Summary
本研究では、実験用マウスに付着したカプセルを用いて、硬ダニのニンファルおよび幼虫段階の給餌システムを開発した。供給カプセルは、柔軟な材料から作られ、少なくとも1週間はしっかりとマウスに取り付けられたままで、ダニの供給の快適なモニタリングを可能にします。
Abstract
ダニは、発達のすべての段階(卵を除く)で必須の血液供給寄生虫であり、様々な病原体のベクターとして認識されています。ダニ研究におけるマウスモデルの使用は、生物学とダニ宿主と病原体の相互作用を理解するために重要です。ここでは、実験室用マウスの硬いダニの未熟な段階の供給のための非骨作業の技術を実証する。この方法の利点は、そのシンプルさ、短い期間、および実験のさまざまな時点でのティックを監視または収集する機能です。さらに、この技術は、同じマウス上の2つの個々のカプセルの取り付けが可能であり、同じ動物を餌に2つの異なるグループのダニが必要な様々な実験に有益である。非刺激性および柔軟なカプセルは容易にアクセス可能な材料からなされ、実験動物の不快感を最小にする。さらに、安楽死は必要なく、マウスは実験後に完全に回復し、再利用が可能である。
Introduction
ダニは、いくつかの病原体の重要なベクターであり、動物および人間の健康に深刻なリスクを表す1.効果的な給餌システムの設定は、生物学、ダニ-宿主と病原体の相互作用を研究する際、または効果的な制御手段を確立する際に重要です。現在、生きている動物の使用を避けるいくつかの人工的な給餌システムは、ティック22、3、43のために利用可能であり、4これらは実験的条件が許すたびに利用されるべきである。しかし、様々な実験環境では、これらのシステムは特定の生理学的特徴を適切に模倣できず、関連する結果を達成するために生きている動物の使用が必要である。
実験室用マウスは、多くの生物学的システムの研究に一般的に使用され、ダニ,,95、6、7、8、96,7を供給するための宿主として日常的に利用されている。58マウスに未熟なダニを供給する2つの最も一般的な方法には、遊離感染とマウスに取り付けられた閉じ込めチャンバーの使用が含まれる。無料の出没は主に幼虫段階に使用され、魅惑的なダニは回復できる領域に落ちることができます。監禁室は、通常、マウスの背中に接着されたアクリルまたはポリプロピレンキャップで構成されています。最初の技術は、ダニの供給のための効果的な自然システムですが、個々のダニがホスト体の異なる部分に分散しているため、実験中に綿密な監視を行うことは許可されません。さらに、回復領域に落ちるエンゴージドダニは、ダニの適性に深刻な影響を与える可能性のある便および尿10、11、12、13、14で汚染され、動物と回復領域10,11,12,13,1415との間に分離がない場合にはマウスによって損傷または食べられる可能性がある。チャンバーベースのシステムは、定義された領域へのティックの閉じ込めを可能にしますが、接着プロセスは面倒であり、キャップはしばしば接着剤に弱く付着し、実験16、17、18、19,17,18,19の間にしばしば取り外されます。キャップはまた、硬く、不快であり、皮膚反応を引き起こし、マウスの再利用を防ぎ、実験後に安楽死を必要とする。
我々の前の研究では、実験室のウサギ20にダニを供給するためのエチレンビニル酢酸(EVA)フォームで作られたチャンバーを使用して効果的なシステムを開発することに成功しました。本明細書では、このシステムをマウスモデルに適合させ、EVA-foamから作られた閉じたカプセルに未熟なハードティック段階を供給する簡単でクリーンな方法を提案する。具体的には、当社のシステムは、急速な乾燥(3分)、非刺激ラテックス接着剤で剃ったマウスに接着弾性EVAフォームカプセルを使用しています。この技術は実験マウスへのカプセルの堅固で長持ちする付着、ならびに実験の全過程の間に有効なダニの侵入/収集を可能にする。平らなカプセルは、柔軟な材料から作られており、採血やその他の目的のためにマウスの操作を妨げません。このシステムは主にニンフモルチック段階に適していますが、わずかな変更で幼虫の餌付けにも使用できます。この方法は、1人の経験豊富な人が完了することができ、広範なトレーニングは必要ありません。
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Protocol
この議定書は、すべての福祉および安全対策が実験室で満たされている場合にのみ適用できることに注意してください。このプロトコルは、動物実験のための倫理委員会ComEth Anses/ENVA/UPEC、許可番号E 94 046 08によってダニの餌付けのためにマウスを使用する許可を受けました。エンドポイントについては、動物をそれぞれ4分および5分の2つの段階で9分間CO2 にさらした。
