Summary
在这项研究中，利用附在实验鼠的胶囊，开发了硬滴答的仙女和幼虫阶段的喂养系统。喂养胶囊由柔性材料制成，并牢固地固定在小鼠上至少一周，并允许对滴答声喂养进行舒适的监测。
Abstract
滴答声是所有发育阶段（鸡蛋除外）的强制性血液喂养寄生虫，并被公认为各种病原体的载体。在滴答声研究中使用小鼠模型对于了解它们的生物学和滴答声-宿主-病原体相互作用至关重要。在这里，我们展示了一种非费力的技术，用于在实验鼠身上喂养未成熟的硬滴答阶段。该方法的优点是简单、持续时间短，以及在实验的不同时间点监视或收集刻度的能力。此外，该技术允许在同一只小鼠上连接两个单独的胶囊，这有利于各种实验，其中需要两组不同的虱子以同一动物为食。非刺激性、柔性胶囊由易于接近的材料制成，可最大限度地减少实验动物的不适。此外，安乐死是没有必要的，小鼠在实验后完全恢复，并可供重新使用。
Introduction
滴答声是几种病原体的重要载体，对动物和人类健康构成严重威胁。建立有效的喂养系统对于研究它们的生物学、虱子-宿主-病原体相互作用或建立有效的控制措施至关重要。目前，一些人工喂养系统，避免使用活的动物可用于滴答声,2，3，4，4这些应使用，只要实验条件允许。3然而，在各种实验环境中，这些系统不能适当地模仿特定的生理特征，使用活的动物是取得相关结果所必需的。
实验鼠通常用于研究许多生物系统，并经常用作宿主喂养虱子5，6，7，8，9。,6,7,8,9在小鼠身上喂养未成熟虱子的两种最常见的方法包括自由侵扰和使用附着在小鼠身上的禁闭室。自由侵扰主要用于幼虫阶段和被感染的虱子可以下降到一个区域，他们可以恢复。禁闭室通常由丙烯酸或聚丙烯帽组成，粘在鼠标的背上。第一种技术是用于滴答声喂养的有效自然系统，但不允许在实验期间进行密切监测，因为单个滴答声分散在宿主体的不同部位。此外，跌落到恢复区会感染粪便和尿液10、11、12、13、14，,11,12,13,14如果动物与恢复区15之间没有分离，可能会严重影响虱子的体能，或被老鼠损坏或吃掉。基于腔室的系统允许将滴答声限制到一个定义的区域，但是，粘合过程是费力的，帽通常与胶水粘附微弱，因此它们经常在实验16、17、18、19,17,18期间分离。帽子也僵硬，不舒服，并导致皮肤反应，这防止了小鼠的再使用，并需要他们在实验后安乐死。
在之前的研究中，我们成功地开发了一种有效的系统，使用乙烯醋酸乙烯（EVA）泡沫制成，用于喂养实验室兔子20的虱子。在这里，我们调整这个系统到鼠标模型，并提出了一个简单和干净的方法，以饲料不成熟的硬滴答声阶段在封闭的胶囊由EVA泡沫。具体来说，我们的系统使用弹性EVA泡沫胶囊粘在剃光的小鼠回来与快速干燥（3分钟），非刺激性乳胶胶。该技术允许胶囊牢固和持久的附着在实验小鼠，以及有效的滴答声侵扰/收集在整个实验过程中。扁平胶囊由柔性材料制成，不妨碍小鼠用于血液采集或其他目的的操作。该系统主要适用于仙女虱子阶段，但稍作修改，也可用于喂养幼虫。该方法可以由一名有经验的人完成，不需要广泛的培训。
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Protocol
请注意，只有在实验室满足所有福利和安全措施时，才能适用本协议。该协议获得动物实验伦理委员会允许使用小鼠进行滴答声喂养，许可证编号E 94 046 08。对于终点，动物在两个阶段（每阶段 4 分钟和 5 分钟）中暴露在 CO2 中 9 分钟。
