Summary
In questo studio, un sistema di alimentazione per le fasi ninfe e larval di zecca dura è stato sviluppato utilizzando una capsula attaccata al topo di laboratorio. La capsula di alimentazione è realizzata con materiali flessibili e rimane saldamente attaccata al mouse per almeno una settimana e consente un comodo monitoraggio dell'alimentazione delle zecche.
Abstract
Le zecche sono parassiti obbligatori dell'alimentazione del sangue in tutte le fasi dello sviluppo (tranne le uova) e sono riconosciute come vettori di vari agenti patogeni. L'uso di modelli murini nella ricerca sulle zecche è fondamentale per comprendere la loro biologia e le interazioni tra l'ospite-patogeno. Qui dimostriamo una tecnica non laboriosa per l'alimentazione di stadi immaturi di zecche dure su topi di laboratorio. Il vantaggio del metodo è la sua semplicità, breve durata, e la capacità di monitorare o raccogliere zecche in diversi punti di tempo di un esperimento. Inoltre, la tecnica consente l'attaccamento di due singole capsule sullo stesso topo, il che è utile per una varietà di esperimenti in cui sono necessari due diversi gruppi di zecche per nutrirsi dello stesso animale. La capsula non irritante e flessibile è realizzata con materiali facilmente accessibili e riduce al minimo il disagio degli animali sperimentali. Inoltre, l'eutanasia non è necessaria, i topi si riprendono completamente dopo l'esperimento e sono disponibili per il nuovo utilizzo.
Introduction
Le zecche sono importanti vettori di diversi agenti patogeni e rappresentano un grave rischio per la salute animale e umana1. La creazione di un sistema di alimentazione efficace è fondamentale quando si studiano la loro biologia, le interazioni tra zecche-ospite-patogeno o per stabilire misure di controllo efficaci. Attualmente, diversi sistemi di alimentazione artificiale, che evitano l'uso di animali vivi sono disponibili per le zecche2,3,4 e questi dovrebbero essere utilizzati ogni volta che le condizioni sperimentali lo consentono. Tuttavia, in vari scenari sperimentali questi sistemi non riescono a imitare adeguatamente le caratteristiche fisiologiche specifiche e l'uso di animali vivi è necessario per ottenere risultati pertinenti.
I topi di laboratorio sono comunemente utilizzati per lo studio di molti sistemi biologici e sono regolarmente utilizzati come ospiti perl'alimentazione delle zecche 5,6,7,8,9. I due metodi più comuni per alimentare le zecche immature sui topi includono infestazioni libere e l'uso di camere di confinamento attaccate al topo. Le infestazioni libere sono utilizzate principalmente per stadi larve e le zecche engorged possono cadere in un'area in cui possono essere recuperate. Le camere di confinamento sono di solito composte da tappi acrilici o polipropilene che sono incollati alla schiena del topo. La prima tecnica è un efficace sistema naturale per l'alimentazione delle zecche, ma non consente un attento monitoraggio durante l'esperimento perché le singole zecche sono disperse in diverse parti del corpo ospite. Inoltre, le zecche engorged che cadono in un'area di recupero possono essere contaminate da feci e urina10,11,12,13,14 che possono influenzare gravemente la forma fisica della zecca o possono essere danneggiate o mangiate dal topo se non vi è separazione tra l'animale e l'area di recupero15. I sistemi a camera permettono il confinamento delle zecche in un'area definita, tuttavia, il processo di incollaggio è laborioso e i tappi sono spesso debolmente aderenti alla colla e quindi spesso si staccano durantel'esperimento 16,17,18,19. I tappi sono anche rigidi, scomodi e portano a reazioni cutanee, che impediscono il nuovo uso dei topi e ne richiedono l'eutanasia dopo l'esperimento.
