Summary
Neste estudo, foi desenvolvido um sistema de alimentação para estágios ninfais e larvais de carrapato duro utilizando-se uma cápsula ligada ao rato de laboratório. A cápsula de alimentação é feita de materiais flexíveis e permanece firmemente presa ao mouse por pelo menos uma semana e permite um monitoramento confortável da alimentação do carrapato.
Abstract
Carrapatos são parasitas obrigatórios de alimentação sanguínea em todos os estágios de desenvolvimento (exceto ovos) e são reconhecidos como vetores de vários patógenos. O uso de modelos de camundongos na pesquisa de carrapatos é fundamental para entender suas interações biologia e carrapato-hogeno-patógeno. Aqui demonstramos uma técnica não laboriosa para a alimentação de estágios imaturos de carrapatos duros em ratos de laboratório. O benefício do método é sua simplicidade, curta duração e a capacidade de monitorar ou coletar carrapatos em diferentes pontos de tempo de um experimento. Além disso, a técnica permite o apego de duas cápsulas individuais no mesmo rato, o que é benéfico para uma variedade de experimentos onde dois grupos diferentes de carrapatos são necessários para se alimentar do mesmo animal. A cápsula não irritante e flexível é feita a partir de materiais de fácil acesso e minimiza o desconforto dos animais experimentais. Além disso, a eutanásia não é necessária, os camundongos se recuperam completamente após o experimento e estão disponíveis para reutilização.
Introduction
Carrapatos são vetores importantes de vários patógenos e representam um sério risco para a saúde animal e humana1. A criação de um sistema de alimentação eficaz é crucial ao estudar sua biologia, interações carrapato-hospedeiro-patógeno ou estabelecer medidas eficazes de controle. Atualmente, diversos sistemas de alimentação artificial, que evitam o uso de animais vivos, estão disponíveis para carrapatos2,,3,4 e estes devem ser utilizados sempre que as condições experimentais permitirem. No entanto, em várias configurações experimentais esses sistemas não conseguem imitar adequadamente as características fisiológicas específicas e o uso de animais vivos é necessário para alcançar resultados relevantes.
Camundongos de laboratório são comumente usados para o estudo de muitos sistemas biológicos e são rotineiramente utilizados como hospedeiros para alimentação carrapatos5,,6,7,,8,,9. Os dois métodos mais comuns de alimentação de carrapatos imaturos em camundongos incluem infestações gratuitas e o uso de câmaras de confinamento ligadas ao camundongo. Infestações gratuitas são usadas principalmente para estágios larvais e carrapatos engorgados podem cair para uma área onde podem ser recuperados. As câmaras de confinamento são geralmente compostas de tampas de acrílico ou polipropileno que são coladas nas costas do rato. A primeira técnica é um sistema natural eficaz para alimentação de carrapatos, mas não permite um monitoramento próximo durante o experimento porque os carrapatos individuais são dispersos em diferentes partes do corpo hospedeiro. Além disso, carrapatos engorgados que caem para uma área de recuperação podem se contaminar com fezes e urina10,11,12,13,14 que podem afetar severamente o condicionamento do carrapato ou podem ser danificados ou comidos pelo camundongo se não houver separação entre o animal e a área derecuperação 15. Os sistemas baseados em câmara permitem o confinamento de carrapatos em uma área definida, no entanto, o processo de colagem é trabalhoso e as tampas são muitas vezes fracamente aderentes à cola e, portanto, muitas vezes se desprendem durante o experimento16,17,,18,19. As tampas também são rígidas, desconfortáveis e levam a reações cutâneas, que impedem o reutilização dos camundongos e necessitam de sua eutanásia após o experimento.
Em nosso estudo anterior, desenvolvemos com sucesso um sistema eficaz usando câmaras feitas de espuma de acetato de vinil de etileno (EVA) para alimentar carrapatos em coelhos de laboratório20. Aqui, adaptamos este sistema a um modelo de mouse e propomos um método simples e limpo para alimentar estágios imaturos de carrapato duro em cápsulas fechadas feitas de espuma EVA. Especificamente, nosso sistema usa cápsulas elásticas de espuma EVA coladas nos camundongos raspados de volta com secagem rápida (3 min), cola de látex não irritante. Esta técnica permite uma fixação firme e duradoura de cápsulas ao camundongo experimental, bem como a efetiva infestação/coleta de carrapatos durante todo o curso do experimento. A cápsula plana é feita de materiais flexíveis e não impede a manipulação do camundongo para coleta de sangue ou outros fins. O sistema é adequado principalmente para os estágios do carrapato ninfa, mas com uma pequena modificação pode ser usado para alimentar larvas também. O método pode ser completado por uma única pessoa experiente e não é necessário treinamento extensivo.