1. カプセルの準備
- 2 mmの厚さのEVA-foamと接着二重粘着性の泡を一緒に貼り付ける(図1A)。
- 20mmの革の穴のパンチを使用して、貼り付けた泡片から円を切り取ります。次に、直径12mmの穴パンチを使用して、内部をカットして二重泡円を作成する(図1B)。
注:カプセルのフレームの厚さは、ホストスキンに接着プロセスに十分な表面を保証するために、サイズが3mm以上でなければなりません(下記参照)。 - 粘着状二重粘着性フォームから保護紙のストリップを剥離し(図1C)、直径20mmの透明な円形プラスチックを取り付けます(図1D)。
注:幼虫に餌を与える場合は、保護用の用紙を粘着フォームから取り外して、プロトコルのステップ2に直接移動してください。保護用の紙のストリップを含む二重泡リングをマウスに接着します。 - 透明プラスチックに~1cmのスリットを入します(図1E)。
- 実験中に過度の水分蒸発を可能にするために、少なくとも10個の小さな穴を、内膜ピン(図1F)で作成します。
注:カプセル(図1G)は4 mm(2 mmの粘着性の泡と一緒に2つのmm EVA-foam)の総高さを有し、すべての硬いダニ種のニンフおよび幼虫を供給するために使用することができる。カプセルサイズ(図1H)の20mm外径はマウスの株のほとんどに適していますが、必要に応じて変更することができます。
2. ダニの侵入前のマウスの調製
注:この研究では、10〜12週齢の雌の実験マウス(株C57BL/6およびBALB/cByJ)は、フランス食品産業安全庁(ANSES)で アドリビタム (-20 Paのグリーンライン換気ラック)を提供する食品と水を備えた標準的なケージに維持されました。動物は、異常な皮膚反応、健康上の問題または合併症について経験豊富な技術者によって1日2回監視された。
- 誘導室でイオブルランでマウスを麻酔します。麻酔が行われたら、マウスを操作パッドに置き、連続イオブルラン供給のためにノーズコーンに取り付けます(図2A)。呼吸数を監視し、イオブルランレベルを下げ、1分間に80回未満の呼吸を確実にします。
注:操作の前に、必要に応じて、入れ墨や無線周波数識別チップによって個々のマウスにラベルを付けます。噛み付きによるカプセルの損傷を避けるために、個々のマウスを別々のケージに入れておくことをお勧めします。 - 肩甲骨の後ろから、耳のすぐ後ろの領域までマウスの前部を剃ります(図2A)。
注: 剃った領域はカプセル表面より大きくなければなりません。 - 調製されたカプセルのEVA-foamサイト全体に非刺激性ラテックス接着剤を塗布し、1分間待ちます(図2B)。
- 指でわずか3分の一定圧(図2C)で、特にカプセルの左右にカプセルをマウスに接着します。カプセルを少し持ち上げて、皮膚への付着を視覚的に確認します。接続されていない領域が見つかった場合は、へらを使用してさらに接着剤を適用し、さらに3分間押します。
3. ダニの侵入
- ニンフの出没については、ステップ1.4で作られたカットを介してカプセルに個々のニンフを導入します(図2D)。
注 :Ixodes ダニ種の場合、1つのカプセルあたり最大20ニンフが推奨されます。 - カプセルを両側から少し絞って、透明なプラスチックを曲げて、細かい解剖鉗子を使用して個々のニンフを簡単に導入できるようにします(図2D)。カプセル内のカットを介して個々のニンフをプッシュします。中に入ったら、鉗子を90°に回し、鉗子を引き出してカプセル内にダニを堆積させる。
- 幼虫の侵入の場合は、付属のカプセルから紙のスリップを取り外します(図2E)。注射器を入れて、幼虫(図2F)を含む注射器をカプセルの中に直接入れ、シリンジプランジャーを押してダニを沈下します。スプランジャーを皮膚に向かってそっと回して、取り付けられた残りの幼虫を取り除きます。
注:実験の前に、綿で切断された端部を差し込んだ1mLの注射器に幼虫を入れてください。 - 幼虫を皮膚に付着したら、透明なプラスチックを取り付けてカプセルを閉じる(図2G)。
- カプセルの周りに保護プラスチックバンドを適用します (図2H)。
注:保護プラスチックバンドは、実験の全期間のカプセルの耐久性を大幅に改善しました(図2I,J)。1つの個々のマウスに2つのカプセルを取り付けることができます(図2K)。この場合、カプセル間の最小3mmのスペースが必要であり、剃った領域を適切に増加させるべきです。 - マウスをケージに戻します。
4. ティックのコレクション
- 上のステップ 2.1 のようにマウスを麻酔します。
- 十字形のカット(図3A)をメスでプラスチックに作ります。
