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Biochemistry

वास्तविक समय में बरकरार, कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापना

Published: March 11, 2021 doi: 10.3791/61401
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Department of Chemistry and Neuroscience Program, Trinity College

Summary

यह प्रोटोकॉल सेलुलर वातावरण में वास्तविक समय में रिसेप्टर्स के लिए एडेनिन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। बाइंडिंग को ट्राइनिट्रोफेनिल न्यूक्लियोटाइड डेरिवेटिव और प्रोटीन के बीच एक गैर-कैननिकल, फ्लोरोसेंट अमीनो एसिड के साथ लेबल किए गए फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट) के रूप में मापा जाता है।

Abstract

हमने एक सेलुलर या झिल्ली वातावरण में बरकरार, कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर्स के लिए एडेनिन न्यूक्लियोटाइड के बंधन को मापने के लिए एक विधि विकसित की है। यह विधि फ्लोरोसेंट गैर-कैननिकल अमीनो एसिड एएनएपी के साथ टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति को जोड़ती है, और एएनएपी और फ्लोरोसेंट (ट्राइनिट्रोफेनिल) न्यूक्लियोटाइड डेरिवेटिव के बीच फ्रेट। हम बिना छत वाले प्लाज्मा झिल्ली में मापा जाने वाले एएनएपी-टैग किए गए केएटीपी आयन चैनलों के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के उदाहरण प्रस्तुत करते हैं और वोल्टेज क्लैंप के तहत उत्पाद, अंदर-बाहर झिल्ली पैच करते हैं। उत्तरार्द्ध लिगैंड बाइंडिंग और चैनल करंट के एक साथ माप की अनुमति देता है, जो प्रोटीन फ़ंक्शन का एक सीधा रीडआउट है। संभावित नुकसान और कलाकृतियों के साथ डेटा उपचार और विश्लेषण पर बड़े पैमाने पर चर्चा की जाती है। यह विधि केएटीपी चैनलों के लिगैंड-निर्भर गेटिंग में समृद्ध यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्रदान करती है और आसानी से अन्य न्यूक्लियोटाइड-विनियमित प्रोटीन या किसी भी रिसेप्टर के अध्ययन के लिए अनुकूलित की जा सकती है जिसके लिए एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट लिगैंड की पहचान की जा सकती है।

Introduction

प्रोटीन के कई महत्वपूर्ण वर्गों को सीधे लिगैंड बाइंडिंग द्वारा विनियमित किया जाता है। ये घुलनशील एंजाइमों से लेकर झिल्ली-एम्बेडेड प्रोटीन तक होते हैं जिनमें रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस, जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर), और आयन चैनल शामिल हैं। जीपीसीआर और चैनल क्रमशःसभी मौजूदा दवा लक्ष्यों का ~ 34% और ~ 15% हैं। इसलिए, लिगंड-रिसेप्टर इंटरैक्शन में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करने वाले तरीकों को विकसित करने में काफी जैव रासायनिक, साथ ही चिकित्सा रुचि है। फोटोफिनिटी लेबलिंग और रेडियोलिगैंड बाइंडिंग अध्ययनों सहित लिगैंड बाइंडिंग को मापने के पारंपरिक तरीकों में बड़ी मात्रा में आंशिक रूप से शुद्ध प्रोटीन की आवश्यकता होती है और आमतौर पर गैर-शारीरिक स्थितियों और समय के पैमाने के तहत प्रदर्शन किया जाता है। एक आदर्श विधि के लिए केवल थोड़ी मात्रा में प्रोटीन की आवश्यकता होगी, जिसे सेलुलर या झिल्ली वातावरण में व्यक्त बरकरार प्रोटीन पर किया जा सकता है, वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है, और प्रोटीन फ़ंक्शन के प्रत्यक्ष रीडआउट के साथ संगत होगी।

फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट) एक विधि है जो दो फ्लोरोसेंटली टैग किएगए अणुओं के बीच निकटता का पता लगाती है। फ्रेट तब होता है जब एक उत्तेजित दाता फ्लोरोफोरे एक गैर-विकिरण फैशन में ऊर्जा को एक स्वीकर्ता अणु (आमतौर पर एक और फ्लोरोफोर) में स्थानांतरित करता है। ऊर्जा हस्तांतरण के परिणामस्वरूप दाता प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का शमन होता है और स्वीकर्ता उत्सर्जन का संवेदीकरण होता है (यदि स्वीकर्ता फ्लोरोफोर है)। स्थानांतरण दक्षता दाता और स्वीकर्ता के बीच की दूरी की 6वीं शक्ति पर निर्भर है। इसके अलावा, फ्रेट होने के लिए दाता और स्वीकर्ता निकटता (आमतौर पर 10 एनएम से कम) में होना चाहिए। जैसे, फ्रेट का उपयोग फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन रिसेप्टर और फ्लोरोसेंट लिगैंड के बीच सीधे बंधन को मापने के लिए किया जा सकता है।

कई अलग-अलग प्रोटीन इंट्रासेल्युलर या बाह्य एडेनिन न्यूक्लियोटाइड (एटीपी, एडीपी, एएमपी, सीएमपी) को बांधकर विनियमित या सक्रिय होते हैं। कई ट्रांसपोर्टर प्रोटीन को अपने प्रतिक्रिया चक्र के लिए एटीपी हाइड्रोलिसिस की आवश्यकता होती है, जिसमें एटीपी-बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टर और पी-टाइप एटीपीस जैसे एनए + / के + पंप 4,5 शामिल हैं। एटीपी-संवेदनशील के + (केएटीपी) चैनल, सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर), और चक्रीय-न्यूक्लियोटाइड विनियमित चैनल सभी आयन चैनल हैं जो इंट्रासेल्युलर एडेनिन न्यूक्लियोटाइड के बंधन से गेट होते हैं, जिससे वे सेलुलर चयापचय और सिग्नल ट्रांसडक्शन 6,7,8 में परिवर्तन के प्रति अति संवेदनशील हो जाते हैं।. प्यूरीनर्जिक पी 2 एक्स और पी 2 वाई रिसेप्टर्स बाह्य एटीपी में परिवर्तन का जवाब देते हैं, जिसे न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में याऊतक क्षति के परिणामस्वरूप जारी किया जा सकता है। हमने वास्तविक समय में झिल्ली प्रोटीन के लिए एडेनिन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के माप के लिए एक फ्रेट-आधारित परख विकसित की है। हमने पहले केएटीपी चैनल10,11 के न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए इस विधि को लागू किया है।

फ्रेट के माध्यम से न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापने के लिए, रुचि के प्रोटीन को पहले फ्लोरोफोरे के साथ टैग किया जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट टैग को साइट-विशेष रूप से रुचि के प्रोटीन में डाला जाना चाहिए जैसे कि यह फ्रेट होने के लिए लिगैंड बाइंडिंग साइट के काफी करीब है, यह सुनिश्चित करने के लिए विशेष देखभाल की जाती है कि टैग प्रोटीन की समग्र संरचना और कार्य को प्रभावित नहीं करता है। इसे पूरा करने के लिए, हम चटर्जी एट अल द्वारा विकसित एक तकनीक का उपयोग करते हैं, जिसमें फ्लोरोसेंट गैर-कैननिकल अमीनो एसिड (एल -3-(6-एसिटाइलनेफ्थेलेन-2-यलामिनो) -2-एमिनोप्रोपियोनिक डालने के लिए एम्बर स्टॉप-कोडन दमन का उपयोग किया जाता है; एएनएपी) वांछित साइटपर 12. हम न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को एएनएपी-लेबल प्रोटीन और फ्लोरोसेंट, ट्राइनिट्रोफेनिल (टीएनपी) न्यूक्लियोटाइड डेरिवेटिव (चित्रा 1 ए) के बीच फ्रेट के रूप में मापते हैं। एएनएपी के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रम टीएनपी-न्यूक्लियोटाइड ्स के अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप होता है, जो फ्रेट होने के लिए आवश्यक स्थिति है (चित्रा 1 बी)। यहां हम दो अलग-अलग प्रकार के बाध्यकारी प्रयोग ों को रेखांकित करते हैं। पहले में, एएनएपी-लेबल के एटीपीचैनलों के इंट्रासेल्युलर पक्ष के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को उन कोशिकाओं में मापा जाता है जिन्हें सोनिकेशन द्वारा अनरूफ किया गया है, जिससे ग्लास कवर स्लिप10,11,13,14 पर प्लाज्मा झिल्ली के अनुगामी टुकड़े बच गए हैं।

दूसरी विधि में, एएनएपी-लेबल केएटीपी चैनलों के न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को वोल्टेज क्लैंप के तहत एक झिल्ली पैच में मापा जाता है, जिससे आयनिक धाराओं और प्रतिदीप्ति के एक साथ माप की अनुमति मिलती है। इन दो प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के संयोजन से, बाइंडिंग में परिवर्तन को सीधे चैनल फ़ंक्शन11 में परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। विशिष्ट परिणाम, संभावित नुकसान और डेटा विश्लेषण पर चर्चा की जाती है।

Protocol

1. कवर पर्ची तैयार करना

नोट: ये कदम एक बाँझ ऊतक-संस्कृति हुड में होना चाहिए। 10 व्यंजनों की तैयारी के लिए मात्रा दी जाती है।