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Protocol
Observe que este protocolo só pode ser aplicado quando todas as medidas de bem-estar e segurança forem atendidas em laboratório. Este protocolo recebeu permissão para usar camundongos para alimentação de carrapatos pelo Comitê de Ética para Experimentos AnimaisComEth Anses/ENVA/UPEC, Números de Permissão E 94 046 08. Para o ponto final, os animais foram expostos ao CO2 por 9 minutos em duas fases de 4 e 5 min cada.
1. Preparação da cápsula
- Coloque 2 mm de espessura eva-espuma e a espuma adesiva dupla pegajosa(Figura 1A).
- Usando um furo de couro de 20 mm de diâmetro, corte um círculo das peças de espuma grudadas. Em seguida, usando um furo de 12 mm de diâmetro, corte o interior para criar o círculo de espuma dupla(Figura 1B).
NOTA: A espessura da armação da cápsula deve ser superior a 3 mm de tamanho para garantir superfície suficiente para o processo de colagem à pele do hospedeiro (veja abaixo). - Retire a tira de papel protetor da espuma adesiva dupla pegajosa(Figura 1C)e conecte um plástico circular transparente de 20 mm de diâmetro(Figura 1D).
NOTA: Se alimentar as larvas, não remova a tira de papel protetor da espuma adesiva e mova-se diretamente para a etapa 2 no protocolo. Cole o anel de espuma dupla, incluindo a tira de papel protetor ao mouse. - Faça uma fenda de ~ 1 cm no plástico transparente(Figura 1E).
- Crie pelo menos 10 pequenos orifícios com um pino entomológico(Figura 1F) para permitir a evaporação excessiva da umidade durante o experimento.
NOTA: A cápsula (Figura 1G) tem uma altura total de 4 mm (2 mm de espuma EVA juntamente com espuma adesiva de 2 mm) e pode ser usada para alimentar ninfas e larvas de todas as espécies de carrapato duro. O tamanho da cápsula (Figura 1H) de 20 mm de diâmetro externo é adequado para a maioria das cepas do rato, mas pode ser modificado se necessário.
2. Preparação dos camundongos antes da infestação do carrapato
NOTA: Neste estudo, os camundongos experimentais femininos de 10 a 12 semanas (cepa C57BL/6 e BALB/cByJ) foram mantidos em gaiolas padrão com alimentos e água oferecidos ad libitum (racks ventilados da linha verde a -20 Pa) na Agência Francesa de Alimentos, Meio Ambiente e Segurança Ocupacional (ANSES) credenciadas em instalações animais em Maisons-Alfort, França. Os animais foram monitorados duas vezes por dia por técnicos experientes para quaisquer reações anormais da pele, problemas de saúde ou complicações.
- Anesthetize rato com isoflurane na câmara de indução. Uma vez anestesiado, coloque o mouse na almofada de manipulação e conecte-se a um cone de nariz para a alimentação contínua de isoflurane(Figura 2A). Monitore a taxa de respiração e reduza o nível de isoflurane para garantir que seja menos de 80 respirações por minuto.
NOTA: Antes da manipulação, rotule o mouse individual por tatuagem ou chip de identificação de radiofrequência, se necessário. Recomenda-se manter os camundongos individuais em gaiolas separadas para evitar danos à cápsula mordendo. - Raspe a parte anterior do mouse por trás das omoplatas até a área logo atrás das orelhas(Figura 2A).
NOTA: A área raspada deve ser maior que a superfície da cápsula. - Aplique cola de látex não irritante em todo o local de espuma EVA da cápsula preparada e espere por 1 min (Figura 2B).
- Cole a cápsula ao mouse de volta por uma leve pressão constante de 3 minutos com os dedos(Figura 2C), especialmenteno lado esquerdo e direito da cápsula. Levante ligeiramente a cápsula para verificar visualmente seu apego à pele. Se forem encontradas regiões não anexadas, aplique mais cola usando uma espátula e pressione por mais 3 minutos.
3. Infestação de carrapatos
- Para infestação de ninfas, introduza as ninfas individuais na cápsula através do corte feito na etapa 1.4 (Figura 2D).
NOTA: Para as espécies de carrapatos Ixodes recomenda-se no máximo 20 ninfas por uma cápsula. - Esprema ligeiramente a cápsula de dois lados para permitir que o plástico transparente dobre para facilitar a introdução de ninfas individuais usando fórceps de dissecção fina(Figura 2D). Empurre as ninfas individuais através do corte dentro da cápsula. Uma vez dentro, gire os fórceps em 90° e puxe os fórceps para depositar carrapatos dentro da cápsula.