注:この十字型のカットは、必要に応じて、魅惑的なダニや給餌ダニの剥離の簡単なコレクションを可能にします。 - 必要に応じて、透明プラスチックに粘着プラスチックパッチを貼り付けてカプセルを再閉します(直径20mm、図3B)。
注: 複数のポイントでのティックの収集が必要な場合は、同じ粘着性のプラスチック パッチを使用できます。プロトコルが必要な場合は、マウスを安楽死させ、カプセルを取り外し、ティックを収集/デタッチすることもできます(図3C)。
5. マウスの回収
- さらに1週間、マウスをケージに入れておきます。
- カプセルを自然に切り離しましょう。
注:この場合、カプセルが落ちるのに約8〜9日かかります。カプセルを取り除くとき、マウスの皮膚に異常な反応がないか確認することが重要です。刺激の場合にはエモリエントローションを塗るが、通常は治療は必要ない。倫理プロトコルが許せば、回復されたマウス(図3D)は別のダニの侵入または異なる実験のために再利用することができます。
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Representative Results
マウスの背中に塗布したEVA-foamカプセルに未熟なハードティックステージを供給するための詳細なステップバイステップ法を提案する(図2)。この面倒でないプロトコルは、正確なティック監視と収集が必要な場合に、さまざまなタイプの実験に適しています。この方法の主な利点は、そのシンプルさ、簡単にアクセスできる費用対効果の高い材料、および短い期間です。また、1匹のマウスに2つのカプセルを取り付け(図2K)を使用して、同じ動物に2つの異なるダニ群を供給することができました。非常に効果的で、速い乾燥、および非刺激性のラテックス接着剤の使用は、カプセルが3分以内にしっかりと取り付けられていることを保証します。また、カプセルは少なくとも1週間装着されたまま(図2J)は、未熟なハードティック種21、22、23、24,22,23のほとんどのエングレージに十分な時間であった。,24カプセル弾性のため、採血やその他の目的のためにマウスをさらに操作することは非常に便利であった。この手順はまた、実験後のマウスの完全な回復を可能にする(図3D)動物を再利用し、安楽死を避ける機会を与える。私たちのシステムは、イコデス・リシヌス・ニンフを供給するために正常に使用されています(図4)。C57BL/6およびBALB/cByJマウス株で、それぞれ中程度から高いエンゴゲルメント成功率が達成された。どちらの場合も、すべてのニンフは4〜5日以内に給餌を終えましたが、大部分は(〜75%)4日目に降板しました。
図1:EVA-フォームカプセル調製。(A)EVA-foam(黒)と粘着二重粘着性フォーム(白)の取り付け。(B)皮革の穴のパンチを使用して、直径20mmの外側と12mmの内側の円を切断します。(C)粘着二重粘着性フォームから紙保護テープを取り外す。(D)透明プラスチックをカプセルに取り付ける。(E) 透明なプラスチックのスリットをメスで切断する。(F)プラスチック内の内膜ピンを用いた穴の作成(G-H)カプセルと寸法の異なる部分の模式図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カプセルをマウスに接着し、ダニが出没する。(A)マウスの後ろ側の前部を剃る(B)カプセルのEVA-foam側へのラテックス接着剤の塗布。(C) カプセルをマウスに取り付ける。(D)透明プラスチックのカットを介してカプセルにニンフを入れる。(E)幼虫の侵入前に粘着二重粘着性の泡から紙保護テープを剥がす。(F)切り込み注射器を用いたカプセル内の幼虫の注射。(G)透明プラスチックでカプセルを閉じる。(H)カプセルの周りに保護プラスチックバンドを設置する。(I)取り付けられたカプセル付きマウス - 1日。(J)付属のカプセル付きマウス - 7日目。(K)2つのカプセルが付いているマウス。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ダニの収集とマウスの回復(A)ティックコレクションのための切断クロス形状の開口部。(B)接着剤プラスチックパッチでカプセルを再密封する。(C) 安楽死させたマウスからのカプセル除去。矢印は、アタッチされたティックを示します。(D) カプセルを落とした後にマウスを回収した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マウスに餌を与える イコデス・リシヌス・ ニンフのエンゴゲメントの成功と摂食期間。(A) C57BL/6およびBALB/cByJマウスにおけるニンフの総割合。(B) C57BL/6およびBALB/cByJマウスにおけるニンフエングルメントの持続期間。