  1. दस आटोक्लेव, 30 मिमी बोरोसिलिकेट कवर ग्लास स्लिप को व्यक्तिगत रूप से दस 35 मिमी गैर-उपचारित बाँझ व्यंजनों में रखें और 2 मिलीलीटर बाँझ, आसुत पानी के साथ एक बार कुल्ला करें।
  2. 0.1% डब्ल्यू /वी पॉली-एल-लाइसिन घोल के 1 एमएल को बाँझ, आसुत पानी में 10 एमएल की कुल मात्रा (0.01% डब्ल्यू / वी की अंतिम एकाग्रता) में पतला करें। अच्छी तरह मिलाएं, फिर प्रत्येक कवर स्लिप पर 1 एमएल पिपेट करें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  3. पॉली-एल-लाइसिन को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कवर स्लिप को कम से कम 2 मिलीलीटर बाँझ आसुत जल के साथ दो बार धोएं। पूरी तरह से सूखने तक छोड़ दें यानी, कम से कम 3 घंटे।

2. एचईके -293 टी कोशिकाओं को सीडिंग

नोट: ये चरण एक ऊतक-संस्कृति हुड में होना चाहिए। एचईके -293 टी कोशिकाओं को उनकी कम वर्तमान पृष्ठभूमि और संस्कृति में बढ़ने में आसानी के लिए चुना गया था। इस प्रोटोकॉल को अन्य सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. एचईके-293टी कोशिकाओं के 80-90% कंफ्लुएंट टी 75 फ्लास्क को एक बार 12 एमएल फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 2-5 मिनट के लिए 2-5 मिनट के लिए 2 एमएल ट्रिप्सिन के साथ इंजेक्ट करने से पहले, या जब तक कि कोशिकाएं पूरी तरह से अलग और लगभग पूरी तरह से अलग न हो जाएं।
  2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 10 एमएल डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) को जोड़कर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं के शेष झुरमुट को तोड़ने के लिए फ्लास्क के नीचे पिपेट को धीरे से दबाएं।
  3. लेपित कवर स्लिप वाले 35 मिमी व्यंजनों की वांछित संख्या में पूरक डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें। प्रत्येक डिश में 100 μL पुन: निलंबित कोशिकाओं को जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।

3. अभिकर्मक

नोट: ये चरण एक ऊतक-संस्कृति हुड में होना चाहिए। 10 व्यंजनों के अभिकर्मक के लिए मात्रा दी जाती है। साइट-विशिष्ट एएनएपी निगमन के लिए, लेबलिंग के लिए अभिप्रेत स्थिति में डीएनए कोडन को एम्बर (टीएजी) स्टॉप कोडन के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। यह निर्माण दो प्लास्मिड के साथ सह-संक्रमित है: पीएएनएपी और पीईआरएफ 1-ई 55 डी12,15। पीएएनएपी एक एएनएपी-विशिष्ट टीआरएनए / टीआरएनए सिंथेटेस जोड़ी की कई प्रतियों को एन्कोड करता है। एएनएपी की उपस्थिति में, इस प्लास्मिड का अभिकर्मक एएनएपी के साथ चार्ज किए गए टीआरएनए का उत्पादन करता है जो एम्बर स्टॉप कोडन को पहचानता है। पीईआरएफ 1-ई 55 डी एक प्रमुख नकारात्मक राइबोसोमल रिलीज कारक को एन्कोड करता है जो पूर्ण लंबाई, एएनएपी-टैग किए गए प्रोटीन की उपज को बढ़ाता है।

  1. एएनएपी के साथ लेबलिंग के लिए अभिप्रेत निर्माण के लिए 10 μg pANAP, 10 μg perF1-E55D और DNA के साथ 1.5 mL ट्यूब तैयार करें। अपूरक डीएमईएम के साथ 500 μL की अंतिम मात्रा में लाएं।
  2. एक अलग ट्यूब में, डीएनए के प्रत्येक 1 μg के लिए लिपिड-आधारित अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के 3 μL तैयार करें और अपूरक डीएमईएम के साथ 500 μL की अंतिम मात्रा में लाएं।
  3. डीएनए और अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण को एक ट्यूब में मिलाएं और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 20 μM ANAP की अंतिम एकाग्रता के लिए 20 mM पूरक DMEM में 1 mM ANAP स्टॉक (30 mM NaOH में ट्राइफ्लोरोसेटेट नमक) के 400 μL जोड़ें। प्लेटेड कोशिकाओं से पुराने मीडिया को प्रति डिश 2 एमएल एएनएपी युक्त मीडिया के साथ बदलें।
  5. पिपेट प्रत्येक डिश पर डीएनए अभिकर्मक मिश्रण का 10% मिश्रण करता है। प्रयोगों से पहले 2-4 दिनों के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन कोशिका विभाजन को धीमा कर देता है और प्रति सेल16 प्रोटीन उपज को बढ़ाता है।

4. बिना छत वाली झिल्ली प्रयोग

  1. ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं के साथ एक कवर स्लिप को छोटे टुकड़ों में तोड़ने के लिए बल की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  2. कोशिकाओं को अनरूफ करने के लिए नीचे दी गई प्रक्रियाओं में से एक का पालन करें।
    1. यदि पूर्व-लेपित कवर पर्ची का उपयोग करके, पीबीएस के साथ एक टुकड़ा कुल्ला करें, फिर इसे 2 एमएल पीबीएस युक्त 35 मिमी डिश के तल पर रखें। संक्षेप में एक प्रोब सोनिकेटर (50 डब्ल्यू, 20% -40% आयाम, 3 मिमी जांच) का उपयोग करके सोनिकेट को नमूने से 3-5 मिमी ऊपर रखा जाता है ताकि कोशिकाओं को खोल दिया जा सके और अनुगामी प्लाज्मा झिल्ली के टुकड़ों को पीछे छोड़ दिया जा सके (चित्रा 2ए, सी)।
      नोट: नमूने के ऊपर सोनिकेटर शक्ति, अवधि और जांच की ऊंचाई सभी को कवरस्लिप को पूरी तरह से बंद किए बिना बिना छत वाली झिल्ली की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए भिन्न किया जा सकता है।
    2. यदि प्री-लेपित कवर स्लिप का उपयोग नहीं किया जाता है, तो पीबीएस के साथ एक कवर स्लिप टुकड़े को कुल्ला करें, फिर 0.1% डब्ल्यू / वी पॉली-एल-लाइसिन युक्त ट्यूब में ~ 30 सेकंड के लिए डुबोएं और संक्षेप में (चरण 4.2.1 के रूप में) कोशिकाओं को खोलने के लिए छोड़ दें और बिना छत वाले / आंशिक रूप से बिना छत वाले प्लाज्मा झिल्ली के टुकड़ों को पीछे छोड़ दें (चित्रा 2ए, सी, डी)। कवरस्लिप13 के पालन में सुधार के लिए पॉली-एल-लाइसिन के संक्षिप्त एक्सपोजर का प्रदर्शन किया गया है।
  3. सोनिकेटेड टुकड़े को 2 एमएल स्नान समाधान वाले कवर ग्लास-बॉटम 35 मिमी डिश में रखें और उच्च एनए, 60 x पानी विसर्जन उद्देश्य से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर माउंट करें। माइक्रोस्कोप का कैमरा पोर्ट एक उच्च संवेदनशीलता सीसीडी कैमरे के साथ श्रृंखला में एक स्पेक्ट्रोग्राफ से जुड़ा हुआ है। एक पेरिस्टालिक पंप का उपयोग करके बफर के साथ स्नान कक्ष (0.5 - 1 एमएल / मिनट) को गर्म करें। अध्ययन के तहत प्रोटीन के आधार पर बफर की संरचना अलग-अलग होगी।
    नोट: यदि उपयोगकर्ता के पास लंबी कामकाजी दूरी के साथ एक उद्देश्य तक पहुंच नहीं है, तो कवर स्लिप की अतिरिक्त ऊंचाई के कारण बिना छत वाली झिल्ली के टुकड़ों पर ध्यान केंद्रित करना असंभव हो सकता है। एक विकल्प पॉली-एल-लाइसिन ग्लास बॉटम के साथ व्यंजनों पर सीधे बीज कोशिकाओं को रखना है (उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। यह कांच के दो टुकड़ों के माध्यम से ध्यान केंद्रित करने से जुड़ी छवि में संभावित विचलन को भी कम करेगा। ये विचलन अधिग्रहित स्पेक्ट्रा के आकार को प्रभावित नहीं करते हैं।
  4. चैनल फ्लोरेसेंस (चित्रा 2सी, डी) की तलाश करके एएनएपी-लेबल चैनल को व्यक्त करने वाले बिना छत वाले झिल्ली के टुकड़ों की पहचान करें।
    नोट: रुचि के प्रोटीन युक्त अनरूफ झिल्ली की पहचान करने में मदद करने के लिए एक अतिरिक्त फ्लोरोसेंट लेबल (जहां उत्सर्जन स्पेक्ट्रम एएनएपी उत्सर्जन स्पेक्ट्रम से अलग है) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। चित्रा 2 सी, डी में प्रयोग ों को सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के साथ एएनएपी-लेबल चैनलों पर किया गया था।
  5. माइक्रोस्कोप और स्पेक्ट्रोग्राफ पर कैमरा पोर्ट के बीच स्पेक्ट्रोमीटर मास्क (~ 10% बढ़ाएं) को आंशिक रूप से संलग्न करें। कैमरे की इमेज पर मास्क की परछाई दिखाई देगी। माइक्रोस्कोप चरण को समायोजित करके, स्पेक्ट्रोमीटर मास्क के साथ बिना छत वाली झिल्ली को संरेखित करें। बिना छत वाली झिल्ली की एक उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवि प्राप्त करें। इनका उपयोग विश्लेषण के लिए रुचि के क्षेत्र का चयन करने के लिए किया जाएगा।
  6. माइक्रोवॉल्यूम छिड़काव प्रणाली की नोक को बिना छत वाली झिल्ली के करीब लाएं।
    नोट: पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए, छिड़काव प्रणाली के बहिर्वाह को बोरोसिलिकेट ग्लास से बने कस्टम टिप के साथ बदल दिया गया था।
  7. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा की छवि बनाने के लिए, 390/18 एनएम बैंड-पास उत्तेजना फिल्टर और 416 एनएम एज डाइक्रोइक के माध्यम से 385 एनएम एलईडी के साथ झिल्ली को उत्तेजित करें। उत्सर्जित प्रकाश को 400 एनएम लंबे-पास उत्सर्जन फिल्टर (चित्रा 2 बी) के माध्यम से एकत्र करें।
  8. स्पेक्ट्रोमीटर मास्क को संलग्न करें और सुनिश्चित करें कि उत्सर्जित प्रकाश पारित किया गया है। स्पेक्ट्रोमीटर झंझरी (300 खांचे / मिमी) को संलग्न करें। झंझरी के साथ, स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा अलग किए गए प्रकाश को स्पेक्ट्रल छवियों (चित्रा 3 ए) का उत्पादन करने के लिए सीसीडी कैमरे की चिप पर प्रक्षेपित किया जाएगा। ये छवियां वाई आयाम में स्थानिक जानकारी बनाए रखती हैं । x आयाम को तरंगदैर्ध्य से बदल दिया जाता है।
  9. वैकल्पिक रूप से, यदि रुचि के प्रोटीन को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया जाता है, तो उचित फिल्टर सेट का उपयोग करके फ्लोरोसेंट प्रोटीन की वर्णक्रमीय छवि प्राप्त करें।
  10. न्यूक्लियोटाइड-मुक्त बफर समाधान का उपयोग करते समय प्रयोग की शुरुआत में एक या अधिक 0.1-10 एस एक्सपोजर लें। इनका उपयोग शेष प्रयोग के दौरान डेटा को सही करने और सामान्य करने के लिए किया जाएगा (नीचे अनुभाग 5 देखें)।
    नोट: एक्सपोज़र समय का विकल्प प्राप्त अभिव्यक्ति स्तर, फ्लोरोफोरे की चमक और प्रकाशिकी पर निर्भर करेगा। सिग्नल को अधिकतम करने और देखे गए विरंजन दर को कम करने के लिए एक्सपोजर समय चुना जाना चाहिए। 4.10 में दी गई एक्सपोजर समय सीमा संतुलन बाध्यकारी माप के लिए उपयुक्त है, लेकिन धीमी गतिजपरिवर्तनों को मापने के लिए उपयोगी हो सकती है। तेजी से कैनेटीक्स को ट्रैक करने के लिए छोटे एक्सपोज़र समय का उपयोग करने की क्षमता हार्डवेयर के बजाय प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर और फोटोब्लीचिंग द्वारा सीमित होगी।
  11. एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र स्थापित करने के लिए टीएनपी-एटीपी (आमतौर पर स्नान समाधान में तैयार) की सांद्रता की एक श्रृंखला लागू करें। प्रत्येक घोल को कम से कम 1 मिनट के लिए रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि एक स्थिर स्थिति तक पहुंच गया है और प्रत्येक एकाग्रता को कम से कम 1 मिनट के लिए स्नान समाधान के साथ धो लें।
    नोट: यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि छिड़काव प्रणाली तेजी से संतुलन (चित्रा 2 ई) तक पहुंच सकती है और टीएनपी-एटीपी (चित्रा 2 एफ) की सही स्थानीय एकाग्रता प्राप्त कर सकती है।
  12. प्रत्येक एकाग्रता पर और प्रत्येक वॉशआउट के अंत में एक एक्सपोजर (चरण 4.10 में उपयोग की जाने वाली समान अवधि के साथ) लें।