Nel nostro studio precedente, abbiamo sviluppato con successo un sistema efficace utilizzando camere fatte di schiuma di acetato di etilene-vinile (EVA) per l'alimentazione delle zecche sui conigli dalaboratorio 20. Qui abbiamo adattato questo sistema a un modello di topo e proporre un metodo semplice e pulito per alimentare fasi di zecche dure immature in capsule chiuse fatte di eva-foam. In particolare, il nostro sistema utilizza capsule elastiche EVA-foam incollate ai topi rasati con asciugatura veloce (3 min), colla in lattice non irritante. Questa tecnica consente l'attaccamento fermo e duraturo di capsule al topo sperimentale, così come l'efficace infestazione/raccolta di zecche durante l'intero corso dell'esperimento. La capsula piatta è realizzata con materiali flessibili e non impedisce la manipolazione del topo per la raccolta del sangue o altri scopi. Il sistema è adatto principalmente per le fasi di zecche ninfe, ma con una leggera modifica può essere utilizzato anche per l'alimentazione delle larve. Il metodo può essere completato da una sola persona esperta e non è necessaria una formazione completa.
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Protocol
Si prega di notare che questo protocollo può essere applicato solo quando tutte le misure di benessere e sicurezza sono soddisfatte in laboratorio. Questo protocollo ha ricevuto il permesso di utilizzare i topi per l'alimentazione con zecche dal Comitato Etico per gli esperimenti animaliComEth Anses/ENVA/UPEC, Permit Numbers E 94 046 08. Per l'endpoint, gli animali sono stati esposti a CO2 per 9 min in due fasi di 4 e 5 min ciascuna.
1. Preparazione della capsula
- Stick 2 mm di spessore EVA-foam e l'adesivo doppia schiuma appiccicosa insieme (Figura 1A).
- Utilizzando un foro in pelle di 20 mm di diametro, tagliare un cerchio dai pezzi di schiuma attaccati. Quindi, utilizzando un foro di 12 mm di diametro, tagliare l'interno per creare il doppio cerchio di schiuma (Figura 1B).
NOTA: lo spessore del telaio della capsula deve essere superiore a 3 mm per garantire una superficie sufficiente per il processo di incollaggio alla pelle ospite (vedi sotto). - Sbucciare la striscia di carta protettiva dalla doppia schiuma appiccicosa adesivo (Figura 1C) e attaccare una plastica circolare trasparente di 20 mm di diametro (Figura 1D).
NOTA: Se si alimentano le larve, non rimuovere la striscia di carta protettiva dalla schiuma adesivo e passare direttamente al punto 2 del protocollo. Incollare l'anello a doppia schiuma, compresa la striscia di carta protettiva al mouse. - Fare una fessura di 1 cm nella plastica trasparente (Figura 1E).
- Creare almeno 10 piccoli fori con un perno entomologico (Figura 1F) per consentire un'eccessiva evaporazione dell'umidità durante l'esperimento.
NOTA: La capsula (Figura 1G) ha un'altezza totale di 4 mm (2 mm EVA-foam insieme a schiuma adesivo 2 mm) e può essere utilizzata per alimentare ninfe e larve di tutte le specie di zecche dure. La dimensione della capsula (Figura 1H) di diametro esterno di 20 mm è adatta per la maggior parte dei ceppi di topo, ma può essere modificata se necessario.
2. Preparazione dei topi prima dell'infestazione delle zecche
NOTA: In questo studio, 10 - 12 settimane di topi sperimentali femminili (ceppo C57BL/6 e BALB/cByJ) sono stati mantenuti in gabbie standard con cibo e acqua offerti ad libitum (Green line ventilated racks at -20 Pa) presso l'Agenzia francese per l'alimentazione, la salute e la sicurezza occupazionale (ANSES) strutture animali accreditate a Maisons-Alfort, Francia. Gli animali sono stati monitorati due volte al giorno da tecnici esperti per eventuali reazioni cutanee anormali, problemi di salute o complicazioni.
