 부위 특이적으로 삽입되어야 하며, 태그가 단백질의 전체 구조와 기능에 영향을 미치지 않도록 특별한 주의를 기울여야 합니다. 이를 달성하기 위해 우리는 호박색 정지 코돈 억제를 사용하여 형광 비표준 아미노산(l-3-(6-아세틸나프탈렌-2-일아미노)-2-아미노프로피온산; ANAP)를 원하는 사이트12에 배치한다. 우리는 ANAP 표지 단백질과 형광 트리니트로페닐(TNP) 뉴클레오티드 유도체 사이의 FRET로 뉴클레오티드 결합을 측정합니다(그림 1A). ANAP의 방출 스펙트럼은 FRET가 발생하는 데 필요한 조건인 TNP-뉴클레오티드의 흡광도 스펙트럼과 겹칩니다(그림 1B). 여기서는 두 가지 유형의 결합 실험에 대해 간략하게 설명합니다. 첫 번째로, ANAP 표지된 KATP 채널의 세포내 측면에 대한 뉴클레오티드 결합은 초음파 처리에 의해 지붕이 없는 세포에서 측정되어 유리 커버 슬립10,11,13,14 상에 원형질막의 부착성 단편을 남긴다.
두 번째 방법에서는 전압 클램프 하에서 멤브레인 패치에서 ANAP 표지된 KATP 채널에 대한 뉴클레오티드 결합을 측정하여 이온 전류와 형광을 동시에 측정할 수 있습니다. 이들 두 가지 실험적 접근법을 결합함으로써, 결합의 변화는 채널 함수(11)의 변화와 직접적으로 상관될 수 있다. 일반적인 결과, 잠재적 함정 및 데이터 분석에 대해 설명합니다.
Protocol
1. 커버 슬립 준비
참고: 이 단계는 멸균 조직 배양 후드에서 이루어져야 합니다. 10 가지 요리를 준비하기 위해 수량이 제공됩니다.
- 오토클레이브 30mm 붕규산 커버 유리 슬립 10개를 처리되지 않은 멸균 접시 10개에 개별적으로 넣고 멸균 증류수 2mL로 한 번 헹굽니다.
- 1% w/v 폴리-L-라이신 용액 0.1mL를 멸균된 증류수에 총 부피 10mL(최종 농도 0.01% w/v)로 희석합니다. 잘 섞은 다음 각 커버 슬립에 1mL를 피펫으로 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
- 폴리-L-라이신을 흡인하고 최소 2mL의 멸균 증류수로 각 커버 슬립을 두 번 세척합니다. 완전히 마를 때까지, 즉 최소 3시간 동안 그대로 두십시오.
2. HEK-293T 세포 파종
참고: 이러한 단계는 조직 배양 후드에서 이루어져야 합니다. HEK-293T 세포는 낮은 전류 배경과 배양 중 성장 용이성 때문에 선택되었습니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형에 적응될 수 있다.
- HEK-293T 세포의 80-90% 융합 T75 플라스크를 12mL 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 헹구고 2mL 트립신과 함께 2-5분 동안 배양하거나 세포가 완전히 분리되고 거의 완전히 해리될 때까지 헹굽니다.
- 10% 소 태아 혈청, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 10mL Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 추가하여 세포를 재현탁합니다. 플라스크 바닥에 부드럽게 피펫을 넣어 남아 있는 세포 덩어리를 부숴냅니다.
- 코팅된 커버 슬립이 포함된 원하는 수의 35mm 접시에 보충된 DMEM 2mL를 추가합니다. 각 접시에 100μL의 재현탁 세포를 추가합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
3. 형질주입
참고: 이러한 단계는 조직 배양 후드에서 이루어져야 합니다. 수량은 10 개의 접시의 형질 감염을 위해 제공됩니다. 부위 특이적 ANAP 결합의 경우, 표지를 위한 위치의 DNA 코돈은 황색(TAG) 정지 코돈으로 대체되어야 한다. 이 구축물은 2개의 플라스미드: pANAP 및 peRF1-E55D12,15로 공동-형질감염된다. pANAP는 ANAP 특이적 tRNA/tRNA 합성효소 쌍의 여러 사본을 암호화합니다. ANAP의 존재 하에서, 이 플라스미드의 형질감염은 호박색 정지 코돈을 인식하는 ANAP로 하전된 tRNA를 생성한다. peRF1-E55D는 전장 ANAP 태그 단백질의 수율을 증가시키는 우세한 음성 리보솜 방출 인자를 암호화합니다.
- ANAP로 표지하기 위한 구성물을 위해 10μg pANAP, 10μg peRF1-E55D 및 DNA가 포함된 1.5mL 튜브를 준비합니다. 보충되지 않은 DMEM으로 최종 부피 500 μL까지 가져옵니다.
- 별도의 튜브에서 각 1 μg의 DNA에 대해 3 μL의 지질 기반 형질주입 시약( 재료 표 참조)을 준비하고 보충되지 않은 DMEM으로 500 μL의 최종 부피가 되도록 합니다.
- DNA 및 형질주입 시약 혼합물을 단일 튜브에 결합하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
- 400 μL의 1 mM ANAP 스톡(30 mM NaOH 중 트리플루오로아세테이트 염)을 20 mL 보충된 DMEM에 첨가하여 최종 농도 20 μM ANAP를 갖는다. 도말된 셀의 오래된 배지를 접시당 2mL의 ANAP 함유 배지로 교체합니다.
- DNA 형질주입 혼합물의 10%를 각 접시에 피펫팅합니다. 실험 전에 33°C에서 2-4일 동안 배양합니다. 33°C에서 배양하면 세포 분열이 느려지고 세포 당 단백질 수율이 증가한다16.
4. 지붕이 없는 멤브레인 실험
- 한 쌍의 집게를 사용하여 형질감염된 세포가 있는 커버 슬립을 더 작은 조각으로 부수십시오.
- 아래 절차 중 하나에 따라 셀의 지붕을 풉니다.
- 미리 코팅된 커버 슬립을 사용하는 경우 PBS로 조각을 헹구고 2mL PBS가 들어 있는 35mm 접시 바닥에 놓습니다. 샘플 위 3-5mm에 위치한 프로브 초음파 처리기(50W, 20%-40% 진폭, 3mm 프로브)를 사용하여 간단히 초음파 처리하여 세포의 지붕을 풀고 부착된 원형질막 조각을 남깁니다(그림 2A, C).
참고: 샘플 위의 초음파 처리기 전력, 지속 시간 및 프로브 높이는 모두 커버 슬립을 완전히 훼손하지 않고 지붕이 없는 멤브레인의 높은 수율을 얻기 위해 다양할 수 있습니다. - 사전 코팅된 커버 슬립을 사용하지 않는 경우 커버 슬립 조각을 PBS로 헹구고 ~30초 동안 0.1% w/v 폴리-L-라이신이 포함된 튜브에 담근 다음 간단히 초음파 처리(4.2.1단계에서와 같이)하여 지붕을 벗기고 지붕이 없는/부분적으로 지붕이 없는 원형질막 조각을 남깁니다(그림 2A,C,D). 폴리-L-라이신에 대한 짧은 노출은 커버슬립에 대한 접착력을 향상시키는 것으로 입증되었다13.