5. वर्णक्रमीय विश्लेषण

नोट: ये निर्देश विश्लेषण कोड "pcf.m" के साथ उपयोग के लिए लिखे गए हैं, जो GitHub पर पाया जा सकता है। https://github.com/mpuljung/spectra-analysis 10. अतिरिक्त और वैकल्पिक कोड https://github.com/smusher/KATP_paper_201911 पर पाया जा सकता है। हमने यहां सॉफ्टवेयर द्वारा किए गए कार्यों का वर्णन किया है ताकि उपयोगकर्ता अपना कोड बना सके या मैन्युअल रूप से डेटा का विश्लेषण करना चुन सके।

  1. कमांड लाइन में प्रोग्राम का नाम ("पीसीएफ") लिखकर विश्लेषण प्रोग्राम प्रारंभ करें।
  2. जब कोई खुली फ़ाइल/फ़ोल्डर संवाद बॉक्स प्रॉम्प्ट के साथ खुलता है: "ROI के लिए फ़ाइलों का चयन करें", तो बिना छत वाली झिल्ली के ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस छवियों से जुड़े फ़ाइल नामों का चयन करें। आउटपुट फ़ाइल का नाम टाइप करने के लिए कमांड लाइन में एक प्रॉम्प्ट दिखाई देगा।
  3. फ़ाइल का नाम टाइप करें और Enter दबाएँ.
  4. जब सॉफ्टवेयर ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस छवियों को प्रदर्शित करता है, तो सॉफ्टवेयर प्रॉम्प्ट ्स के बाद बिना छत वाले झिल्ली के टुकड़े या एक्साइज्ड पैच (अनुभाग 6 देखें) के स्थान के अनुरूप वर्णक्रमीय छवि में रुचि के क्षेत्र (आरओआई) का चयन करें। एक ही वर्णक्रमीय छवि में एक पृष्ठभूमि क्षेत्र का चयन करें (आरओआई में समान तरंग दैर्ध्य सीमा का प्रतिनिधित्व करते हुए) कवर स्लिप या डिश के एक खंड के अनुरूप जिसमें कोई झिल्ली संलग्न नहीं है (चित्रा 3 ए)। सॉफ़्टवेयर ROI के शीर्ष पर क्लिक करने के लिए संकेत देगा और Enter दबाएगा, ROI के निचले भाग पर क्लिक करें और Enter दबाएँ और फिर पृष्ठभूमि क्षेत्र के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
  5. जब कोई खुली फ़ाइल/फ़ोल्डर संवाद बॉक्स प्रॉम्प्ट के साथ खुलता है: "एफपी स्पेक्ट्रम के लिए फ़ाइल का चयन करें", फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) स्पेक्ट्रम (वैकल्पिक चरण 4.9) से जुड़े फ़ाइल नाम का चयन करें। यदि कोई एफपी स्पेक्ट्रम अधिग्रहित नहीं किया गया था, तो एक अलग स्पेक्ट्रम फ़ाइल का चयन करें। एफपी स्पेक्ट्रम टैग किए गए प्रोटीन और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के बीच अंतर करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
  6. जब कोई खुली फ़ाइल/फ़ोल्डर संवाद बॉक्स प्रॉम्प्ट के साथ खुलता है: "एनालिसिस के लिए फ़ाइलों का चयन करें", तो ब्लीच सुधार के लिए आवश्यक फ़ाइलों सहित ANAP स्पेक्ट्रा (चरण 4.10 से 4.12 तक) से संबंधित सभी फ़ाइलों का चयन करें।
  7. जब कोई खुली फ़ाइल/फ़ोल्डर संवाद बॉक्स प्रॉम्प्ट के साथ खुलता है: "ब्लीचिंग संग्रह के लिए फ़ाइलों का चयन करें", प्रयोग की शुरुआत में न्यूक्लियोटाइड-मुक्त समाधान में प्राप्त प्रारंभिक स्पेक्ट्रा के अनुरूप चरण 5.6 से फ़ाइलों के उप-समूह का चयन करें या सुधार के लिए उपयोग किए जाने वाले न्यूक्लियोटाइड-मुक्त समाधान में धोने के दौरान प्राप्त स्पेक्ट्रा (चरण 4.10 से 4.12 तक)।
  8. स्पेक्ट्रा का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक छवि को लाइन-औसत करें, यानी, प्रत्येक तरंग दैर्ध्य पर आरओआई या पृष्ठभूमि क्षेत्र के वाई आयाम में सभी पिक्सेल के लिए तीव्रता का औसत करें। (चित्रा 3 बी)। अनबाउंड टीएनपी-एटीपी (चित्रा 3 सी) से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और प्रतिदीप्ति को हटाने के लिए आरओआई से प्राप्त औसत स्पेक्ट्रम से परिणामी औसत पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम को घटाएं। ये चरण सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से निष्पादित किए जाते हैं।
  9. घटाए गए स्पेक्ट्रा के एएनएपी शिखर के आसपास केंद्रित 5 एनएम विंडो की तीव्रता का औसत करके प्रत्येक एक्सपोज़र के लिए एएनएपी तीव्रता निर्धारित करें (आमतौर पर ~ 470 एनएम लेकिन एएनएपी अवशेषों के स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट के आधार पर भिन्न हो सकता है)।
    नोट: चित्रा 3 डी एएनएपी-टैग किए गए चैनलों को व्यक्त करने वाले एक बिना छत वाले झिल्ली के टुकड़े के लगातार 10 एस एक्सपोजर से प्राप्त 6 स्पेक्ट्रा दिखाता है। इनसेट प्रत्येक स्पेक्ट्रम के शिखर की औसत तीव्रता को दर्शाता है। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से अधिग्रहित पहले स्पेक्ट्रम में चरम तरंग दैर्ध्य का पता लगाएगा और इस मूल्य का उपयोग करेगा। तीव्रता की गणना सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से की जाएगी।
  10. किसी दिए गए एक्सपोज़र (एफ) की एएनएपी तीव्रता को समय श्रृंखला में पहले एक्सपोज़र की एएनएपी तीव्रता से विभाजित करके प्रत्येक प्रयोग के लिए एएनएपी तीव्रता को सामान्य करें, जिसे चरण 4.10 (एफअधिकतम) में लिया गया था। फिर, सॉफ्टवेयर इन गणनाओं को स्वचालित रूप से करता है।
  11. डेटा प्राप्त करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें.
    1. एएनएपी फोटोब्लीचिंग को सही करने के लिए, सबसे पहले टीएनपी-एटीपी अनुप्रयोगों के बीच मध्यवर्ती धोने के चरणों या टीएनपी-एटीपी पर धोने से पहले लिए गए कई प्रारंभिक एक्सपोज़र के लिए एक एकल घातीय क्षय, (एफ / एफअधिकतम) = ए * एक्सपी (-टी / ) + (1-ए) फिट करें, जहां टी संचयी एक्सपोजर समय है, समय स्थिर है और ए आयाम है) या तो टीएनपी-एटीपी अनुप्रयोगों के बीच मध्यवर्ती धोने के चरणों या टीएनपी-एटीपी पर धोने से पहले लिए गए कई प्रारंभिक एक्सपोज़र (चित्रा 3 डी, चित्रा 3 डी, इनसेट)।
      नोट: सॉफ़्टवेयर इस फिट को प्रदर्शित करेगा और इसे स्वीकार या अस्वीकार करने का संकेत देगा। यदि फिट अस्वीकार कर दिया जाता है, तो ब्लीचिंग सुधार के लिए फ़ाइलों का चयन करने का एक और अवसर प्रदान किया जाएगा।
    2. सामान्यीकृत (चरण 5.10 में) एएनएपी स्पेक्ट्रा को प्रत्येक समय बिंदु पर चरण 5.11.1 से घातीय फिट के अनुमानित मान से विभाजित करें (चित्रा 3 ई)।
      नोट: दिखाए गए उदाहरण के लिए, 50 एस पर देखा गया सामान्यीकृत शिखर प्रतिदीप्ति 0.65 है और घातीय फिट से अनुमानित प्रतिदीप्ति 0.64 है। ब्लीचिंग को सही करने के लिए, देखे गए मान (0.65, चित्रा 3ई इनसेट, खाली सर्कल) को अनुमानित मान (0.64, चित्रा 3 ई इनसेट, डैश्ड लाइन) से विभाजित करें ताकि सही मान (~ 1, चित्रा 3 ई इनसेट, रंगीन सर्कल) का उत्पादन किया जा सके। यदि ब्लीचिंग सुधार पर्याप्त है, तो न्यूक्लियोटाइड की अनुपस्थिति में प्राप्त सभी एक्सपोजर से एएनएपी की तीव्रता लगभग बराबर होनी चाहिए (चित्रा 3 ई)। ये गणना सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से की जाती है।
    3. आउटपुट को डेटा को प्लॉट करने वाली छवि के रूप में प्राप्त करें और एक टैब्ड स्प्रेडशीट जिसमें कच्चे स्पेक्ट्रा, घटाए गए स्पेक्ट्रा, फोटोब्लीचिंग के लिए सही स्पेक्ट्रा और प्रत्येक फ़ाइल के लिए पीक डेटा शामिल हो ताकि आगे का विश्लेषण किया जा सके।