- Anestetizzare il topo con isoflurane nella camera di induzione. Una volta anetitato, posizionare il mouse sul pad di manipolazione e attaccare a un cono naso per la fornitura isoflurane continua (Figura 2A). Monitorare la frequenza respiratoria e ridurre il livello di isoflurane per assicurarsi che sia inferiore a 80 respiri al minuto.
NOTA: Prima della manipolazione, etichettare il singolo mouse mediante tatuaggi o chip di identificazione a radiofrequenza, se necessario. Si raccomanda di tenere i singoli topi in gabbie separate per evitare danni alla capsula mordendo. - Rasare la parte anteriore del mouse da dietro le scapole fino all'area appena dietro le orecchie (Figura 2A).
NOTA: L'area rasata deve essere maggiore della superficie della capsula. - Applicare la colla in lattice non irritante all'intero sito EVA-foam della capsula preparata e attendere 1 min (Figura 2B).
- Incollare la capsula al mouse indietro di una leggera pressione costante di 3 minuti con il dito(Figura 2C), soprattutto sul lato sinistro e destro della capsula. Sollevare leggermente la capsula per controllare visivamente il suo attaccamento alla pelle. Se vengono trovate regioni non attaccate, applicare più colla utilizzando una spatola e premere per altri 3 minuti.
3. Infestazione delle zecche
- Per l'infestazione di ninfe, introdurre le singole ninfe nella capsula tramite il taglio effettuato al punto 1.4 (Figura 2D).
NOTA: Per le specie di zecche Ixodes si raccomanda un massimo di 20 ninfe per una capsula. - Spremere leggermente la capsula da due lati per consentire alla plastica trasparente di piegarsi per facilitare l'introduzione di singole ninfe utilizzando forcepi di dissezione fine (Figura 2D). Spingere le singole ninfe attraverso il taglio all'interno della capsula. Una volta all'interno, girare le forcelle in 90 gradi e tirare fuori le forcelle per depositare le zecche all'interno della capsula.
- Per l'infestazione delle larve rimuovere il foglietto di carta dalla capsula allegata (Figura 2E). Posizionare la siringa, contenente larve (Figura 2F), direttamente all'interno della capsula e depositare le zecche spingendo lo stantuffo della siringa. Ruotare delicatamente lo stantuffo verso la pelle per rimuovere le larve rimanenti attaccate.
NOTA: Inserire le larve in una siringa da 1 mL con estremità tagliata tappata da un pezzo di cotone prima dell'esperimento. - Una volta che le larve sono depositate sulla pelle, chiudere la capsula attaccando la plastica trasparente (Figura 2G).
- Applicare la fascia di plastica protettiva intorno alla capsula (Figura 2H).
NOTA: La fascia di plastica protettiva ha notevolmente migliorato la durata della capsula per l'intera durata dell'esperimento (Figura 2I,J). È possibile collegare due capsule a un singolo mouse (Figura 2K). In questo caso, è necessario un minimo di 3 mm di spazio tra le capsule e l'area rasata deve essere aumentata in modo appropriato. - Riportare i topi nella gabbia.
4. Raccolta di zecche
- Anestetizzare il topo come nel passaggio 2.1 precedente.
- Fare un taglio a forma di croce (Figura 3A) alla plastica con un bisturi.
NOTA: Questo taglio a forma di croce consente una facile raccolta di zecche engorged o il distacco delle zecche di alimentazione, se necessario. - Se necessario, chiudere nuovamente la capsula attaccando un cerotto di plastica adesivo alla plastica trasparente (diametro 20 mm, figura 3B).
NOTA: Se si desidera la raccolta di segni di graduazione in più punti, è possibile utilizzare lo stesso cerotto di plastica appiccicoso. Se il protocollo lo richiede, si può anche eutanasia del mouse, rimuovere la capsula e raccogliere/scollegare le zecche (Figura 3C).
5. Recupero dei topi
- Tenere i topi in gabbia per un'altra settimana.