- 미리 코팅된 커버 슬립을 사용하는 경우 PBS로 조각을 헹구고 2mL PBS가 들어 있는 35mm 접시 바닥에 놓습니다. 샘플 위 3-5mm에 위치한 프로브 초음파 처리기(50W, 20%-40% 진폭, 3mm 프로브)를 사용하여 간단히 초음파 처리하여 세포의 지붕을 풀고 부착된 원형질막 조각을 남깁니다(그림 2A, C).
- 초음파 처리 된 조각을 2mL 목욕 용액이 들어있는 커버 유리 바닥 35mm 접시에 넣고 높은 NA, 60x 침수 대물렌즈가 장착 된 도립 현미경에 장착합니다. 현미경의 카메라 포트는 고감도 CCD 카메라와 직렬로 분광기에 연결됩니다. 연동 펌프를 사용하여 완충액으로 욕조 챔버(0.5 – 1mL/분)를 관류합니다. 완충액의 조성은 연구 중인 단백질에 따라 달라집니다.
알림: 사용자가 작동 거리가 긴 대물렌즈에 접근할 수 없는 경우 커버 슬립의 추가 높이로 인해 지붕이 없는 멤브레인 조각에 초점을 맞추지 못할 수 있습니다. 대안은 폴리-L-라이신 유리 바닥이 있는 접시에 세포를 직접 시드하는 것입니다(예를 들어 재료 표 참조). 이렇게 하면 두 개의 유리를 통해 초점을 맞추는 것과 관련된 이미지의 잠재적인 수차도 줄어듭니다. 이러한 수차는 획득된 스펙트럼의 모양에 영향을 미치지 않습니다. - 채널 형광을 찾아 ANAP 표지 채널을 발현하는 지붕이 없는 멤브레인 조각을 식별합니다(그림 2C,D).
참고: 관심 단백질이 포함된 지붕이 없는 막을 식별하는 데 도움이 되도록 추가 형광 라벨(방출 스펙트럼이 ANAP 방출 스펙트럼과 구별되는 경우)을 사용하는 것이 좋습니다. 그림 2C,D 의 실험은 C-말단 형광 단백질 태그가 있는 ANAP 표지 채널에서 수행되었습니다. - 현미경의 카메라 포트와 분광기 사이에 분광계 마스크를 부분적으로 맞춥니다(~10% 올림). 마스크의 그림자가 카메라 이미지에 나타납니다. 현미경 s를 조정하여 지붕이 없는 멤브레인을 분광계 마스크에 맞춥니다.tage. 지붕이 없는 멤브레인의 명시야 및 형광 이미지를 획득합니다. 분석을 위해 관심 영역을 선택하는 데 사용됩니다.
- 마이크로볼륨 관류 시스템의 끝을 지붕이 없는 멤브레인에 가까이 가져옵니다.
참고: 배경 형광을 줄이기 위해 관류 시스템의 유출을 붕규산 유리로 만든 맞춤형 팁으로 교체했습니다. - 형광 스펙트럼을 이미지화하려면 390/18nm 대역 통과 여기 필터와 416nm 에지 이색성을 통해 385nm LED로 멤브레인을 여기시킵니다. 400nm 롱패스 방출 필터를 통해 방출된 빛을 수집합니다(그림 2B).
- 분광계 마스크를 끼우고 방출된 빛이 통과하는지 확인합니다. 분광계 격자(300홈/mm)를 맞춥니다. 격자가 제자리에 있으면 분광계에 의해 회절된 빛이 CCD 카메라의 칩에 투사되어 스펙트럼 이미지를 생성합니다(그림 3A). 이러한 이미지는 y 차원의 공간 정보를 유지합니다. x 차원은 파장으로 대체됩니다.
- 선택적으로, 관심 단백질이 형광 단백질로 태그되는 경우, 적절한 필터 세트를 사용하여 형광 단백질의 스펙트럼 이미지를 획득합니다.
- 뉴클레오티드가 없는 완충 용액을 관류하는 동안 실험 시작 시 0.1-10초 이상 노출됩니다. 이는 실험의 나머지 부분에서 데이터를 수정하고 정규화하는 데 사용됩니다(아래 섹션 5 참조).
알림: 노출 시간의 선택은 달성된 발현 수준, 형광단의 밝기 및 광학 장치에 따라 달라집니다. 신호를 최대화하고 관찰된 표백 속도를 최소화하려면 노출 시간을 선택해야 합니다. 4.10에 주어진 노출 시간 범위는 평형 결합 측정에 적합하지만, 느린 운동 변화를 측정하는 데는 유용할 수 있다(10). 짧은 노출 시간을 사용하여 더 빠른 동역학을 추적하는 기능은 하드웨어가 아닌 단백질 발현 수준과 광표백에 의해 제한됩니다. - 농도-반응 곡선을 설정하기 위해 다양한 농도의 TNP-ATP(일반적으로 수조액에서 준비됨)를 적용합니다. 각 용액을 최소 1분 동안 관류하여 정상 상태에 도달하도록 하고 최소 1분 동안 수조 용액으로 각 농도를 씻어냅니다.
참고: 관류 시스템이 빠르게 평형에 도달하고(그림 2E) TNP-ATP의 정확한 국소 농도를 달성할 수 있도록 하는 것이 중요합니다(그림 2F). - 각 농도와 각 세척이 끝날 때 노출(4.10단계에서 사용한 것과 동일한 기간)을 취합니다.
5. 스펙트럼 분석
참고: 이 지침은 GitHub에서 찾을 수 있는 분석 코드 "pcf.m"과 함께 사용하도록 작성되었습니다. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. 추가 및 대체 코드는 https://github.com/smusher/KATP_paper_201911에서 찾을 수 있습니다. 사용자가 자신의 코드를 만들거나 데이터를 수동으로 분석하도록 선택할 수 있도록 여기에서 소프트웨어가 수행하는 작업을 설명했습니다.
- 명령행에 프로그램 이름("pcf")을 입력하여 분석 프로그램을 시작하십시오.
- "Select files for ROI(ROI에 사용할 파일 선택)"라는 메시지와 함께 파일/폴더 열기 대화 상자가 열리면 지붕이 없는 멤브레인의 명시야 및 형광 이미지와 관련된 파일 이름을 선택합니다. 명령줄에 출력 파일의 이름을 입력하라는 프롬프트가 나타납니다.