6. पैच-क्लैंप फ्लोरोमेट्री प्रयोग

  1. पिपेट के घोल से भरे जाने पर मोटी दीवार वाले बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से पैच पिपेट को 1.5 mQ से 2.5 mQ के प्रतिरोध तक खींचें। अध्ययन के तहत प्रोटीन के आधार पर पिपेट समाधान की संरचना अलग-अलग होगी।
  2. ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं के साथ एक कवर स्लिप को 2 एमएल स्नान समाधान वाले कवर ग्लास-बॉटम 35 मिमी डिश पर स्थानांतरित करें और एक उच्च एनए, 60 x जल विसर्जन उद्देश्य से लैस उल्टे माइक्रोस्कोप पर माउंट करें। एक पेरिस्टालिक पंप का उपयोग करके स्नान समाधान के साथ स्नान कक्ष (0.5 - 1 एमएल / मिनट) को गर्म करें। पिपेट समाधान के लिए, स्नान समाधान अध्ययन के तहत प्रोटीन के आधार पर अलग-अलग होगा।
  3. कोशिका झिल्ली पर प्रतिदीप्ति की तलाश करके एएनएपी-लेबल चैनलों को व्यक्त करने वाले सेल की पहचान करें।
  4. पिपेट समाधान के साथ एक पैच पिपेट भरें। पिपेट पर कोमल सकारात्मक दबाव लागू करें और स्नान कक्ष में रखें। कोशिका की झिल्ली के खिलाफ पिपेट दबाएं और जीक्यू सील (चित्रा 4 ए) प्राप्त करने के लिए कोमल सक्शन लागू करें।
  5. पिपेट धारक को सेल से दूर तेजी से ले जाकर पैच को एक्साइज करें (चित्रा 4 ए)।
    नोट: इस तरह से पैच को बाहर निकालने से एक अंदर-बाहर पैच बनना चाहिए, जिसमें प्रोटीन के साइटोसोलिक डोमेन छिड़काव प्रणाली के संपर्क में आते हैं। यदि अध्ययन के तहत न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट का स्थान साइटोसोलिक नहीं है, तो पीसीएफ प्रयोगों को करने के लिए बाहरी-आउट पैच या पूरे सेल रिकॉर्डिंग का उपयोग करना आवश्यक होगा।
  6. पैच पिपेट की नोक को छिड़काव प्रणाली की नोक के करीब लाएं, और जांचें कि पैच स्पेक्ट्रोमीटर मास्क (चित्रा 4 ए) के स्लिट के भीतर है।
  7. टीएनपी-एटीपी और छवि स्पेक्ट्रा को चरण 4.10-4.12 में लागू करें, जबकि एक साथ न्यूक्लियोटाइड अनुप्रयोग के लिए आयनिक वर्तमान प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करें।
    नोट: पिपेट ग्लास अधिग्रहित छवियों में स्थानिक विचलन और प्रतिबिंब पेश कर सकता है। हालांकि, ये विचलन अधिग्रहित स्पेक्ट्रा के आकार को प्रभावित नहीं करेंगे और परावर्तित उत्तेजना प्रकाश को स्पेक्ट्रोग्राफ या लॉन्ग-पास उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति से आसानी से अलग किया जाता है।
  8. स्पेक्ट्रा का विश्लेषण करें। पैच पिपेट के ग्लास से टीएनपी-एटीपी के बहिष्करण के कारण एक्साइज्ड पैच से चित्रित स्पेक्ट्रा अनबाउंड टीएनपी-एटीपी फ्लोरेसेंस के ओवर-घटाव का प्रदर्शन कर सकता है (चित्रा 4सी-ई)। यह अति-घटाव एएनएपी उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को प्रभावित नहीं करता है और इसलिए इसे अनदेखा किया जा सकता है।
    नोट: चूंकि एक्साइज्ड पैच में फ्लोरेसेंस सिग्नल बिना छत वाली झिल्ली की तुलना में कम होगा, इसलिए एक्सपोज़र समय का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो एएनएपी को बहुत तेजी से ब्लीच किए बिना पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर देता है।

Representative Results

चित्रा 2 सोनिकेशन द्वारा प्राप्त बिना छत वाली झिल्ली के टुकड़ों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापने के लिए बुनियादी प्रयोगात्मक सेटअप को दर्शाता है (चित्रा 2ए, बी)। बिना छत वाली झिल्लियों को प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का उपयोग किया गया था, पॉली-एल-लाइसिन-लेपित कवर स्लिप पर कोशिकाओं को सीधे संवर्धन करना या अनुपचारित ग्लास पर कोशिकाओं का संवर्धन करना और उन्हें अनरूफिंग से पहले पॉली-एल-लाइसिन (पानी में 0.1%) के लिए संक्षेप में उजागर करना। चित्रा 2 सी एक एचईके -293 टी सेल से एक विशिष्ट अनरूफ झिल्ली टुकड़े को दर्शाता है जो नारंगी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओएफपी) के साथ टैग किए गए केएटीपी चैनलों को व्यक्त करता है। बिना छत वाली झिल्लियां उज्ज्वल क्षेत्र छवियों में लगभग अदृश्य थीं और उन्हें टैग किए गए झिल्ली प्रोटीन की प्रतिदीप्ति द्वारा या ऑक्टाडेसिल रोडामाइन बी13 जैसे झिल्ली डाई के साथ काउंटर-स्टेनिंग द्वारा पहचाना गया था। बिना छत वाली झिल्लियों के अलावा, एचईके -293 टी कोशिकाओं के सोनिकेशन ने आंशिक रूप से बिना छत वाले सेल टुकड़े (चित्रा 2 डी) 10,17 का भी उत्पादन किया। ये टुकड़े उज्ज्वल क्षेत्र में दिखाई दे रहे थे। यह परेशान प्लाज्मा झिल्ली का परिणाम हो सकता है जो केवल कवर ग्लास के खराब पालन कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, इन टुकड़ों में इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल से पुटिका और झिल्ली हो सकते हैं। जैसे, केवल "सच्चे" बिना छत वाली झिल्ली से छवियों को प्राप्त करना बेहतर होता है, क्योंकि इंट्रासेल्युलर झिल्ली से जुड़े लेबल लक्ष्य प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल प्रसंस्करण और असेंबली के मध्यवर्ती चरणों को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। पॉली-एल-लाइसिन-लेपित ग्लास पर कोशिकाओं की खेती करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सोनिकेशन पर "सच्चे" बिना छत वाली झिल्ली की उच्च उपज होती है।