1. 胶囊的准备
- 将 2 mm 厚 EVA 泡沫和粘合剂双粘性泡沫粘在一起（图 1A）。
- 使用直径为 20 mm 的皮革孔冲孔，从粘着的泡沫件上切出一个圆圈。然后，使用直径为12毫米的孔冲，切割内部，形成双泡沫圈（图1B）。
注：胶囊的框架厚度应大于3毫米大小，以确保足够的表面粘合过程到主机皮肤（见下文）。 - 从粘合剂双粘性泡沫中剥下保护纸条（图1C），并连接直径为20毫米的透明圆形塑料（图1D）。
注：如果给幼虫喂食，请勿从粘合剂泡沫中取下保护纸条，直接移动到协议中的步骤 2。将双泡沫环（包括保护纸条）粘在鼠标上。 - 在透明塑料中开一个 ± 1 厘米的狭缝（图 1E）。
- 使用昆虫针（图1F）创建至少10个小孔，以在实验过程中允许水分蒸发过多。
注：胶囊（图1G）的总高度为4毫米（2毫米EVA泡沫加上2毫米胶粘剂泡沫），可用于喂养所有硬滴答剂物种的仙女和幼虫。20mm外径的胶囊尺寸（图1H）适用于大多数小鼠菌株，但如有必要，可以修改。
2. 在虱子侵扰前准备小鼠
注：在这项研究中，10-12周大的雌性实验鼠（应变C57BL/6和BALB/cByJ）被维持在标准笼 中，在法国 迈森斯-阿尔福特的法国食品、环境和职业健康与安全局（ANSES）认可的动物设施中，有食物和水提供饮用水（绿线通风架，在-20 Pa）。动物每天由经验丰富的技术人员监测两次，以发现任何异常的皮肤反应、健康问题或并发症。
- 在感应室中用异氟兰麻醉小鼠。麻醉后，将鼠标放在操作垫上，并附着在鼻锥上，以进行连续等值流供应（图2A）。监测呼吸速率并降低异氟兰水平，以确保其每分钟呼吸少于80次。
注：在操作之前，如有必要，通过纹身或射频识别芯片为单个鼠标添加标签。建议将单个小鼠关在单独的笼子里，以避免咬人造成胶囊损伤。 - 剃掉鼠标前部，从肩部刀片后面到耳朵后面的区域（图2A）。
注：剃光区域应大于胶囊表面。 - 将非刺激性乳胶涂抹到准备胶囊的整个 EVA 泡沫站点上，等待 1 分钟（图 2B）。
- 用手指将胶囊粘附在小鼠背上，用3分钟的恒定压力（图2C），特别是在胶囊的左右两侧。稍微抬起胶囊，目视检查其附着在皮肤上。如果发现未连接的区域，使用铲子涂抹更多胶水，然后再按 3 分钟。
3. 滴答声侵扰
- 对于仙女的侵扰，通过步骤1.4（图2D）中的切口将单个仙女引入胶囊。
注： 对于 Ixodes 滴答声物种，建议每粒胶囊最多 20 个仙女。 - 从两侧稍微挤压胶囊，让透明塑料弯曲，以便使用精细解剖钳更容易引入单个仙女（图2D）。通过胶囊内的切口推动单个仙女。进入后，将钳子在 90° 中转动，并拉出钳子，将滴答声沉积在胶囊内。
- 对于幼虫的侵扰，从附的胶囊中取出纸条（图2E）。将含有幼虫的注射器（图2F）直接放在胶囊内，通过推注射器柱塞沉积滴答声。轻轻地将柱塞转向皮肤，以去除附着的其余幼虫。
注：在实验前将幼虫放入 1 mL 注射器中，切端用棉片插入。 - 一旦幼虫沉积在皮肤上，通过附加透明塑料关闭胶囊（图2G）。
- 在胶囊周围涂抹保护塑料带（图2H）。
注：保护性塑料带大大提高了胶囊在整个实验期间的耐久性（图2I，J）。可以将两个胶囊连接到一个单独的鼠标（图2K）。在这种情况下，胶囊之间至少需要 3 mm 的空间，并且应适当增加剃光区域。 - 把老鼠还到笼子里。
4. 滴答声的收集
- 对鼠标进行麻醉，如上步骤 2.1 所示。
- 用手术刀将十字形切口 （图3A）切到塑料上.