- 파일 이름을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
- 소프트웨어가 명시야 및 형광 이미지를 표시할 때 소프트웨어 프롬프트에 따라 지붕이 없는 멤브레인 조각 또는 절제된 패치(섹션 6 참조)의 위치에 해당하는 스펙트럼 이미지에서 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 멤브레인이 부착되지 않은 커버 슬립 또는 접시 섹션에 해당하는 동일한 스펙트럼 이미지(ROI와 동일한 파장 범위를 나타냄)에서 배경 영역을 선택합니다(그림 3A). 소프트웨어는 ROI의 상단을 클릭하고 Enter 키를 누르고, ROI의 하단을 클릭하고, Enter 키를 누른 다음 배경 영역에 대해 이 프로세스를 반복하라는 메시지를 표시합니다.
- "Select File for FP Spectrum(FP 스펙트럼용 파일 선택)" 프롬프트와 함께 파일/폴더 열기 대화 상자가 열리면 형광 단백질(FP) 스펙트럼과 관련된 파일 이름을 선택합니다(4.9단계 선택 사항). FP 스펙트럼을 획득하지 못한 경우 다른 스펙트럼 파일을 선택합니다. FP 스펙트럼은 태그가 부착된 단백질과 배경 형광을 구별하기 위한 품질 관리 역할을 합니다.
- "Select Files for Analyis"라는 메시지와 함께 열린 파일/폴더 대화 상자가 열리면 표백제 보정에 필요한 파일을 포함하여 ANAP 스펙트럼에 해당하는 모든 파일(4.10-4.12단계)을 선택합니다.
- 프롬프트와 함께 파일/폴더 열기 대화 상자가 열리면 "표백 수집을 위한 파일 선택", 실험 시작 시 뉴클레오티드가 없는 용액에서 획득한 초기 스펙트럼 또는 뉴클레오티드가 없는 용액에서 세척하는 동안 획득한 스펙트럼에 해당하는 5.6단계의 파일 하위 집합을 선택하여 보정에 사용합니다(단계 4.10에서 4.12까지).
- 스펙트럼을 생성하기 위해 각 이미지를 라인 평균화, 즉 각 파장에서 ROI 또는 배경 영역의 y 차원에 있는 모든 픽셀의 강도를 평균화합니다. (그림 3B). ROI에서 획득한 평균 스펙트럼에서 결과 평균 배경 스펙트럼을 빼서 결합되지 않은 TNP-ATP에서 배경 형광 및 형광을 제거합니다(그림 3C). 이러한 단계는 소프트웨어에 의해 자동으로 수행됩니다.
- 뺄셈된 스펙트럼의 ANAP 피크를 중심으로 한 5nm 창의 강도를 평균화하여 각 노출에 대한 ANAP 강도를 결정합니다(일반적으로 ~470nm이지만 ANAP 잔류물의 국소 미세 환경에 따라 다를 수 있음).
참고: 그림 3D 는 ANAP 태그가 지정된 채널을 발현하는 지붕이 없는 막 조각의 연속 10초 노출에서 얻은 6개의 스펙트럼을 보여줍니다. 삽입물은 각 스펙트럼 피크의 평균 강도를 보여줍니다. 소프트웨어는 획득한 첫 번째 스펙트럼에서 피크 파장을 자동으로 찾고 이 값을 전체적으로 사용합니다. 강도는 소프트웨어에 의해 자동으로 계산됩니다. - 주어진 노출의 ANAP 강도(F)를 시계열의 첫 번째 노출의 ANAP 강도로 나누어 각 실험에 대한 ANAP 강도를 정규화하고, 이는 4.10단계(Fmax)에서 취했습니다. 다시 말하지만, 소프트웨어는 이러한 계산을 자동으로 수행합니다.
- 아래 단계를 수행하여 데이터를 가져옵니다.
- ANAP 광표백을 보정하려면 먼저 단일 지수 붕괴(F/Fmax) = A*exp(-t/τ)+(1-A)를 피팅합니다. 여기서 t는 누적 노출 시간, τ는 시간 상수, A는 진폭)을 TNP-ATP 적용 사이의 중간 세척 단계 또는 TNP-ATP에서 세척하기 전에 수행한 다중 초기 노출에 맞춥니다(그림 3D, 삽입).
알림: 소프트웨어는 이 적합을 표시하고 수락 또는 거부하라는 메시지를 표시합니다. 피팅이 거부되면 표백 보정을 위해 파일을 선택할 수 있는 또 다른 기회가 제공됩니다. - 정규화된(단계 5.10에서) ANAP 스펙트럼을 각 시점에서 단계 5.11.1로부터의 지수 피팅의 예측값으로 나눕니다(도 3E).
참고: 표시된 예의 경우 50초에서 관찰된 정규화된 피크 형광은 0.65이고 지수 적합치에서 예측된 형광은 0.64입니다. 표백을 수정하려면 관찰 값(0.65, 그림 3E 삽입, 빈 원)을 예측 값(0.64, 그림 3E 삽입, 점선)으로 나누어 수정된 값(~1, 그림 3E 삽입, 컬러 원)을 생성합니다. 표백 보정이 적절한 경우 뉴클레오티드가 없는 상태에서 획득한 모든 노출의 ANAP 강도는 거의 같아야 합니다(그림 3E). 이러한 계산은 소프트웨어에 의해 자동으로 수행됩니다. - 추가 분석을 수행할 수 있도록 원시 스펙트럼, 빼기 스펙트럼, 광표백을 위해 보정된 스펙트럼 및 각 파일에 대한 피크 데이터가 포함된 데이터 및 탭 스프레드시트를 플로팅하는 이미지로 출력을 얻습니다.
- ANAP 광표백을 보정하려면 먼저 단일 지수 붕괴(F/Fmax) = A*exp(-t/τ)+(1-A)를 피팅합니다. 여기서 t는 누적 노출 시간, τ는 시간 상수, A는 진폭)을 TNP-ATP 적용 사이의 중간 세척 단계 또는 TNP-ATP에서 세척하기 전에 수행한 다중 초기 노출에 맞춥니다(그림 3D, 삽입).
6. 패치 클램프 형광 측정 실험
- 피펫 용액으로 채워졌을 때 두꺼운 벽의 붕규산 유리 모세관에서 패치 피펫을 1.5MΩ에서 2.5MΩ의 저항으로 당깁니다. 피펫 용액의 조성은 연구 중인 단백질에 따라 달라집니다.
- transfection된 세포가 있는 커버 슬립을 2mL 수조 용액이 들어 있는 커버 유리 바닥 35mm 접시에 옮기고 높은 NA, 60x 침수 대물렌즈가 장착된 도립 현미경에 장착합니다. 연동 펌프를 사용하여 수조 용액으로 수조 챔버(0.5 – 1mL/분)를 관류합니다. 피펫 용액의 경우, 목욕 용액은 연구중인 단백질에 따라 달라질 것이다.
- 세포막에서 형광을 찾아 ANAP 표지 채널을 발현하는 세포를 식별합니다.