- Para infestação de larvas remova o papel da cápsula anexada(Figura 2E). Coloque a seringa, contendo larvas(Figura 2F), diretamentedentro da cápsula e deposite carrapatos empurrando o êmbolo da seringa. Gire suavemente o êmbolo em direção à pele para remover as larvas restantes presas.
NOTA: Coloque larvas em uma seringa de 1 mL com extremidade cortada conectada por pedaço de algodão antes do experimento. - Uma vez que as larvas sejam depositadas na pele, feche a cápsula anexando o plástico transparente(Figura 2G).
- Aplique a faixa de plástico protetora ao redor da cápsula(Figura 2H).
NOTA: A faixa plástica protetora melhorou muito a durabilidade da cápsula durante toda a duração do experimento (Figura 2I,J). É possível anexar duas cápsulas a um rato individual(Figura 2K). Neste caso, é necessário um espaço mínimo de 3 mm entre as cápsulas e a área raspada deve ser aumentada adequadamente. - Devolva os ratos para a jaula.
4. Coleção de Carrapatos
- Anestesiar o mouse como na etapa 2.1 acima.
- Faça um corte em forma de cruz(Figura 3A) para o plástico com um bisturi.
NOTA: Este corte em forma de cruz permite a fácil coleta de carrapatos engorgados ou desprendimento dos carrapatos de alimentação, se necessário. - Se necessário, recue a cápsula colocando um adesivo plástico no plástico transparente (20 mm de diâmetro, Figura 3B).
NOTA: Se a coleta de carrapatos em vários pontos de tempo for desejada, o mesmo patch de plástico pegajoso pode ser usado. Se o protocolo exigir, pode-se também eutanásiar o mouse, remover a cápsula e coletar/separar os carrapatos(Figura 3C).
5. Recuperação dos camundongos
- Mantenha os ratos na jaula por mais uma semana.
- Deixe a cápsula se soltar naturalmente.
NOTA: Neste caso, leva cerca de 8-9 dias para as cápsulas caírem. Quando a cápsula é removida, é importante verificar se há reações anormais na pele dos camundongos. Em caso de irritação aplique uma loção emoliente, embora normalmente não seja necessário tratamento. Se o protocolo ético permitir, os camundongos recuperados(Figura 3D) podem ser reutilizados para outra infestação de carrapatos ou experimentos diferentes.
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Representative Results
Propomos o método passo a passo detalhado para alimentar estágios imaturos de carrapato duro em cápsulas de espuma EVA aplicadas nas costas de um rato(Figura 2). Este protocolo não trabalhoso é adequado para vários tipos de experimentos quando é necessário um monitoramento e coleta precisa de carrapatos. As principais vantagens deste método são sua simplicidade, materiais econômicos de fácil acesso e curta duração. Além disso, conseguimos anexar duas cápsulas a um indivíduo de camundongos (Figura 2K) permitindo-nos alimentar dois grupos diferentes de carrapatos no mesmo animal. O uso da cola de látex altamente eficaz, de secagem rápida e não irritante garante que a cápsula esteja firmemente presa dentro de 3 minutos. Além disso, a cápsula permaneceu anexada por pelo menos uma semana (Figura 2J), o que foi tempo suficiente para a engorgement da maioria das espécies imaturas de carrapato duro21,22,,23,24. Devido à elasticidade da cápsula, a manipulação adicional do rato para coleta de sangue ou outros propósitos foi muito conveniente. Este procedimento também permite a recuperação completa dos camundongos após os experimentos(Figura 3D) dando a oportunidade de reutilizar os animais e evitar a eutanásia. Nosso sistema tem sido usado com sucesso para alimentar ninfas ixodes ricinus (Figura 4). Uma taxa de sucesso moderada a alta de engorgement foi alcançada nas cepas de mouse C57BL/6 e BALB/cByJ, respectivamente. Em ambos os casos, todas as ninfas terminaram a alimentação dentro de 4 – 5 dias, enquanto a maioria (~75%) caiu no quarto dia.