एक विशिष्ट प्रयोग (चित्रा 2 बी) में आवश्यक मात्रा को कम करने के लिए फ्लोरोसेंट न्यूक्लियोटाइड पर एक माइक्रोवॉल्यूम छिड़काव प्रणाली लागू की गई थी। प्रदान किए गए पॉलीमाइड-लेपित ग्लास टिप को हमारे छिड़काव सेट अप में हाथ से खींचे गए बोरोसिलिकेट ग्लास टिप के साथ बदल दिया गया था, जिसने प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि को कम कर दिया। छवि बनाई जा रही बिना छत वाली झिल्ली के चारों ओर न्यूक्लियोटाइड संचय को कम करने के लिए, पूरे स्नान कक्ष को धीरे-धीरे बफर के साथ संक्रमित किया गया था। इस प्रकार, हम अपने माइक्रोवॉल्यूम छिड़काव प्रणाली से समाधान परिवर्तन की दर को मापना चाहते थे और यह सत्यापित करना चाहते थे कि हम अपने रुचि के क्षेत्र में इच्छित लिगैंड एकाग्रता प्राप्त करने में सक्षम थे, यानी, हमारे छिड़काव प्रणाली से लिगैंड को बिना छत वाली झिल्ली तक पहुंचने से पहले सीधे स्नान मीडिया में पतला नहीं किया गया था। इन संभावनाओं को नियंत्रित करने के लिए, पानी के साथ एक कवर ग्लास-बॉटम डिश की सतह पर निर्देशित हमारे माइक्रोवॉल्यूम छिड़काव प्रणाली से टेट्रामेथिलरोडामाइन -5-मैलिमाइड (टीएमआरएम) के 50 μM समाधान के वॉश-इन और वॉश-आउट को मापा गया (चित्रा 2 ई)। समाधान विनिमय कैनेटीक्स प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे और वाश-इन और वॉश-आउट दोनों के लिए 1 सेकंड से कम समय स्थिरांक के साथ एकल घातीय क्षय द्वारा अच्छी तरह से वर्णित थे। इस तरह के समाधान विनिमय समय हमारे वर्तमान सेटअप में लिगैंड बाइंडिंग और अनबाइंडिंग के कैनेटीक्स को मापने की हमारी क्षमता को सीमित करते हैं। यह सत्यापित करने के लिए कि हम कवर स्लिप की सतह पर वांछित लिगैंड एकाग्रता प्राप्त करने में सक्षम थे, हमने अपने माइक्रोवॉल्यूम छिड़काव प्रणाली द्वारा कवर स्लिप में दिए गए 50 μM TMRM की प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना स्टिल बाथ (चित्रा 2F) में 50 μM TMRM से की। तीव्रता में कोई अंतर नहीं देखा गया, यह सत्यापित करते हुए कि हमारे माइक्रोवॉल्यूम छिड़काव प्रणाली के साथ कवर स्लिप की सतह पर उचित लिगैंड सांद्रता प्राप्त की जा सकती है, तब भी जब स्नान प्रभावित होता है।

चित्रा 3 ए 5 μM TNP-ATP के संपर्क में आने वाले HEK-239T सेल से एक बिना छत वाली झिल्ली में ANAP-टैग किए गए Kएटीपी चैनलों से प्राप्त वर्णक्रमीय छवि दिखाता है। ऐसी छवियों को प्राप्त करने के लिए, बिना छत वाली झिल्ली से उत्सर्जित प्रकाश को सीसीडी कैमरे के साथ श्रृंखला में स्पेक्ट्रोमीटर के माध्यम से निर्देशित किया गया था। उत्सर्जित प्रतिदीप्ति को झंझरी से अलग किया गया और स्पेक्ट्रा का उत्पादन करते हुए कैमरा चिप पर प्रक्षेपित किया गया। परिणामी छवियां वाई आयाम में स्थानिक जानकारी को बनाए रखती हैं, लेकिन एक्स आयाम को तरंग दैर्ध्य के साथ बदल दिया गया था। बिना छत वाली झिल्ली के अनुरूप रुचि का क्षेत्र (आरओआई), नारंगी में उल्लिखित है। छवि में उच्च तीव्रता के दो क्षेत्र स्पष्ट हैं, जो एएनएपी और टीएनपी-एटीपी के चरम उत्सर्जन के अनुरूप हैं। चित्र 3बी में दिखाए गए तरंगदैर्ध्य-दर-तरंगदैर्ध्य-औसत (पूरे आरओआई पर) स्पेक्ट्रम में इसकी सबसे अच्छी सराहना की गई थी। शिखर ~ 470 एनएम के एटीपी में शामिल एएनएपी से मेल खातीहै; शिखर ~ 535 एनएम टीएनपी-एटीपी से मेल खाती है। समाधान में टीएनपी-एटीपी की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और प्रत्यक्ष उत्तेजना को सही करने के लिए, प्रत्येक छवि से एक पृष्ठभूमि क्षेत्र (चित्रा 3 ए, ग्रे) का चयन किया गया था। औसत पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम चित्रा 3 बी में दिखाया गया है। अंतिम स्पेक्ट्रम औसत आरओआई स्पेक्ट्रम (चित्रा 3 सी) से औसत पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम को घटाकर प्राप्त किया गया था।

एएनएपी फोटोब्लीचिंग कलाकृतियों के लिए प्रवण है। चित्रा 3 डी कई एक्सपोजर के बाद पीक एएनएपी फ्लोरेसेंस में कमी को दर्शाता है। टीएनपी-एटीपी (या टीएनपी-एटीपी की सांद्रता के बीच धोने से) की अनुपस्थिति में कई एक्सपोज़र से पीक फ्लोरेसेंस को एकल-घातीय क्षय में फिट किया गया था और इसका उपयोग फोटोब्लीचिंग कलाकृतियों (चित्रा 3 ई) को सही करने के लिए किया गया था। कम-से-उच्च और उच्च-से-निम्न न्यूक्लियोटाइड सांद्रता दोनों से एकाग्रता-प्रतिक्रिया प्रयोगों का प्रदर्शन करने की सिफारिश की जाती है। यदि ब्लीचिंग सुधार किसी भी अतिरिक्त कलाकृतियों को पेश नहीं करता है, तो परिणाम तुलनीयहोना चाहिए।

चित्रा 5 ए टीएनपी-एटीपी की अनुपस्थिति और उपस्थिति में एएनएपी-टैग किए गए केएटीपी चैनलों को व्यक्त करने वाले सेल से प्राप्त एक बिना छत वाली झिल्ली से प्रतिनिधि वर्णक्रमीय छवियों को दर्शाता है। सही स्पेक्ट्रा चित्रा 5 बी में दिखाया गया है। उत्सर्जन स्पेक्ट्रा का अवलोकन करते हुए, दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के बीच एक स्पष्ट अलगाव था। चूंकि टीएनपी-एटीपी का कुछ गैर-विशिष्ट बंधन असंक्रमित एचईके -293 टी कोशिकाओं से भोले प्लाज्मा झिल्ली में देखा गया था, इसलिए दाता (एएनएपी) प्रतिदीप्ति10,11 में कमी के रूप में फ्रेट की मात्रा निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है। यह शिखर लेबल रिसेप्टर के लिए विशिष्ट था।

लिगेंड के लिए जो उनके रिसेप्टर में एक संवहन परिवर्तन को प्रेरित करते हैं, अलगाव में बाध्यकारी अध्ययन लिगैंड बाइंडिंग प्रक्रिया18 के बारे में प्रत्यक्ष, यांत्रिक रूप से सार्थक जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। लिगैंड बाइंडिंग के लिए एकाग्रता-प्रतिक्रिया संबंध न केवल आंतरिक बाध्यकारी आत्मीयता पर निर्भर करता है, बल्कि लिगैंड बाइंडिंग द्वारा प्रेरित विरूपण परिवर्तन, और लिगैंड की अनुपस्थिति में रचना को बदलने के लिए रिसेप्टर की अंतर्निहित प्रवृत्ति पर भी निर्भर करता है। लिगैंड-रिसेप्टर इंटरैक्शन को रेखांकित करने वाली प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए, बाध्यकारी माप को प्रयोगों के साथ जोड़ा जा सकता है जो प्रोटीन फ़ंक्शन का रीडआउट प्रदान करते हैं। इसके लिए, आयन चैनल एक आदर्श मॉडल प्रणाली हैं, क्योंकि उनकी धाराओं को वोल्टेज क्लैंप का उपयोग करके एकल-अणु स्तर तक उप-एमएस समय संकल्प के साथ मापा जा सकता है। ऐतिहासिक रूप से, युग्मित वर्तमान और प्रतिदीप्ति माप ने वोल्टेज- और लिगैंड-गेटेड आयन चैनलों 19,20,21 के उद्घाटन और समापन (गेटिंग) में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है। विभिन्न चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-विनियमित चैनलों22,23,24 के लिए आयनिक धाराओं और फ्लोरोसेंट चक्रीय न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को एक साथ मापने के लिए प्रयोग किए गए हैं। इन अध्ययनों ने एक लिगैंड को नियोजित किया जिसने बाध्यकारी होने पर अपनी क्वांटम उपज में वृद्धि की। पैच के पास समाधान की मात्रा में अनबाउंड लिगैंड से प्रतिदीप्ति को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी22,23 का उपयोग करके पैच की इमेजिंग करके घटाया जा सकता है। हमारे अध्ययनों में, एएनएपी प्रतिदीप्ति में कमी का उपयोग करके बाइंडिंग को मापा गया था। चूंकि यह संकेत चैनल के लिए विशिष्ट है और एएनएपी और टीएनपी-एटीपी के बीच फ्रेट दृढ़ता से दूरी पर निर्भर है (~ 43 पर आधा अधिकतम), गैर-विशेष रूप से बाध्य और अनबाउंड न्यूक्लियोटाइड द्वारा हमारे सिग्नल के संदूषण से बचा गया था।