- 패치 피펫에 피펫 용액을 채웁니다. 피펫에 부드러운 양압을 가하고 욕조 챔버에 넣습니다. 피펫을 셀의 멤브레인에 대고 부드럽게 흡입하여 GΩ 밀봉을 달성합니다(그림 4A).
- 피펫 홀더를 셀에서 빠르게 이동하여 패치를 절제합니다(그림 4A).
참고: 이러한 방식으로 패치를 절제하면 단백질의 세포질 도메인이 관류 시스템에 노출되어 내부 외부 패치가 형성되어야 합니다. 연구 중인 뉴클레오티드 결합 부위의 위치가 세포질이 아닌 경우 PCF 실험을 수행하기 위해 외부 패치 또는 전체 세포 기록을 사용해야 합니다. - 패치 피펫의 끝을 관류 시스템의 끝 부분에 가까이 가져와서 패치가 분광계 마스크의 슬릿 내에 있는지 확인합니다(그림 4A).
- 4.10-4.12단계에서와 같이 TNP-ATP와 이미지 스펙트럼을 적용하면서 동시에 뉴클레오티드 적용에 대한 이온 전류 반응을 기록합니다.
참고: 피펫 유리는 획득한 이미지에 공간적 수차와 반사를 유발할 수 있습니다. 그러나 이러한 수차는 획득된 스펙트럼의 모양에 영향을 미치지 않으며 반사된 여기광은 분광기 또는 장역 통과 방출 필터를 사용하여 형광에서 쉽게 분리됩니다. - 스펙트럼을 분석합니다. 절제된 패치에서 이미지화된 스펙트럼은 패치 피펫의 유리에서 TNP-ATP가 제외되어 결합되지 않은 TNP-ATP 형광의 과도한 감산을 나타낼 수 있습니다(그림 4CE). 이 과잉 감산은 ANAP 방출 스펙트럼에 영향을 미치지 않으므로 무시할 수 있습니다.
참고: 절제된 패치의 형광 신호는 지붕이 없는 멤브레인보다 낮기 때문에 ANAP를 너무 빠르게 표백하지 않으면서 충분히 높은 신호 대 잡음비를 제공하는 노출 시간을 사용하는 것이 중요합니다.
Representative Results
그림 2는 초음파 처리에 의해 얻어진 지붕이 없는 막 조각에서 형광 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 측정하기 위한 기본 실험 설정을 보여줍니다(그림 2A, B). 지붕이 없는 멤브레인을 얻기 위해 두 가지 다른 접근 방식이 사용되었는데, 폴리-L-라이신 코팅 커버 슬립에서 세포를 직접 배양하거나 처리되지 않은 유리에서 세포를 배양하고 지붕을 제거하기 전에 폴리-L-라이신(물 중 0.1%)에 잠시 노출시켰습니다. 도 2C는 오렌지색 형광 단백질 (OFP)로 표지된KAT 채널을 발현하는 HEK-293T 세포로부터의 전형적인 지붕이 없는 막 단편을 나타낸다. 지붕이 없는 멤브레인은 명시야 이미지에서 거의 보이지 않았으며 태그가 부착된 멤브레인 단백질의 형광 또는 옥타데실 로다민B13과 같은 멤브레인 염료를 사용한 카운터 염색으로 식별되었습니다. 지붕이 없는 멤브레인 외에도 HEK-293T 세포의 초음파 처리는 부분적으로 지붕이 없는 세포 조각을 생성했습니다(그림 2D)10,17. 이 파편들은 밝은 들판에서 볼 수있었습니다. 이것은 커버 유리에만 잘 부착되지 않는 주름진 원형질막의 결과일 수 있습니다. 대안적으로, 이들 단편은 세포내 소기관으로부터의 소포 및 막을 함유할 수 있다. 이와 같이, 세포내 막과 관련된 표지된 표적 단백질이 번역 후 처리 및 조립의 중간 단계를 반영할 수 있기 때문에 "진정한" 지붕이 없는 막에서만 이미지를 획득하는 것이 바람직합니다. 폴리-L-라이신 코팅 유리에서 세포를 배양하는 것은 초음파 처리시 "진정한"지붕이없는 막의 수율이 높아짐에 따라 권장됩니다.
일반적인 실험에서 필요한 양을 최소화하기 위해 형광 뉴클레오티드에 마이크로볼륨 관류 시스템을 적용했습니다(그림 2B). 제공된 폴리이미드 코팅 유리 팁은 관류 설정에서 손으로 뽑은 붕규산 유리 팁으로 교체되어 형광 배경을 줄였습니다. 이미징되는 지붕이 없는 막 주위에 뉴클레오티드 축적을 최소화하기 위해, 전체 목욕 챔버를 완충액으로 천천히 관류시켰다. 따라서 우리는 마이크로볼륨 관류 시스템에서 용액 변화율을 측정하고 관심 영역에서 의도한 리간드 농도를 달성할 수 있는지, 즉 관류 시스템의 리간드가 지붕이 없는 멤브레인에 도달하기 전에 목욕 매체로 직접 희석되지 않았는지 확인하고자 했습니다. 이러한 가능성을 제어하기 위해 물로 관류된 커버 유리 바닥 접시의 표면을 향하는 당사의 마이크로볼륨 관류 시스템에서 테트라메틸로다민-5-말레이미드(TMRM)의 50μM 용액의 세척 및 세척을 측정했습니다(그림 2E). 용액 교환 동역학은 재현 가능하며 세척 및 세척 모두에 대해 시간 상수가 1초 미만인 단일 지수 붕괴로 잘 설명되었습니다. 이러한 용액 교환 시간은 현재 설정에서 리간드 결합 및 결합 해제의 동역학을 측정하는 능력을 제한합니다. 커버 슬립 표면에서 원하는 리간드 농도를 달성할 수 있는지 확인하기 위해 마이크로볼륨 관류 시스템에 의해 커버 슬립에 전달된 50μM TMRM의 형광 강도를 스틸 수조에서 50μM TMRM과 비교했습니다(그림 2F). 강도의 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 수조가 관류된 경우에도 당사의 마이크로볼륨 관류 시스템을 사용하여 커버 슬립 표면에서 적절한 리간드 농도를 달성할 수 있음을 확인했습니다.