Figura 1: Preparação da cápsula de espuma EVA. (A) Fixação de eva-espuma (preto) e espuma adesiva dupla pegajosa (branca). (B) Corte de 20 mm de diâmetro externo e círculo interno de 12 mm usando perfurações de furo de couro. (C) Remoção da fita de proteção de papel da espuma adesiva dupla pegajosa. (D) Fixação do plástico transparente à cápsula. (E) Corte a fenda no plástico transparente com um bisturi. (F) Criação de orifícios utilizando um pino entomológico no plástico. (G-H) Desenho esquemático das diferentes partes da cápsula e dimensões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Colando a cápsula aos camundongos e infestação de carrapatos. (A) Barbear a parte anterior do rato. (B) Aplicação da cola de látex no lado da espuma EVA da cápsula. (C) Fixação da cápsula ao mouse. (D) Colocar a ninfa na cápsula através do corte no plástico transparente. (E) Descascando a fita de proteção de papel da espuma adesiva dupla pegajosa antes da infestação das larvas. (F) Injeções de larvas dentro da cápsula usando uma seringa cortada. (G) Fechando a cápsula com o plástico transparente. (H) Colocar uma faixa de plástico protetora ao redor da cápsula. (I) Mouse com a cápsula anexada - 1dia. (J) Mouse com a cápsula anexada - 7º dia.th (K) Mouse com duas cápsulas anexadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Coleta de carrapatos e recuperação do mouse. (A) Corte de abertura em forma cruzada para a coleta de carrapatos. (B) Resealing a cápsula com patch de plástico adesivo. (C) Remoção da cápsula de um rato eutanizado. As setas mostram os carrapatos anexados. (D) Rato recuperado após cair da cápsula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Sucesso de engorgement e duração da alimentação de ninfas ricinus de Ixodes alimentando-se de camundongos. (A) Porcentagem total de ninfas engorgadas em camundongos C57BL/6 e BALB/cByJ. (B) Duração da ninfa engorgement em camundongos C57BL/6 e BALB/cByJ. Os (n) números para ninfas infestadas são 130 e 25 para 15 camundongos individuais C57BL/6 e 5 individuais BALB/cByJ, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O passo mais crítico no protocolo é a colagem firme da cápsula na pele do rato. Portanto, a cola de látex deve ser aplicada de forma homogênea em toda a superfície de espuma EVA da cápsula e deve ser aplicada pressão constante por 3 minutos, especialmente no lado esquerdo e direito da cápsula. Também recomendamos a colocação da cápsula o mais longe possível na parte traseira para evitar sua remoção pelo mouse usando suas patas traseiras. Em nossos experimentos, apenas a adesão da cola eva-espuma e látex à pele do rato foi validada e não podemos garantir a obtenção dos mesmos resultados usando materiais diferentes.
Durante nossos experimentos, não foi observado o descolamento da cápsula da pele nos primeiros sete dias. Recomendamos fortemente proteger a superfície externa da cápsula usando a faixa plástica(Figura 2H). Se a faixa protetora for danificada ao longo da alimentação do carrapato, ela pode ser substituída por uma nova. O diâmetro da cápsula pode ser modificado para diferentes tamanhos de cepa do rato. Sugerimos monitorar os carrapatos de alimentação pelo menos duas vezes por dia e coletar carrapatos engorgados imediatamente após o desapego para evitar sua proficação.
O número de carrapatos infestados é limitado pelo diâmetro da cápsula, bem como pelo tamanho do hospedeiro. Em nossos experimentos usamos no máximo 20 ninfas ou 100 larvas de I. ricinus para um rato. Para os carrapatos de tamanho maior tais Amblyomma ou Hyalomma sp., etc o número de carrapatos infestados deve ser reduzido para evitar danos ao hospedeiro de perda de sangue19,,26,27. Portanto, essa técnica não é adequada para a manutenção de colônias de criação de carrapatos, onde um grande número de carrapatos são necessários para se alimentar. Para isso, são recomendados hospedeiros maiores como coelhos ou ovelhas20,27 para reduzir a exigência geral de animais.
Nossa técnica é adequada para vários tipos de experimentos onde um modelo de camundongo é necessário, e é necessário manter carrapatos em área fechada para fácil coleta e/ou monitoramento de seus parâmetros biológicos. Em comparação com outras técnicas10,11,12,13,14,15,16,17,18, este protocolo simples reduz muito o tempo geral de anestesia (aproximadamente 5 minutos) por rato e a rápida secagem, cola de látex não irritante não causa danos ao animal. A cápsula de espuma EVA altamente adesiva protege a área de alimentação do carrapato e minimiza o risco de carrapatos perdidos, danificados ou comidos, conforme relatado nos sistemas de infestação gratuitos10,11,,12,13,,15. A grande vantagem da técnica proposta é a cápsula de forma plana e seu firme acessório de longa duração à pele permitindo fácil manipulação com o mouse, se necessário. Atenção especial tem sido dada sobre o uso de materiais elásticos e não irritantes para reduzir o desconforto aos animais experimentais permitindo a recuperação completa do hospedeiro do camundongo após o experimento(Figura 3D).