चित्रा 4 ए एक विशिष्ट पैच-क्लैंप फ्लोरोमेट्री (पीसीएफ) प्रयोग दिखाता है। एक खारा भरा बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट (वोल्टेज क्लैंप एम्पलीफायर से जुड़ा हुआ) और एएनएपी-टैग किए गए केएटीपी को व्यक्त करने वाले सेल के बीच एक उच्च प्रतिरोध (जी) सील का गठन किया गया था। सील गठन के बाद, पिपेट को सेल से दूर खींच लिया गया, जिससे इंट्रासेल्युलर न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइटों तक पहुंच की अनुमति मिली। पिपेट को तब माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर तैनात किया गया था, जो स्पेक्ट्रोमीटर मास्क के स्लिट पर केंद्रित था और माइक्रोवॉल्यूम छिड़काव प्रणाली (बोरोसिलिकेट ग्लास टिप के साथ संशोधित) के बहिर्वाह को पिपेट (चित्रा 4 डी) के करीब लाया गया था। वोल्टेज को नियंत्रित किया गया था और पैच में चैनलों से धाराओं को मापा गया था। एएनएपी-टैग किए गए केएटीपी चैनलों से प्रतिनिधि धाराओं और स्पेक्ट्रा को चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, स्पेक्ट्रा को धाराओं से मेल खाने के लिए रंग कोडित किया गया है। उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को पृष्ठभूमि और विरंजन के लिए ठीक किया गया था क्योंकि बिना छत वाली झिल्लियों के लिए।

Figure 1
चित्रा 1: एएनएपी और टीएनपी-एटीपी एक उपयुक्त फ्रेट जोड़ी बनाते हैं। (ए) एएनएपी और टीएनपी-एटीपी की संरचनाएं। फ्लोरोसेंट मोइटीज पर प्रकाश डाला गया है। (बी) एएनएपी और टीएनपी-एटीपी के अवशोषण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। फ्रेट के लिए एएनएपी उत्सर्जन और टीएनपी-एटीपी अवशोषण के बीच ओवरलैप की आवश्यकता होती है। (क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन लाइसेंस, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 10 के तहत प्रकाशित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बिना छत वाले प्लाज्मा झिल्ली में न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापना। (ए) फ्लोरोसेंट झिल्ली प्रोटीन को व्यक्त करने वाले अनुयायी कोशिकाओं से बिना छत वाले प्लाज्मा झिल्ली की तैयारी के लिए योजनाबद्ध। पॉली-एल-लाइसिन-लेपित या अनुपचारित कवर पर्ची पर उगाई गई कोशिकाओं के लिए निर्देश प्रदान किए जाते हैं। (बी) बिना छत वाली झिल्ली में न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापने के लिए प्रायोगिक सेटअप। (सी) नारंगी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओएफपी) टैग किए गए केएटीपी चैनलों को व्यक्त करने वाले सेल से प्राप्त एक पूरी तरह से बिना छत वाली प्लाज्मा झिल्ली की उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियां। तारांकन झिल्ली की स्थिति को चिह्नित करता है, जो उज्ज्वल-क्षेत्र छवि में लगभग अदृश्य है। ओएफपी 531/40 एनएम बैंड-पास फिल्टर के माध्यम से एक व्यापक 565 एनएम एलईडी के साथ उत्साहित था और 562 एनएम एज डाइक्रोइक और उत्सर्जित प्रकाश 593/40 एनएम बैंड-पास फिल्टर के माध्यम से एकत्र किया गया था। (डी) नारंगी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओएफपी) टैग किए गए केएटीपी चैनलों को व्यक्त करने वाले सेल से प्राप्त आंशिक रूप से बिना छत वाली झिल्ली के टुकड़े की उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियां। (ई) बी में वर्णित सेटअप का उपयोग करके प्राप्त समाधान विनिमय समय पाठ्यक्रम पांच तकनीकी प्रतिकृतियां दिखाई गई हैं। माइक्रोवॉल्यूम छिड़काव प्रणाली 50 μM टेट्रामेथिलरोडामाइन-5-मैलिमाइड (TMRM) से भरी हुई थी। स्नान को ~ 0.5 एमएल / मिनट की दर से पानी से भरा गया था। वॉश-ऑन (बढ़ती प्रतिदीप्ति) और वॉश-आउट (घटती प्रतिदीप्ति) समय पाठ्यक्रमों के डेटा फॉर्म एफ = ए * एक्सपी (-एक्स / 3) + वाई0 के एकल घातीय क्षय के साथ फिट थे। वॉश-इन के लिए समय स्थिरांक ~ 0.6 सेकंड था। टीएमआरएम 540/25 एनएम बैंड-पास फिल्टर के माध्यम से एक व्यापक 565 एनएम एलईडी के साथ उत्साहित था और 565 एनएम एज डाइक्रोइक और उत्सर्जित प्रकाश 605/55 एनएम बैंड-पास फिल्टर के माध्यम से एकत्र किया गया था। (एफ) बी में माइक्रोवॉल्यूम छिड़काव प्रणाली का उपयोग करके लागू टीएमआरएम के 50 μM समाधान की प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना और 50 μM TMRM युक्त एक स्थिर स्नान है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पृष्ठभूमि घटाव और विरंजन सुधार। (ए) एएनएपी-लेबल केएटीपी चैनलों को व्यक्त करने वाले सेल से एक बिना छत वाली प्लाज्मा झिल्ली की वर्णक्रमीय छवि (वाई आयाम में स्थानिक जानकारी, एक्स आयाम में तरंग दैर्ध्य)। 5 μM TNP-ATP चित्रा 2B में वर्णित सेटअप का उपयोग कर लागू किया गया था। नारंगी बॉक्स रुचि के क्षेत्र (आरओआई) को दर्शाता है, जो बिना छत वाली झिल्ली के अनुरूप है। ग्रे बॉक्स स्पेक्ट्रम को सही करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पृष्ठभूमि क्षेत्र को दर्शाता है। (B) A में ROI और पृष्ठभूमि क्षेत्रों के तरंगदैर्ध्य-दर-तरंगदैर्ध्य औसत से प्राप्त उत्सर्जन स्पेक्ट्रा. (C) स्पेक्ट्रम B में औसत ROI स्पेक्ट्रम से औसत पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम को घटाकर प्राप्त किया जाता है। औसत तीव्रता निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एएनएपी शिखर के चारों ओर 5 एनएम विंडो को ग्रे छायांकित क्षेत्र के रूप में दिखाया गया है। (डी) स्पेक्ट्रा ने एएनएपी-लेबल केएटीपी चैनलों को व्यक्त करने वाले सेल से एक बिना छत वाली प्लाज्मा झिल्ली के लगातार छह 10-एस एक्सपोजर से प्राप्त किया। फोटोब्लीचिंग के परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति में कमी पर ध्यान दें। इनसेट सामान्यीकृत पीक फ्लोरेसेंस फिट को F/Fअधिकतम = A*exp(-t/o) + (1-A) फॉर्म के एकल घातीय क्षय के साथ दर्शाता है। स्पेक्ट्रा से मेल खाने के लिए इनसेट में प्रतीकों को रंग-कोडित किया गया है। (ई) फोटोब्लीचिंग के लिए डी में ठीक किए गए स्पेक्ट्रा के समान स्पेक्ट्रा। इनसेट डी से सामान्यीकृत पीक फ्लोरेसेंस को खुले सर्कल के रूप में दिखाता है, जिसमें भरे हुए सर्कल का उपयोग करके सही पीक फ्लोरेसेंस दिखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पैच-क्लैंप फ्लोरोमेट्री (पीसीएफ) का उपयोग करके न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग और चैनल धाराओं का एक साथ माप। (ए) न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग और आयनिक धाराओं को मापने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप दिखाने वाला योजनाबद्ध। (बी) उदाहरण धाराएं (बाएं) और स्पेक्ट्रा (दाएं) एएनएपी-लेबल केएटीपी चैनलों को व्यक्त करने वाले सेल से उत्पादित झिल्ली पैच से प्राप्त होती हैं। धाराओं को -60 mV की होल्डिंग क्षमता पर दर्ज किया गया था, 20 kHz पर डिजिटाइज़ किया गया था, और 5 kHz पर फ़िल्टर किया गया था। ग्रे छायांकित क्षेत्र तरंग दैर्ध्य सीमा से मेल खाता है जहां से एएनएपी तीव्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी। (क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन लाइसेंस, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 11 के तहत प्रकाशित। (ग) 1 एमएम टीएनपी-एटीपी के संपर्क में आने वाले एएनएपी-लेबल वाले केएटीपी चैनलों को व्यक्त करने वाले सेल से उत्पादित झिल्ली पैच से प्राप्त स्पेक्ट्रम। तरंगदैर्ध्य सीमा के अनुरूप नकारात्मक शिखर पर ध्यान दें जिस पर टीएनपी-एटीपी प्रतिदीप्ति देखी जाती है। ग्रे छायांकित क्षेत्र एएनएपी प्रतिदीप्ति को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली तरंग दैर्ध्य सीमा को दर्शाता है जैसा कि बी में अशर एट अल से अनुकूलित है (क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन लाइसेंस, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 11 के तहत प्रकाशित। (डी) 1 एमएम टीएनपी-एटीपी के संपर्क में आने वाले पैच पिपेट की उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियां। तारांकन पिपेट की नोक को चिह्नित करता है। (ई) 1 एमएम टीएनपी-एटीपी में एक ही पैच पिपेट की वर्णक्रमीय छवि। तारांकन चिह्न पिपेट की स्थिति को चिह्नित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: टीएनपी-एटीपी एएनएपी-लेबल केएटीपी चैनलों के लिए बाध्यकारी। (ए) टीएनपी-एटीपी की अनुपस्थिति में या 50 μM या 1 mM TNP-ATP की उपस्थिति में ANAP-लेबल वाले KATP चैनलों को व्यक्त करने वाले सेल से एक बिना छत वाली प्लाज्मा झिल्ली की वर्णक्रमीय छवियां। तीव्रता को गर्मी मानचित्र के रूप में दिखाया गया है। (बी) ए में छवियों से तरंग दैर्ध्य-दर-तरंगदैर्ध्य-औसत स्पेक्ट्रा टीएनपी-एटीपी द्वारा एएनएपी प्रतिदीप्ति के शमन को दर्शाता है। छायांकित क्षेत्र दो अलग-अलग बैंड-पास फिल्टर का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनका उपयोग स्पेक्ट्रोमीटर उपलब्ध नहीं होने पर एएनएपी शमन को मापने के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: बिना छत वाली झिल्लियों और पीसीएफ में टीएनपी-एटीपी द्वारा एएनएपी-लेबल केएटीपी चैनलों का शमन। (क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन लाइसेंस, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 11 के तहत प्रकाशित। डेटा हिल समीकरण के लिए फिट थे: F / F max = E max + (1 – Eअधिकतम) / (1 + 10 (EC50 –[TNP-ATP])*h)। एफ मापा प्रतिदीप्ति है, एफ मैक्स न्यूक्लियोटाइड की अनुपस्थिति में अधिकतम प्रतिदीप्ति है, ईमैक्स न्यूक्लियोटाइड सांद्रता को संतृप्त करने पर अधिकतम शमन है, और एच हिल ढलान है। ईसी 50, (न्यूक्लियोटाइड एकाग्रता जिस पर शमन आधा अधिकतम है) और [टीएनपी-एटीपी] लॉग मान हैं। बिना छत वाली झिल्ली: ईसी 50 = -4.59 (25.7 μM), h = 0.82, Eअधिकतम = 0.93। PCF: EC50 = -4.11 (77.6 μM), h = 0.87, Eअधिकतम = 1.00। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हमने बरकरार झिल्ली प्रोटीन के लिए वास्तविक समय में एडेनिन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापने के लिए एक विधि विकसित की है। हमारी विधि कई अन्य स्थापित तकनीकों पर आधारित है, जिसमें एम्बर स्टॉप कोडन दमन 12, सेल अनरूफिंग 14, और वोल्टेज-क्लैंप फ्लोरोमेट्री / पीसीएफ 19,20,21,22,23,24,25 का उपयोग करके एएनएपी के साथ प्रोटीन की लेबलिंग शामिल है।. इन दृष्टिकोणों का संश्लेषण उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के माप की अनुमति देता है। दरअसल, हमारे पिछले काम में, हम इस दृष्टिकोण10,11 का उपयोग करके एक ही प्रोटीन कॉम्प्लेक्स पर विभिन्न बाध्यकारी साइटों के बीच अंतर करने में सक्षम थे। महत्वपूर्ण रूप से, इस तकनीक को प्रोटीन फ़ंक्शन को संरक्षित करने वाली स्थितियों के तहत सेलुलर वातावरण में प्रोटीन की छोटी मात्रा पर सीधे लागू किया जा सकता है। आयन चैनल धाराओं के प्रत्यक्ष, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रीडआउट के साथ संयोजन में हमारी बाध्यकारी विधि का उपयोग करने से हमें चैनल गेटिंग11 के आणविक आधार में समृद्ध अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति मिलती है।