도 3A 는 5μM TNP-ATP에 노출된 HEK-239T 세포로부터 지붕이 없는 막에서 ANAP-태깅된KAT 채널로부터 얻어진 스펙트럼 이미지를 나타낸다. 이러한 이미지를 얻기 위해 지붕이 없는 멤브레인에서 방출된 빛은 CCD 카메라와 직렬로 분광계를 통해 전달되었습니다. 방출된 형광은 격자에서 회절되어 카메라 칩에 투영되어 스펙트럼을 생성했습니다. 결과 이미지는 y 차원의 공간 정보를 유지하지만 x 차원은 파장으로 대체되었습니다. 지붕이 없는 멤브레인에 해당하는 관심 영역(ROI)은 주황색으로 윤곽선이 표시됩니다. 이미지에서 ANAP 및 TNP-ATP의 피크 방출에 해당하는 고강도의 두 영역이 분명합니다. 이는 그림 3B에 표시된 파장별 평균(전체 ROI에 걸쳐) 스펙트럼에서 가장 잘 평가되었습니다. 피크 ~ 470 nm는 K ATP에 통합 된ANAP에 해당합니다. 피크 ~ 535 nm는 TNP-ATP에 해당합니다. 용액에서 TNP-ATP의 배경 형광 및 직접 여기를 보정하기 위해, 배경 영역(도 3A, 회색)을 각 이미지로부터 선택하였다. 평균화된 배경 스펙트럼은 도 3B에 도시되어 있다. 최종 스펙트럼은 평균 ROI 스펙트럼에서 평균 배경 스펙트럼을 빼서 얻었습니다(그림 3C).
ANAP는 광표백 인공물이 발생하기 쉽습니다. 그림 3D 는 다중 노출 후 피크 ANAP 형광의 감소를 보여줍니다. TNP-ATP가 없을 때(또는 TNP-ATP 농도 사이의 세척으로부터) 여러 번의 노출로 인한 피크 형광은 단일 지수 붕괴에 맞춰졌으며 이는 광표백 인공물을 보정하는 데 사용되었습니다(그림 3E). 낮은 뉴클레오티드 농도에서 높은 농도 및 높은 농도에서 낮은 뉴클레오티드 농도 모두에서 농도-반응 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 표백 보정으로 추가 인공물이 도입되지 않으면 결과는 비슷해야 합니다11.
도 5A는 TNP-ATP의 부재 및 존재 하에서 ANAP-태깅된 KATP 채널을 발현하는 세포로부터 얻어진 지붕이 없는 막으로부터의 대표적인 스펙트럼 이미지를 보여준다. 보정된 스펙트럼은 도 5B에 도시되어 있다. 방출 스펙트럼을 관찰한 결과, 공여체와 수용자 형광 방출 사이에 명확한 분리가 있었습니다. 형질감염되지 않은 HEK-293T 세포에서 나이브 원형질막에 대한 TNP-ATP의 일부 비특이적 결합이 관찰됨에 따라 FRET를 공여체(ANAP) 형광 감소로 정량화하는 것이 좋습니다10,11. 이 피크는 표지된 수용체에 특이적이었다.
수용체의 구조적 변화를 유도하는 리간드의 경우, 단독으로 결합 연구는 리간드 결합 과정에 대한 직접적이고 기계적으로 의미 있는 정보를 제공하지 않는다18. 리간드 결합에 대한 농도-반응 관계는 고유 결합 친화도뿐만 아니라 리간드 결합에 의해 유도된 구조적 변화, 리간드가 없을 때 형태를 변화시키는 수용체의 고유한 성향에 따라 달라집니다. 리간드-수용체 상호작용을 강조하는 과정을 더 잘 이해하기 위해 결합 측정은 단백질 기능의 판독값을 제공하는 실험과 결합될 수 있습니다. 이를 위해 이온 채널은 전압 클램프를 사용하여 단일 분자 수준까지 ms 미만의 시간 분해능으로 전류를 측정할 수 있기 때문에 이상적인 모델 시스템입니다. 역사적으로, 쌍을 이루는 전류 및 형광 측정은 전압- 및 리간드-개폐 이온 채널(19,20,21)의 개방 및 폐쇄(게이팅)에 대한 중요한 통찰력을 제공하였다. 다양한 환형 뉴클레오티드-조절된 채널(22,23,24)에 대한 이온 전류 및 형광 환형 뉴클레오티드 결합을 동시에 측정하기 위한 실험이 수행되었다. 이 연구는 결합시 양자 수율을 증가시키는 리간드를 사용했습니다. 패치 근처의 용액 부피에서 결합되지 않은 리간드로부터의 형광은 공초점 현미경22,23을 사용하여 패치를 이미징함으로써 뺄 수 있습니다. 본 연구에서는 ANAP 형광의 감소를 이용하여 결합을 측정하였다. 이 신호는 채널에 특이적이고 ANAP와 TNP-ATP 사이의 FRET는 거리에 크게 의존하기 때문에(~43 Å에서 절반 최대), 비특이적으로 결합되고 결합되지 않은 뉴클레오티드에 의한 신호의 오염은 방지되었습니다.
도 4A 는 전형적인 패치-클램프 형광 측정법(PCF) 실험을 나타낸다. 식염수로 채워진 붕규산 유리 피펫(전압 클램프 증폭기에 연결됨)과 ANAP-태깅된 KATP를 발현하는 셀 사이에 고저항(GΩ) 밀봉이 형성되었습니다. 밀봉 형성 후, 피펫을 세포로부터 분리하여, 세포내 뉴클레오티드 결합 부위에 접근할 수 있게 하였다. 그런 다음 피펫을 분광계 마스크의 슬릿을 중심으로 현미경 대물렌즈 위에 배치하고 마이크로볼륨 관류 시스템(붕규산 유리 팁으로 수정됨)의 유출을 피펫에 가깝게 가져왔습니다(그림 4D). 전압이 제어되고 패치의 채널에서 전류가 측정되었습니다. ANAP 태그가 지정된 KATP 채널의 대표 전류 및 스펙트럼은 스펙트럼을 전류와 일치시키기 위해 색상으로 구분된 그림 4B에 나와 있습니다. 방출 스펙트럼은 지붕이 없는 멤브레인에 대한 배경 및 표백에 대해 보정되었습니다.