注：此十字形切口可方便地收集内长滴答声或进料滴答声（如有必要）。 - 如果需要，将粘合塑料贴片粘在透明塑料上（直径为 20 mm，图 3B）， 将胶囊重新合合。
注意：如果需要在多个时间点收集刻度，可以使用相同的粘性塑料贴片。如果协议要求，也可以安乐死鼠标，取出胶囊，并收集/分离滴答声（图3C）。
5. 小鼠的恢复
- 将老鼠关在笼子里多一个星期。
- 让胶囊自然分离。
注：在这种情况下，胶囊脱落大约需要8-9天。取出胶囊后，检查小鼠皮肤上的异常反应非常重要。在刺激的情况下，应用润肤化妆水，虽然通常不需要治疗。如果伦理协议允许，恢复的小鼠（图3D）可以重复使用为另一个滴答声侵扰或不同的实验。
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Representative Results
我们提出了详细的分步方法，在用于小鼠背部的EVA泡沫胶囊中喂养不成熟的硬滴答声阶段（图2）。当需要精确的滴答声监测和收集时，这种非费力的协议适用于各种类型的实验。这种方法的主要优点是简单、易于获得、性价比高的材料和短工期。此外，我们成功地将两个胶囊附在一只小鼠个体上（图2K），使我们能够在同一动物身上喂养两组不同的虱子。使用高效、快速干燥和非刺激性乳胶胶水可确保胶囊在 3 分钟内牢固地连接。此外，胶囊保持附加至少一个星期（图2J），这是足够的时间，以包围大多数不成熟的硬滴答物种21，22，23，24。21,22,23,24由于胶囊弹性，进一步操纵小鼠的血液收集或其他目的是非常方便的。这个过程还允许老鼠在实验后完全恢复（图3D），让它们有机会重新利用动物并避免安乐死。我们的系统已经成功地用于喂养克索德斯里西努斯仙女（图4）。C57BL/6和BALB/cByJ小鼠菌株分别实现了中至高的感染成功率。在这两种情况下，所有仙女在4~5天内完成喂养，而大多数（+75%）第四天下车。
图1：EVA泡沫胶囊制备。（A） EVA泡沫（黑色）和粘合剂双粘性泡沫（白色）的附件。（B） 使用皮革孔冲头切割直径为 20 mm 的外侧和 12 mm 的内圈。（C） 从粘合剂双粘性泡沫中去除纸张保护胶带。（D） 将透明塑料附着在胶囊上。（E） 用手术刀切割透明塑料的缝隙。（F） 在塑料中使用昆虫针创建孔.（G-H）胶囊的不同部分和尺寸的示意图绘制。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：将胶囊粘到小鼠身上，并虱子侵扰。（A ） 剃须鼠标的后部前部. （B） 将乳胶粘在胶囊的 EVA 泡沫侧。（C） 将胶囊附着在鼠标上。（D） 将仙女放入胶囊中，通过透明塑料的切口。（E） 在幼虫出没前将防纸胶带从胶粘剂双粘性泡沫中剥下来.（F） 使用切割注射器在胶囊内注射幼虫。（G） 用透明塑料关闭胶囊.（H） 在胶囊周围放置一个保护性塑料带。（I） 鼠标与附加胶囊 -第1天 .（J） 鼠标与附加胶囊 -第7 天。（K） 鼠标附着两个胶囊。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 3：滴答声收集和鼠标恢复。（A） 切割横形开口以收集刻度。（B） 用胶粘剂塑料片重新密封胶囊.（C） 从安乐死小鼠中去除胶囊。箭头显示附加的刻度。（D） 从胶囊中下来后恢复的鼠标。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：对小鼠进行治疗成功 和 喂养持续时间。（A） C57BL/6 和BALB/cByJ小鼠中被感染的仙女的总百分比。（B） C57BL/6 和 BALB/cByJ 小鼠的仙女感染持续时间。15只C57BL/6和5只个别BALB/cByJ小鼠的（n）数字分别是130和25。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
协议中最关键的一步是将胶囊牢固地粘合到小鼠皮肤上。因此，乳胶应均匀地应用于胶囊的整个EVA泡沫表面，并施加3分钟的恒定压力，特别是胶囊的左右两侧。我们还建议将胶囊尽可能向前放置，以避免鼠标使用其后爪将其移除。在我们的实验中，只有EVA泡沫和乳胶粘附在小鼠皮肤上得到了验证，我们无法保证使用不同的材料取得相同的结果。
在我们的实验中，没有观察到胶囊在头七天内从皮肤上分离。我们强烈建议使用塑料带保护胶囊的外表面（图2H）。如果在滴答声喂食过程中保护带损坏，可以更换为新的保护带。胶囊的直径可以修改不同的小鼠应变大小。我们建议每天至少监测两次喂食滴答声，并在分离后立即收集被喂食的滴答声，以避免它们干燥。
受感染的虱子数量受胶囊直径以及宿主大小限制。在我们的实验中，我们用了最多20个仙女或100个幼虫的伊里西努斯为一只老鼠。对于较大的大小滴答声，如安布利奥玛或海洛玛 sp.等，应减少感染滴答的数量，以避免损害宿主从失血19，26，27。19,26,27因此，这种技术不适合维持滴答声养殖菌落，其中需要大量的滴答声来喂养。为此，建议使用兔子或绵羊等较大的宿主20、27，,27以减少整体动物需求。
我们的技术适用于需要小鼠模型的各种类型的实验，并且有必要将滴答声留在封闭区域，以便于收集和/或监测其生物参数。,与其他技术,10、11、12、13、14、15、16、17、18相比，这种简单的协议大大缩短了每只小鼠的整体麻醉时间（约5分钟），快速干燥、非刺激性胶水不会对动物造成伤害。10,11,1213,1415,16,17,18高度粘胶的EVA泡沫胶囊保护滴答声喂养区，并尽量减少丢失，损坏，或吃滴答的风险报告在自由侵扰系统10，11，12，13，15。10,11,12,13,15建议的技术最大的优点是平形胶囊和其坚定的持久附着在皮肤上，允许容易操作与鼠标，如果需要的话。特别注意使用弹性和非刺激性材料，以减少实验动物的不适，允许实验后完全恢复小鼠宿主（图3D）。
在研究滴答声-宿主-病原体相互作用、宿主免疫系统的滴答声操作、评估不同的滴答声控制措施或滴答声生物学时，该方法有望用于各种实验。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢阿兰·伯尼尔·法国国家农业研究所（INRAE）和奥恰安·勒·比德尔（ANSES）的技术援助。这项研究得到了D DIM一健康- 法国Régionéle-de-France（该项目的缩略语：神经帕提克）的支持。这些老鼠是 ANSES 购买的。杰弗里·布莱尔博士因为审阅了手稿的早期版本而得到认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
| PVC Binding Covers Transparent | Amazon | B078BNLSNP | Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable |
| Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape | Amazon | B07RHDZ35J | Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam |
| Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) | Amazon | B01DAA6X66 |
References
- Sonenshine, D. E., Roe, M. Biology of Ticks. , Oxford University Press. (2014).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Bonnet, S., et al. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
- Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
- Kohls, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain wood tick, Dermacentor andersoni. Culture methods for invertebrate animals. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publishing Co. Ithaca, N.Y. 246-256 (1937).
- Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum. Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
- Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic.) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbit. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
- Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. Maramorsch, K., Mahmood, F. , Science Publishers Inc. Enfield NH. 57-82 (1999).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Almazán, C., et al. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine. 21 (13-14), 1492-1501 (2003).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi. (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 35, 177-179 (1998).
- Almazán, C., et al. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine. 23 (35), 4403-4416 (2005).
- Levin, M. L., Ross, D. E. Acquisition of different isolates of Anaplasma phagocytophilum by Ixodes scapularis from a model animal. Vector Borne Zoonotic Diseases. 4 (1), 53-59 (2004).
- Heinze, D. M., Wikel, S. K., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J. Transcriptional profiling of the murine cutaneous response during initial and subsequent infestations with Ixodes scapularis nymphs. Parasites & Vectors. 6 (5), 26 (2012).
- Nuss, A. B., Mathew, M. G., Gulia-Nuss, M. Rearing, Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice. Journal of Visualized Experiments. (123), e55286 (2017).
- Wada, T., et al. Selective ablation of basophils in mice reveals their nonredundant role in acquired immunity against ticks. Journal of Clinical Investigation. 120 (8), 2867-2875 (2010).
- Saito, T. B., Walker, D. H. A Tick Vector Transmission Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. The Journal of Infectious Diseases. 212 (6), 968-977 (2015).
- Boppana, V. D., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J., Adler, A. J., Wikel, S. K. Blood feeding by the Rocky Mountain spotted fever vector, Dermacentor andersoni, induces interleukin-4 expression by cognate antigen responding CD4+ T cells. Parasites & Vectors. 2 (1), 47 (2009).
- Gargili, A., Thangamani, S., Bente, D. Influence of laboratory animal hosts on the life cycle of Hyalomma marginatum and implications for an in vivo transmission model for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Frontiers in Cell and Infection Microbiology. 20 (3), 39 (2013).
- Almazán, C., et al. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Zhijun, Y., et al. The life cycle and biological characteristics of Dermacentor silvarum Olenev (Acari: Ixodidae) under field conditions. Veterinary Parasitology. 168 (3-4), 323-328 (2010).
- Ahmed, B. M., Taha, K. M., El Hussein, A. M. Life cycle of Hyalomma anatolicum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae) fed on rabbits, sheep and goats. Veterinary Parasitology. 177 (3-4), 353-358 (2011).
- Široký, P., Erhart, J., Petrželková, K. J., Kamler, M. Life cycle of tortoise tick Hyalomma aegyptium under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 54, 277-284 (2011).
- Chen, X., et al. Life cycle of Haemaphysalis doenitzi (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions and its phylogeny based on mitochondrial 16S rDNA. Experimental and Applied Acarology. 56, 143-150 (2012).
- Jin, S. W., et al. Life Cycle of Dermacentor everestianus Hirst, 1926 (Acari: Ixodidae) under Laboratory Conditions. Korean Journal of Parasitology. 55 (2), 193-196 (2017).
- Labruna, M. B., Fugisaki, E. Y., Pinter, A., Duarte, J. M., Szabó, M. J. Life cycle and host specificity of Amblyomma triste (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 30 (4), 305-316 (2003).
- Breuner, N. E., et al. Failure of the Asian longhorned tick, Haemaphysalis longicornis, to serve as an experimental vector of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Ticks Tick Borne Diseases. 11 (1), 101311 (2020).