出没ニンフの(n)数は、それぞれ15個のC57BL/6マウスと5個の個別BALB/cByJマウスに対して130および25である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルの最も重要なステップは、マウスの皮膚にカプセルの固い接着です。したがって、ラテックス接着剤は、カプセルのEVA-フォーム表面全体に均一に適用されるべきであり、特にカプセルの左右に3分間一定の圧力を適用する必要があります。また、後足を使用してマウスによる除去を避けるために、できるだけ前方にカプセルを背面に配置することをお勧めします。我々の実験では、マウスの皮膚へのEVA-フォームおよびラテックス接着剤の接着のみが検証されており、異なる材料を使用して同じ結果の達成を保証することはできません。
実験の間、最初の7日以内に皮膚からカプセルの剥離は観察されなかった。プラスチックバンドを使用してカプセルの外面を保護することを強くお勧めします(図2H)。保護バンドがダニの供給の過程で損傷している場合、それは新しいものに置き換えることができます。カプセルの直径は、異なるマウスひずみサイズに応じて変更することができます。私たちは、少なくとも1日2回の給餌ダニを監視し、剥離直後に魅惑的なダニを収集して乾燥を避けることをお勧めします。
出没ダニの数は、カプセルの直径とホストサイズによって制限されます。我々の実験では、1つのマウスに最大20ニンフまたは100の幼虫I.リシヌスを使用しました。より大きなサイズのダニのためにそのようなアンブロンマまたはヒャロンマsp.、等の出没ダニの数は、失血19、26、2726,から宿主19への害を避けるために減少すべきである。27したがって、この技術は、大量のダニが供給する必要があるダニ飼育コロニーの維持には適していない。この目的のために、ウサギや羊のような大きなホストは、全体的な動物の要件を減らすために20、27をお勧めします。20,
我々の技術は、マウスモデルが必要とされる様々なタイプの実験に適しており、それらの生物学的パラメータの収集および/または監視を容易にするために、閉じた領域にダニを保持する必要があります。他の技術10、11、12、13、14、15、16、17、18と比較して、この単純なプロトコルは、マウス当たりの全体的な麻酔時間(約5分)を大幅に短縮し、速い乾燥、非刺激性ラテックス接着剤は動物に害を及ぼさない。10,11,12,13,14,15,16,17,18高接着EVA-フォームカプセルは、ダニの供給領域を保護し、無料の出,没システム10、11、12、13、15で10,11報告されるように、失われた、損傷12,13した、または食べられるダニのリスクを最小限に抑えます。提案された技術の大きな利点は、平らな形のカプセルと、必要に応じてマウスで簡単に操作できる皮膚への堅固な長持ちするアタッチメントです。実験後にマウスホストの完全な回復を可能にする実験動物への不快感を軽減するために、弾性および非刺激性材料の使用に特別な注意が払われている(図3D)。
この方法は、ダニと宿主の相互作用、宿主免疫系のダニ操作、異なるティック制御措置の評価、またはダニ生物学を研究する際に、様々な実験に使用することが期待される。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
我々は、アラン・ベルニエ・フランス農業研究所(INRAE)とオセアン・ル・ビデル(ANSES)の技術支援を認める。この研究は、DIM One Health - レギオン・イル・ド・フランス(プロジェクトの頭字語:NeuroPaTick)によってサポートされました。マウスはANSESによって購入した。ジェフリー・L・ブレア博士は、以前のバージョンの原稿を見直したことで認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
| PVC Binding Covers Transparent | Amazon | B078BNLSNP | Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable |
| Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape | Amazon | B07RHDZ35J | Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam |
| Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) | Amazon | B01DAA6X66 |
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