그림 1: ANAP와 TNP-ATP는 적절한 FRET 쌍을 만듭니다. (A) ANAP 및 TNP-ATP의 구조. 형광 부분이 강조 표시됩니다. (B) ANAP 및 TNP-ATP의 흡광도 및 형광 방출 스펙트럼. FRET에는 ANAP 방출과 TNP-ATP 흡광도 사이의 겹침이 필요합니다. Puljung et al. (Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 에 따라 출판됨)10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 지붕이 없는 원형질막에서 뉴클레오티드 결합 측정. (A) 형광막 단백질을 발현하는 부착 세포로부터 지붕이 없는 원형질막의 제조를 위한 개략도. 폴리-L-라이신 코팅 또는 처리되지 않은 커버 슬립에서 성장한 세포에 대한 지침이 제공됩니다. (B) 지붕이 없는 막에서 뉴클레오티드 결합을 측정하기 위한 실험 설정. (C) 주황색 형광 단백질(OFP) 태그가 부착된 KATP 채널을 발현하는 세포에서 유래된 완전히 지붕이 없는 원형질막의 명시야 및 형광 이미지. 별표는 멤브레인의 위치를 표시하며, 이는 명시야 이미지에서 거의 보이지 않습니다. OFP는 531/40 nm 대역 통과 필터를 통해 넓은 565 nm LED로 여기되었고, 562 nm 에지 이색성 및 방출된 빛은 593/40 nm 대역 통과 필터를 통해 수집되었다. (D) 주황색 형광 단백질(OFP) 태그가 지정된 KATP 채널을 발현하는 세포에서 유래된 부분적으로 지붕이 없는 막 단편의 명시야 및 형광 이미지. (E) B. 5개의 기술 복제에 설명된 설정을 사용하여 획득한 솔루션 교환 시간 과정이 표시됩니다. 마이크로볼륨 관류 시스템에 50μM 테트라메틸로다민-5-말레이미드(TMRM)를 로딩하였다. 수조를 ~0.5mL/분의 속도로 물로 관류했습니다. 워시온(형광 증가) 및 워시아웃(형광 감소) 시간 과정의 데이터는 F = A*exp(-x/τ) + y0 형식의 단일 지수 감쇠에 적합했습니다. 세척에 대한 시간 상수(τ)는 ~0.6초였습니다. 세척을 위한 시간 상수는 ~1.0초였다. TMRM은 540/25 nm 대역 통과 필터를 통해 넓은 565 nm LED로 여기되었고, 565 nm 에지 이색성 및 방출된 빛은 605/55 nm 대역 통과 필터를 통해 수집되었다. (F) B에서와 같이 마이크로볼륨 관류 시스템을 사용하여 적용된 TMRM의 50μM 용액과 50μM TMRM을 포함하는 스틸 배스의 형광 강도 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배경 빼기 및 표백 보정. (A) ANAP로 표지된KAT 채널을 발현하는 세포로부터의 지붕이 없는 원형질막의 스펙트럼 이미지(y 차원의 공간 정보, x 차원의 파장). 5μM TNP-ATP는 그림 2B에 설명된 설정을 사용하여 적용되었습니다. 주황색 상자는 지붕이 없는 멤브레인에 해당하는 관심 영역(ROI)을 나타냅니다. 회색 상자는 스펙트럼을 보정하는 데 사용되는 배경 영역을 나타냅니다. (B) A의 ROI 및 배경 영역의 파장별 평균에서 파생된 방출 스펙트럼. (C) B의 평균 ROI 스펙트럼에서 평균 배경 스펙트럼을 빼서 파생된 스펙트럼. 평균 강도를 결정하기 위해 사용된 ANAP 피크 주위의 5 nm 윈도우는 회색 음영 영역으로 표시된다. (D) ANAP로 표지된 KATP 채널을 발현하는 세포로부터 지붕이 없는 원형질막의 6회 연속 10초 노출로부터 획득된 스펙트럼. 광표백으로 인한 형광의 감소에 주목하십시오. 삽입물은 F/Fmax = A*exp(-t/τ) + (1-A) 형식의 단일 지수 감쇠로 정규화된 피크 형광 피팅을 보여줍니다. 삽입된 기호는 스펙트럼과 일치하도록 색상으로 구분됩니다. (E) 광표백에 대해 보정된 D에서와 동일한 스펙트럼. 삽입된 화면은 D의 정규화된 피크 형광을 열린 원으로 표시하고, 보정된 피크 형광은 채워진 원을 사용하여 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 패치 클램프 형광 측정법(PCF)을 사용한 뉴클레오티드 결합 및 채널 전류의 동시 측정. (A) 뉴클레오티드 결합 및 이온 전류를 측정하기 위한 실험 설정을 보여주는 개략도. (B) ANAP 표지된 KATP 채널을 발현하는 세포로부터 절제된 막 패치로부터 획득된 전류(왼쪽) 및 스펙트럼(오른쪽)의 예. 전류는 -60mV의 유지 전위에서 기록되고 20kHz에서 디지털화되었으며 5kHz에서 필터링되었습니다. 회색 음영 영역은 ANAP 강도가 정량화된 파장 범위에 해당합니다. Usher et al. (Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 에 따라 출판됨)11. (C) 1mM TNP-ATP에 노출된 ANAP로 표지된KATA 채널을 발현하는 세포로부터 절제된 막 패치로부터 획득된 스펙트럼. TNP-ATP 형광이 관찰되는 파장 범위에 해당하는 음의 피크에 주목하십시오. 회색 음영 영역은 B에서와 같이 ANAP 형광을 정량화하는 데 사용되는 파장 범위를 나타냅니다. Usher et al. (Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 에 따라 출판됨)11. (D) 1mM TNP-ATP에 노출된 패치 피펫의 명시야 및 형광 이미지. 별표는 피펫의 끝을 표시합니다. (E) 1mM TNP-ATP에서 동일한 패치 피펫의 스펙트럼 이미지. 별표는 피펫의 위치를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ANAP 표지된 K ATP 채널에 대한TNP-ATP 결합. (A) TNP-ATP가 없거나 50μM 또는 1mM TNP-ATP가 있는 상태에서 ANAP로 표지된KAT 채널을 발현하는 세포로부터의 지붕이 없는 원형질막의 스펙트럼 이미지. 강도는 히트 맵으로 표시됩니다. (B) TNP-ATP에 의한 ANAP 형광의 소광을 보여주는 A의 이미지에서 파장별 평균 스펙트럼. 음영 영역은 분광계를 사용할 수 없는 경우 ANAP 소광을 측정하는 데 사용할 수 있는 두 개의 서로 다른 대역 통과 필터를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 지붕이 없는 멤브레인 및 PCF에서 TNP-ATP에 의한 ANAP 표지된 KATP 채널의 담금질. Usher et al.의 데이터 오버레이 (Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 에 따라 게시됨)11. 데이터는 Hill 방정식에 적합했습니다 : F / F max = E max + (1 – Emax) / (1+10(EC50 –[TNP-ATP])*h). F는 측정된 형광, Fmax는 뉴클레오티드의 부재 시의 최대 형광, Emax는 포화 뉴클레오티드 농도에서의 최대 담금질, 및 h는 힐 기울기이다. EC50(담금질이 절반 최대인 뉴클레오티드 농도) 및 [TNP-ATP]는 로그 값입니다. 지붕이 없는 멤브레인: EC50 = -4.59(25.7μM), h = 0.82, Emax = 0.93. PCF: EC50 = -4.11 (77.6 μM), h = 0.87, Emax = 1.00. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
우리는 손상되지 않은 막 단백질에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정하는 방법을 개발했습니다. 우리의 방법은 호박색 정지 코돈 억제 12, 세포 지붕 제거14 및 전압 클램프 형광 측정법 / PCF 19,20,21,22,23,24,25를 사용하여 ANAP로 단백질을 표지하는 것을 포함하여 몇 가지 다른 확립 된 기술을 기반으로합니다. 이러한 접근법의 합성은 높은 공간 및 시간 분해능으로 뉴클레오티드 결합의 측정을 가능하게 합니다. 실제로, 우리의 이전 연구에서, 우리는이 접근법10,11을 사용하여 동일한 단백질 복합체 상의 상이한 결합 부위를 구별 할 수 있었다. 중요하게도, 이 기술은 단백질 기능을 보존하는 조건 하에서 세포 환경에서 소량의 단백질에 직접 적용될 수 있다. 이온 채널 전류의 직접적인 전기생리학적 판독과 함께 당사의 결합 방법을 사용하면 채널 게이팅11의 분자 토대에 대한 풍부한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
분광계는 비표준 실험실 장비이기 때문에 대역 통과 필터를 사용하여 상대적으로 격리된 상태에서 ANAP 강도를 모니터링할 수도 있습니다. 도 5b 는 2개의 이러한 필터들의 스펙트럼 특성들을 도시한다. 470/10nm 대역 통과 필터는 TNP-ATP의 형광 신호를 효과적으로 차단하고 피크 ANAP 형광과 잘 겹칩니다. 그러나 이 필터의 피크 투과율은 약 50%에 불과하므로 희미한 멤브레인(또는 전압 클램프 하에서 절제된 멤브레인 패치)에서 좋은 신호를 얻기 어려울 수 있습니다. 또 다른 옵션은 460/60nm 대역 통과 필터입니다. 460/60 nm 필터와 470/10 nm 필터에 비해 TNP-ATP 방출 피크의 발 사이에는 약간 더 많은 겹침이 있습니다. 그러나 460/60nm 대역 통과는 광범위한 ANAP 피크에 걸쳐 90-95%의 투과율을 가지며, 이는 형광 방출 신호를 증가시킬 것으로 예상됩니다.