Espera-se que o método seja usado para uma variedade de experimentos ao estudar interações carrapato-hospedeiro-patógeno, manipulação de carrapatos dos sistemas imunológicos hospedeiros, avaliação de diferentes medidas de controle de carrapatos ou biologia do carrapato.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos a assistência técnica do Instituto Nacional de Pesquisas Agrícolas Da França Alain Bernier (INRAE) e da Océane Le Bidel (ANSES). O estudo foi apoiado pelo DIM One Health - Région Île-de-France (Acrônimo do projeto: NeuroPaTick). Os ratos foram comprados pela ANSES. Dr. Jeffrey L. Blair é reconhecido por revisar a versão anterior do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
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| Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) | Amazon | B01DAA6X66 |
References
- Sonenshine, D. E., Roe, M. Biology of Ticks. , Oxford University Press. (2014).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Bonnet, S., et al. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
- Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
- Kohls, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain wood tick, Dermacentor andersoni. Culture methods for invertebrate animals. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publishing Co. Ithaca, N.Y. 246-256 (1937).
- Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum. Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
- Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic.) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbit. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
- Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. Maramorsch, K., Mahmood, F. , Science Publishers Inc. Enfield NH. 57-82 (1999).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Almazán, C., et al. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine. 21 (13-14), 1492-1501 (2003).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi. (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 35, 177-179 (1998).
- Almazán, C., et al. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine. 23 (35), 4403-4416 (2005).
- Levin, M. L., Ross, D. E. Acquisition of different isolates of Anaplasma phagocytophilum by Ixodes scapularis from a model animal. Vector Borne Zoonotic Diseases. 4 (1), 53-59 (2004).
- Heinze, D. M., Wikel, S. K., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J. Transcriptional profiling of the murine cutaneous response during initial and subsequent infestations with Ixodes scapularis nymphs. Parasites & Vectors. 6 (5), 26 (2012).
- Nuss, A. B., Mathew, M. G., Gulia-Nuss, M. Rearing, Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice. Journal of Visualized Experiments. (123), e55286 (2017).
- Wada, T., et al. Selective ablation of basophils in mice reveals their nonredundant role in acquired immunity against ticks. Journal of Clinical Investigation. 120 (8), 2867-2875 (2010).
- Saito, T. B., Walker, D. H. A Tick Vector Transmission Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. The Journal of Infectious Diseases. 212 (6), 968-977 (2015).
- Boppana, V. D., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J., Adler, A. J., Wikel, S. K. Blood feeding by the Rocky Mountain spotted fever vector, Dermacentor andersoni, induces interleukin-4 expression by cognate antigen responding CD4+ T cells. Parasites & Vectors. 2 (1), 47 (2009).
- Gargili, A., Thangamani, S., Bente, D. Influence of laboratory animal hosts on the life cycle of Hyalomma marginatum and implications for an in vivo transmission model for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Frontiers in Cell and Infection Microbiology. 20 (3), 39 (2013).
- Almazán, C., et al. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994 (2018).
- Zhijun, Y., et al. The life cycle and biological characteristics of Dermacentor silvarum Olenev (Acari: Ixodidae) under field conditions. Veterinary Parasitology. 168 (3-4), 323-328 (2010).
- Ahmed, B. M., Taha, K. M., El Hussein, A. M. Life cycle of Hyalomma anatolicum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae) fed on rabbits, sheep and goats. Veterinary Parasitology. 177 (3-4), 353-358 (2011).
- Široký, P., Erhart, J., Petrželková, K. J., Kamler, M. Life cycle of tortoise tick Hyalomma aegyptium under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 54, 277-284 (2011).
- Chen, X., et al. Life cycle of Haemaphysalis doenitzi (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions and its phylogeny based on mitochondrial 16S rDNA. Experimental and Applied Acarology. 56, 143-150 (2012).
- Jin, S. W., et al. Life Cycle of Dermacentor everestianus Hirst, 1926 (Acari: Ixodidae) under Laboratory Conditions. Korean Journal of Parasitology. 55 (2), 193-196 (2017).
- Labruna, M. B., Fugisaki, E. Y., Pinter, A., Duarte, J. M., Szabó, M. J. Life cycle and host specificity of Amblyomma triste (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 30 (4), 305-316 (2003).
- Breuner, N. E., et al. Failure of the Asian longhorned tick, Haemaphysalis longicornis, to serve as an experimental vector of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Ticks Tick Borne Diseases. 11 (1), 101311 (2020).