चूंकि स्पेक्ट्रोमीटर प्रयोगशाला उपकरणों का एक गैर-मानक टुकड़ा है, इसलिए बैंड-पास फिल्टर का उपयोग करके सापेक्ष अलगाव में एएनएपी तीव्रता की निगरानी भी की जा सकती है। चित्रा 5 बी ऐसे दो फिल्टर के वर्णक्रमीय गुणों को दर्शाता है। 470/10 एनएम बैंड-पास फ़िल्टर प्रभावी रूप से टीएनपी-एटीपी से प्रतिदीप्ति संकेत को स्क्रीन करता है और पीक एएनएपी फ्लोरेसेंस के साथ अच्छी तरह से ओवरलैप करता है। हालांकि, इस फिल्टर का पीक ट्रांसमिशन केवल 50% के आसपास है, जिससे मंद झिल्ली (या वोल्टेज क्लैंप के तहत उत्पादित झिल्ली पैच में) से अच्छे संकेत प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। एक अन्य विकल्प 460/60 एनएम बैंड-पास फिल्टर है। 470/10 एनएम फिल्टर की तुलना में 460/60 एनएम फिल्टर और टीएनपी-एटीपी उत्सर्जन शिखर के पैर के बीच थोड़ा अधिक ओवरलैप है। हालांकि, 460/60 एनएम बैंड-पास में एएनएपी शिखर की एक विस्तृत श्रृंखला पर 90-95% का संप्रेषण है, जिससे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन संकेत को बढ़ावा मिलने की उम्मीद होगी।

एएनएपी एक पर्यावरण के प्रति संवेदनशील फ्लोरोफोरे 12,26,27 है। चरम उत्सर्जन और क्वांटम उपज रुचि के प्रोटीन पर निगमन की साइट के आधार पर भिन्न होती है और प्रोटीन के अनुरूपण बदलने के साथ बदल सकती है। इस तरह के परिवर्तन उत्सर्जन स्पेक्ट्रा से तुरंत स्पष्ट होंगे, लेकिन फिल्टर का उपयोग करके एएनएपी तीव्रता को मापने पर स्पष्ट नहीं होगा। किसी भी मामले में, यह प्रदर्शित करने के लिए उचित नियंत्रण की आवश्यकता होती है कि न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के बाद एएनएपी के आसपास के स्थानीय वातावरण में परिवर्तन के कारण प्रतिदीप्ति संकेत भिन्न नहीं होता है। अनलेबल न्यूक्लियोटाइड ्स के साथ नियंत्रण प्रयोग यह सत्यापित करने में मदद कर सकते हैं कि एएनएपी तीव्रता में कोई भी परिवर्तन एएनएपी और टीएनपी-न्यूक्लियोटाइड के बीच फ्रेट का परिणाम है। टीएनपी-न्यूक्लियोटाइड ्स गैर-विशेष रूप से असंक्रमित कोशिकाओं (या तो प्लाज्मा झिल्ली या देशी झिल्ली प्रोटीन) से प्राप्त झिल्ली से बंध सकते हैं। हम दाता प्रतिदीप्ति में कमी के रूप में बाइंडिंग की मात्रा निर्धारित करते हैं, क्योंकि यह संकेत लेबल चैनल के लिए विशिष्ट है। हालांकि, हम प्रत्येक एगोनिस्ट / रिसेप्टर जोड़ी के लिए अतिरिक्त नियंत्रण प्रयोग करने की सलाह देते हैं, उदाहरण के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट को म्यूटेट करना, यदि ज्ञात हो, यह सत्यापित करने के लिए कि दाता प्रतिदीप्ति में परिवर्तन वास्तव में लेबल रिसेप्टर11 के लिए प्रत्यक्ष बंधन का परिणाम है। अंत में, एएनएपी लेबल के अलावा फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग वाले निर्माणों के साथ काम करने की सिफारिश की जाती है। यह पृष्ठभूमि / ऑटोफ्लोरेसेंस से लेबल रिसेप्टर फ्लोरेसेंस को अलग करने में मदद करता है। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को उत्सर्जन स्पेक्ट्रा10 के शिखर और आकार से एएनएपी से अलग किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के निर्धारण बहुत मुश्किल हो सकते हैं जब केवल फिल्टर सेट का उपयोग किया जाता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं और अनरूफ ्ड झिल्ली को एएनएपी को उत्तेजित किए बिना फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग का उपयोग करके पहचाना जा सकता है और अत्यधिक फोटोब्लीचिंग का जोखिम नहीं उठाया जा सकता है।

हमारे कई पीसीएफ रिकॉर्ड में, हमने उच्च टीएनपी-एटीपी सांद्रता (चित्रा 4 सी) पर हमारे स्पेक्ट्रा में एक मजबूत नकारात्मक शिखर देखा। यह नकारात्मक शिखर हमारे पृष्ठभूमि घटाव प्रोटोकॉल की एक कलाकृति है। चित्रा 4 डी 1 एमएम टीएनपी-एटीपी के संपर्क में आने वाले पैच पिपेट की उज्ज्वल-क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों को दिखाता है। पिपेट टिप पर एक छाया स्पष्ट है, जिसके परिणामस्वरूप पिपेट की दीवारों की मात्रा से टीएनपी-एटीपी का बहिष्करण होता है, जो फोकस के तल के भीतर सबसे अधिक स्पष्ट है। चित्रा 4 ई में वर्णक्रमीय छवि इस छाया के अनुरूप एक अंधेरे बैंड दिखाती है। जब इस डार्क बैंड के ऊपर या नीचे के क्षेत्र का उपयोग पृष्ठभूमि घटाव के लिए किया जाता है, तो यह एक नकारात्मक शिखर पैदा करता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह शिखर टीएनपी-एटीपी उत्सर्जन के अनुरूप एक तरंग दैर्ध्य सीमा पर हुआ और एएनएपी शमन के हमारे माप को प्रभावित नहीं किया।