ANAP는 환경에 민감한 형광단 12,26,27입니다. 피크 방출 및 양자 수율은 관심 단백질의 결합 부위에 따라 달라지며 단백질의 형태가 변함에 따라 변할 수 있습니다. 이러한 변화는 방출 스펙트럼에서 즉시 분명하지만 필터를 사용하여 ANAP 강도를 측정할 때는 명확하지 않습니다. 어쨌든, 뉴클레오티드 결합 이후 ANAP 주변의 국소 환경의 변화로 인해 형광 신호가 변하지 않는다는 것을 입증하기 위해서는 적절한 제어가 필요합니다. 표지되지 않은 뉴클레오티드를 사용한 대조 실험은 ANAP 강도의 변화가 ANAP와 TNP-뉴클레오티드 사이의 FRET의 결과인지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. TNP-뉴클레오타이드는 형질감염되지 않은 세포에서 유래한 세포막(원형질막 또는 천연 막 단백질)에 비특이적으로 결합할 수 있습니다.10. 우리는 결합을 도너 형광의 감소로 정량화하는데, 이 신호는 표지된 채널에 특이적이기 때문입니다. 그러나 각 작용제/수용체 쌍에 대해 추가 제어 실험(예: 알려진 경우 뉴클레오티드 결합 부위 돌연변이)을 수행하여 공여체 형광의 변화가 실제로 표지된 수용체11에 직접 결합한 결과인지 확인하는 것이 좋습니다. 마지막으로, ANAP 라벨 외에 형광 단백질 태그를 포함하는 구조물로 작업하는 것이 좋습니다. 이는 표지된 수용체 형광을 배경/자가형광과 구별하는 데 도움이 됩니다. 배경 형광은 방출 스펙트럼(10)의 피크 및 형상에 의해 ANAP와 구별될 수 있지만, 이러한 결정은 필터 세트만이 사용될 때 매우 어려울 수 있다. 또한 형광 수용체를 발현하는 세포 및 지붕이 없는 막은 ANAP를 자극하고 과도한 광표백의 위험 없이 형광 단백질 태그를 사용하여 식별할 수 있습니다.
많은 PCF 기록에서 우리는 높은 TNP-ATP 농도에서 스펙트럼에서 강한 음의 피크를 관찰했습니다(그림 4C). 이 음의 피크는 배경 빼기 프로토콜의 인공물입니다. 그림 4D 는 1mM TNP-ATP에 노출된 패치 피펫의 명시야 및 형광 이미지를 보여줍니다. 피펫 팁의 그림자는 피펫 벽의 부피에서 TNP-ATP를 제외했기 때문에 분명하며, 이는 초점면 내에서 가장 분명합니다. 그림 4E 의 스펙트럼 이미지는 이 그림자에 해당하는 어두운 띠를 보여줍니다. 이 어두운 띠 위 또는 아래 영역을 배경 빼기에 사용하면 음의 피크가 생성됩니다. 중요하게도, 이 피크는 TNP-ATP 방출에 해당하는 파장 범위에서 발생했으며 ANAP 담금질 측정에 영향을 미치지 않았습니다.
우리 실험의 주요 한계는 형광을 측정하기 위해 ANAP 태그 구조의 적절한 원형질막 발현을 얻는 데 있었습니다. 패치를 한 번에 하나씩만 얻을 수 있는 PCF와 달리 PCF보다 지붕이 없는 멤브레인에서 고품질 스펙트럼을 얻는 것이 일반적으로 더 쉬웠는데, 이는 크기가 더 크고 지붕이 없는 멤브레인의 전체 접시를 빠르게 스캔할 수 있기 때문입니다. 우리의 실험에서, 지붕이 없는 멤브레인과 PCF 실험의 데이터는 유사했지만 동등하지는 않았습니다(그림 6)11. 그러나 패치 피펫의 단백질이 지붕이 없는 막의 단백질과 다른 기능 상태에 있을 수 있기 때문에 이것이 보편적인 관찰이 되어야 하는 선험적 이유는 없습니다.
여기서, 당사의 ANAP-태깅된 구축물의 발현을 최대화하기 위한 시도가 이루어졌으며, 특히 세포 배양 온도를 33°C10,11,16으로 낮추었다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, ANAP가 보존적 치환이 될 단백질의 부위를 확인하려는 시도는 일관되게 잘 발현되는 구조를 초래하지 않았습니다. 우리는 ANAP 통합 부위에 대해 전체 단백질 영역을 체계적으로 스캔하고 표면 발현10에 대한 후보를 스크리닝하는 데 더 많은 성공을 거두었습니다. ANAP 라벨링 시스템은 Xenopus laevis 난모세포에서도 작동하여 훨씬 더 큰 멤브레인 패치를 절제할 수 있으므로 신호 대 잡음26,27,28이 증가합니다.
발현 수준이 높을수록 신호가 더 밝아질 것으로 예상되지만, 형광을 측정하는 데 필요한 최소 채널 수는 형광단의 밝기, 광표백 정도, 여기광의 강도 및 초점면을 비롯한 여러 요인에 따라 달라집니다. 이론적으로, 이전에 표시된 바와 같이 형광 강도와 채널 전류를 연관시킴으로써 추정할 수 있습니다28,29. 그러나 이러한 추정치의 신뢰성을 위해서는 단일 채널 컨덕턴스와 채널의 개방 확률에 대한 지식이 필요합니다. 위에 나열된 요인 외에도 형광 신호는 소포와 관련된 채널 또는 전압 클램프가 아닌 피펫 유리에 부착된 원형질막 섹션의 영향을 받습니다.