हमारे प्रयोगों की प्रमुख सीमा प्रतिदीप्ति को मापने के लिए एएनएपी-टैग किए गए निर्माणों की पर्याप्त प्लाज्मा झिल्ली अभिव्यक्ति प्राप्त करना था। पीसीएफ की तुलना में बिना छत वाली झिल्लियों से उच्च गुणवत्ता वाले स्पेक्ट्रा प्राप्त करना आम तौर पर आसान था, क्योंकि उनके बड़े आकार और पीसीएफ के विपरीत, बिना छत वाली झिल्ली के पूरे डिश को जल्दी से स्कैन करने की हमारी क्षमता के कारण, जहां पैच केवल एक बार में प्राप्त किए जा सकते हैं। हमारे प्रयोगों में, बिना छत वाली झिल्ली और पीसीएफ प्रयोगों के डेटा समान थे लेकिन समकक्ष नहीं थे (चित्रा 6)11)। हालांकि, कोई प्राथमिक कारण नहीं है कि यह एक सार्वभौमिक अवलोकन क्यों होना चाहिए क्योंकि पैच पिपेट में प्रोटीन बिना छत वाली झिल्ली की तुलना में एक अलग कार्यात्मक अवस्था में हो सकता है।

यहां, हमारे एएनएपी-टैग किए गए निर्माणों की अभिव्यक्ति को अधिकतम करने के प्रयास किए गए हैं, विशेष रूप से सेल संस्कृति के तापमान को 33 डिग्री सेल्सियस10,11,16 तक कम करना। हमारे अनुभव में, प्रोटीन में साइटों की पहचान करने का प्रयास जिस पर एएनएपी एक रूढ़िवादी प्रतिस्थापन होगा, लगातार उन निर्माणों में परिणाम नहीं हुआ जो अच्छी तरह से व्यक्त किए गए थे। हमें एएनएपी निगमन साइटों के लिए पूरे प्रोटीन क्षेत्रों को व्यवस्थित रूप से स्कैन करने और सतह अभिव्यक्ति10 के लिए उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग करने में अधिक सफलता मिली। एएनएपी लेबलिंग सिस्टम जेनोपस लेविस ओसाइट्स में भी काम करता है, जो बहुत बड़े झिल्ली पैच को एक्साइज करने की अनुमति देता है, इस प्रकार शोर 26,27,28 को संकेत बढ़ाता है।

जबकि अभिव्यक्ति के बड़े स्तरों के परिणामस्वरूप उज्ज्वल संकेतों की उम्मीद की जाती है, प्रतिदीप्ति को मापने के लिए आवश्यक चैनलों की न्यूनतम संख्या कई कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें फ्लोरोफोरे की चमक, फोटोब्लीचिंग की डिग्री, उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता और फोकस का विमान शामिल है। सिद्धांत रूप में, प्रतिदीप्ति तीव्रता और चैनल प्रवाह को सहसंबंधित करके अनुमान लगाया जा सकता है जैसा कि पहले28,29 दिखाया गया है। हालांकि, ऐसे अनुमानों की विश्वसनीयता के लिए एकल-चैनल चालकता और चैनल की खुली संभावना के कुछ ज्ञान की आवश्यकता होती है। ऊपर सूचीबद्ध कारकों के अलावा, प्रतिदीप्ति संकेत पुटिकाओं या प्लाज्मा झिल्ली के वर्गों से जुड़े चैनलों से भी प्रभावित होगा जो पिपेट ग्लास से चिपके हुए हैं जो वोल्टेज क्लैंप के तहत नहीं हैं।

यह विधि अन्य न्यूक्लियोटाइड-संवेदनशील आयन चैनलों के अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलित है। सीएफटीआर संरचनात्मक रूप से केएटीपी30,31 के सहायक सल्फोनीलुरिया रिसेप्टर सबयूनिट के समान है। जैसे केएटीपी सीएफटीआरआई गेटिंग न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग द्वारा नियंत्रित की जाती है, जिससे यह हमारी विधि7 का एक स्पष्ट भविष्य का लक्ष्य बन जाता है। प्यूरीनर्जिक पी 2 एक्स रिसेप्टर्स आयन चैनल हैं जो बाह्य एटीपी9 द्वारा गेट किए जाते हैं। टीएनपी-एटीपी पी 2 एक्स रिसेप्टर्स32,33 के लिए एक विरोधी के रूप में कार्य करता है। इसलिए, यह पी 2 एक्स सक्रियण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी नहीं होगा, हालांकि इसका उपयोग पी 2 एक्स एगोनिस्ट के साथ प्रतिस्पर्धा परख में किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सक्रियण का अध्ययन करने के लिए एएनएपी उत्सर्जन के साथ पर्याप्त वर्णक्रमीय ओवरलैप वाले अन्य फ्लोरोसेंट एटीपी डेरिवेटिव का उपयोग किया जा सकता है। एलेक्सा -647-एटीपी एक फ्लोरोसेंट पी 2 एक्स एगोनिस्ट34 है। एलेक्सा -647 और एएनएपी के बीच गणना की गई आर0 ~ 85 ए है, जिसका अर्थ है कि पी 2 एक्स के लिए सीधे बंधन के परिणामस्वरूप चैनल में शामिल एएनएपी का पर्याप्त शमन होना चाहिए। हालांकि, इस तरह के लंबे आर0 के परिणामस्वरूप पड़ोसी सबयूनिट्स से बंधे एलेक्सा -647-एटीपी से शमन भी होगा और संभावना बढ़ जाती है कि गैर-विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के परिणामस्वरूप फ्रेट होगा। चूंकि पी 2 एक्स रिसेप्टर्स में लिगैंड बाइंडिंग साइट बाह्य है, बाध्यकारी माप बरकरार कोशिकाओं पर, पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप में, या बाहर-बाहर झिल्ली पैच में किया जाएगा। हमारी विधि को इलेक्ट्रोजेनिक और गैर-इलेक्ट्रोजेनिक ट्रांसपोर्टरों और पंपों के बंधन और सक्रियण का अध्ययन करने के लिए भी बढ़ाया जा सकता है जो अपने प्रतिक्रिया चक्र के साथ-साथ जी प्रोटीन युग्मित पी 2 वाई रिसेप्टर्स के लिए एटीपी पर निर्भर करते हैं। अंत में, भले ही हमने एडेनिन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग (टीएनपी-एटीपी, टीएनपी-एडीपी, टीएनपी-एएमपी) को मापने के लिए इस विधि को विकसित किया है, उसी दृष्टिकोण का उपयोग लगभग किसी भी रिसेप्टर के लिए बाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिसके लिए एक उपयुक्त, फ्लोरोसेंट लिगैंड की पहचान की गई है।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए राउल टेरोन एक्सपोसिटो को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबी / R002517 / 1) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; एमसीपी और एफएमए) और वेलकम ट्रस्ट (203731 / जेड / 16 / ए; एसजीयू)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T75 tissue-culture treated flask StarLab CC7682-4875
0.1% w/v poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
30 mm borosilicate cover glass slips VWR 631-0174
35 mm non-treated sterile dishes CytoOne CC7672-3340
35 mm cover glass bottom dish WPI FD35-PDL-100
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 31966021
Foetal bovine serum (FBS) Gibco 10500-064
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
TrypLE select (tryosin) Gibco 12563-011 Trypsin/EDTA reagent
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14040-091
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-035
HEK293T cells ATTC CRL-3216 Used between passages 5-30
ANAP-TFA AsisChem ASIS-0014 Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM
pANAP expression plasmid Addgene Plasmid #48696 Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein
peRF1-E55D Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor
TransIT-LT1 Mirus Bio MIR 2300 Lipopolyplex transfection reagent
Thick-walled borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15
Tetramethylrhodamine-5-maleimide Sigma-Aldrich 94506
TNP-ATP Jena Bioscience NU-221L Delivered at 10 mM in water
Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope Nikon
60x water immersion objective (1.4 NA) Nikon MRD07602
4-Wavelength High-Power LED Head ThorLabs LED4D245 385/490/565/625 nm LEDs
Four-Channel LED Driver ThorLabs DC4100
390/18 nm band-pass excitation filter ThorLabs MF390-18 For ANAP excitation
400 nm long-pass emission filter ThorLabs FEL0400 For imaging ANAP spectra
416 nm edge dichroic ThorLabs MD416 For imaging ANAP spectra
460/60 nm band-pass emission filter ThorLabs MF460-60 Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
470/10 nm band-pass emission filter ThorLabs FB470-10 Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)
531/40 band-pass excitation filter Brightline FF01-531/40-25 For orange fluorescent protein (OFP) excitation
540/25 nm band-pass excitation filter Chroma D540/25X For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation
562 nm edge dichroic Semrock FF562-Di03 For imaging OFP fluorescence
565 nm edge dichroic Chroma 565DC For imaging TMRM fluorescence
593/40 nm band-pass excitation filter Brightline FF01-387/11-25 For imaging OFP fluorescence
605/55 nm band-pass emission filter Chroma D605/55M For imaging TMRM fluorescence
IsoPlane-160 Imaging Spectrometer Princeton Instruments IsoPlane-160
PIXIS 400BR_eXcelon Camera Princeton Instruments PIXIS: 400BR_eXcelon
Axopatch 200B amplifier Molecular Devices Axopatch 200B-2
Digidata 1440A digitizer Molecular Devices Digidata 1440A
Probe sonicator Sonics & Materials VC-50 For unroofing
REGLO digital peristaltic pump Ismatec ISM 832 For bath perfusion
Microvolume perfusion system ALA Scientific Instruments ALA μFlow-8 For TNP-ATP perfusion
pClamp 10.6.2 Molecular Devices Recording and analysing currents
Lightfield 5.20.1507 Princeton Instruments Acquisition software for images and spectra
Matlab Mathworks For data analysis
Python 3.8.1 Python Software Foundation For data analysis

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References

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