이 방법은 다른 뉴클레오티드에 민감한 이온 채널의 연구에 쉽게 적용됩니다. CFTR은 구조적으로KATP30,31의 부속 설포닐우레아 수용체 서브유닛과 유사하다. KATP CFTR 게이팅과 마찬가지로 뉴클레오티드 결합에 의해 제어되므로 우리 방법7의 명백한 미래 목표가 됩니다. 퓨린성 P2X 수용체는 세포외 ATP9에 의해 개폐되는 이온 채널입니다. TNP-ATP는 P2X 수용체32,33에 대한 길항제로 작용합니다. 따라서 P2X 작용제와의 경쟁 분석에 사용될 수 있지만 P2X 활성화를 연구하는 데는 유용하지 않습니다. 대안적으로, ANAP 방출과 충분한 스펙트럼 중첩을 갖는 다른 형광 ATP 유도체가 활성화 연구에 사용될 수 있다. Alexa-647-ATP는 형광 P2X 작용제(34)이다. Alexa-647과 ANAP 사이의 계산된R0 는 ~85 Å이며, 이는 P2X에 대한 직접 결합이 채널에 통합된 ANAP의 상당한 담금질을 초래해야 함을 의미합니다. 그러나 이러한 긴R0은 또한 Alexa-647-ATP에서 이웃 서브유닛으로 결합하는 퀀칭을 초래하고 비특이적 뉴클레오티드 결합이 FRET를 초래할 가능성을 증가시킵니다. P2X 수용체의 리간드 결합 부위는 세포 외이기 때문에 결합 측정은 손상되지 않은 세포, 전체 세포 전압 클램프 또는 외부 막 패치에서 수행됩니다. 우리의 방법은 또한 G 단백질 결합 P2Y 수용체뿐만 아니라 반응 주기에 ATP에 의존하는 전기성 및 비전기적 수송체 및 펌프의 결합 및 활성화를 연구하기 위해 확장될 수 있습니다. 마지막으로, 아데닌 뉴클레오티드 결합(TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP)을 측정하기 위해 이 방법을 개발했지만, 적합한 형광 리간드가 확인된 거의 모든 수용체에 대한 결합을 연구하는 데 동일한 접근 방식을 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우수한 기술 지원을 해주신 Raul Terron Exposito에게 감사드립니다. 이 연구는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회(BB/R002517/1; MCP 및 FMA) 및 Wellcome Trust(203731/Z/16/A; SGU)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T75 tissue-culture treated flask | StarLab | CC7682-4875 | |
| 0.1% w/v poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 30 mm borosilicate cover glass slips | VWR | 631-0174 | |
| 35 mm non-treated sterile dishes | CytoOne | CC7672-3340 | |
| 35 mm cover glass bottom dish | WPI | FD35-PDL-100 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 31966021 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| TrypLE select (tryosin) | Gibco | 12563-011 | Trypsin/EDTA reagent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14040-091 | |
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-035 | |
| HEK293T cells | ATTC | CRL-3216 | Used between passages 5-30 |
| ANAP-TFA | AsisChem | ASIS-0014 | Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM |
| pANAP expression plasmid | Addgene | Plasmid #48696 | Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein |
| peRF1-E55D | Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) | Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 | Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio | MIR 2300 | Lipopolyplex transfection reagent |
| Thick-walled borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-15 | |
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide | Sigma-Aldrich | 94506 | |
| TNP-ATP | Jena Bioscience | NU-221L | Delivered at 10 mM in water |
| Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope | Nikon | ||
| 60x water immersion objective (1.4 NA) | Nikon | MRD07602 | |
| 4-Wavelength High-Power LED Head | ThorLabs | LED4D245 | 385/490/565/625 nm LEDs |
| Four-Channel LED Driver | ThorLabs | DC4100 | |
| 390/18 nm band-pass excitation filter | ThorLabs | MF390-18 | For ANAP excitation |
| 400 nm long-pass emission filter | ThorLabs | FEL0400 | For imaging ANAP spectra |
| 416 nm edge dichroic | ThorLabs | MD416 | For imaging ANAP spectra |
| 460/60 nm band-pass emission filter | ThorLabs | MF460-60 | Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
| 470/10 nm band-pass emission filter | ThorLabs | FB470-10 | Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
| 531/40 band-pass excitation filter | Brightline | FF01-531/40-25 | For orange fluorescent protein (OFP) excitation |
| 540/25 nm band-pass excitation filter | Chroma | D540/25X | For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation |
| 562 nm edge dichroic | Semrock | FF562-Di03 | For imaging OFP fluorescence |
| 565 nm edge dichroic | Chroma | 565DC | For imaging TMRM fluorescence |
| 593/40 nm band-pass excitation filter | Brightline | FF01-387/11-25 | For imaging OFP fluorescence |
| 605/55 nm band-pass emission filter | Chroma | D605/55M | For imaging TMRM fluorescence |
| IsoPlane-160 Imaging Spectrometer | Princeton Instruments | IsoPlane-160 | |
| PIXIS 400BR_eXcelon Camera | Princeton Instruments | PIXIS: 400BR_eXcelon | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B-2 | |
| Digidata 1440A digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Probe sonicator | Sonics & Materials | VC-50 | For unroofing |
| REGLO digital peristaltic pump | Ismatec | ISM 832 | For bath perfusion |
| Microvolume perfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA μFlow-8 | For TNP-ATP perfusion |
| pClamp 10.6.2 | Molecular Devices | Recording and analysing currents | |
| Lightfield 5.20.1507 | Princeton Instruments | Acquisition software for images and spectra | |
| Matlab | Mathworks | For data analysis | |
| Python 3.8.1 | Python Software Foundation | For data analysis |
References
- Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. Ion channels find a pathway for therapeutic success. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Higgins, C. F., Linton, K. J. The ATP switch model for ABC transporters. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).
- Toyoshima, C., Cornelius, F. New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).
- Craven, K. B., Zagotta, W. N. CNG and HCN channels: two peas, one pod. Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).
- Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).
- Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model. Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).
- Burnstock, G. Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).
- Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding. Elife. 8, 41103 (2019).
- Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry. Elife. 9, 52775 (2020).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane. Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).
- Heuser, J. The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy. Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).
- Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
- Lin, C. Y., et al. Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature. PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).
- Usukura, J., et al. Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions. Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).
- Colquhoun, D. Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors. British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
- Zheng, J., Zagotta, W. N. Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels. Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).
- Biskup, C., et al. Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels. Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).
- Kusch, J., et al. Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels. Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).
- Wu, S., et al. State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry. Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Kalstrup, T., Blunck, R. S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).
- Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).
- Liu, C., et al. Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance. Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).
- Hwang, T. C., et al. Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction. Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).
- Puljung, M. C. Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels. Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).
- Kasuya, G., et al. Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel. Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).
- Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors. Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).
- Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).