- Lasciare che la capsula si distacchi naturalmente.
NOTA: In questo caso, ci vogliono circa 8-9 giorni perché le capsule cadano. Quando la capsula viene rimossa, è importante verificare la presenza di reazioni anomale sulla pelle dei topi. In caso di irritazione applicare una lozione emolliente, anche se normalmente non è richiesto alcun trattamento. Se il protocollo etico lo consente, i topi recuperati (Figura 3D) possono essere riutilizzati per un'altra infestazione di zecche o esperimenti diversi.
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Representative Results
Proponiamo il metodo dettagliato step-by step per alimentare le fasi di zecca dura immatura in capsule EVA-foam applicate alla schiena di un topo (Figura 2). Questo protocollo non laborioso è adatto per vari tipi di esperimenti quando è necessario un preciso monitoraggio e raccolta delle zecche. I principali vantaggi di questo metodo sono la sua semplicità, materiali facilmente convenienti e breve durata. Inoltre, siamo riusciti ad attaccare due capsule a un individuo topo (Figura 2K) permettendoci di nutrire due diversi gruppi di zecche sullo stesso animale. L'uso della colla in lattice altamente efficace, ad essiccazione rapida e non irritante assicura che la capsula sia saldamente attaccata entro 3 minuti. Inoltre, la capsula è rimasta attaccata per almeno una settimana (Figura 2J) che è stato abbastanza tempo per l'engorgement della maggior parte delle specie di zecche dure immature21,22,23,24. A causa dell'elasticità della capsula, un'ulteriore manipolazione del topo per la raccolta del sangue o altri scopi era molto conveniente. Questa procedura consente anche il recupero completo dei topi dopo gli esperimenti (Figura 3D) dando la possibilità di riutilizzare gli animali ed evitare l'eutanasia. Il nostro sistema è stato utilizzato con successo per alimentare le ninfe Ixodes ricinus (Figura 4). Un tasso di successo da moderato ad alto è stato raggiunto rispettivamente nei ceppi di topo C57BL/6 e BALB/cByJ. In entrambi i casi tutte le ninfe hanno terminato l'alimentazione entro 4 – 5 giorni, mentre la maggior parte (75%) sceso il quarto giorno.
Figura 1: Preparazione della capsula EVA-foam. (A) Attacco di EVA-foam (nero) e adesivo doppia schiuma appiccicosa (bianco). (B) Taglio di 20 mm di diametro esterno e cerchio interno di 12 mm utilizzando punzoni foro in pelle. (C) Rimozione del nastro di protezione della carta dalla doppia schiuma appiccicosa adesivo. (D) Attacco della plastica trasparente alla capsula. (E) Taglio della fessura nella plastica trasparente con un bisturi. (F) Creazione di fori utilizzando un perno entomologico nella plastica. (G-H) Disegno schematico delle diverse parti della capsula e delle dimensioni. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Incollamento della capsula ai topi e infestazione delle zecche. (A) Parti anteriore posteriore del mouse di rasatura. (B) Applicazione della colla in lattice al lato EVA-foam della capsula. (C) Attacco della capsula al mouse. (D) Posizionamento della ninfa nella capsula attraverso il taglio nella plastica trasparente. (E) Sbucciare il nastro di protezione della carta dalla doppia schiuma appiccicosa adesivo prima dell'infestazione delle larve. (F) Iniezioni di larve all'interno della capsula utilizzando una siringa tagliata. (G) Chiusura della capsula con la plastica trasparente. (H) Posizionamento di una fascia di plastica protettiva intorno alla capsula. (I) Mouse con la capsula attaccata - 1st giorno. (J) Mouse con la capsula attaccata -7 esimo giorno. (K) Mouse con due capsule attaccate. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Raccolta di segni di graduazione e ripristino del mouse. (A) Taglio dell'apertura a forma trasversale per la raccolta di segni di graduazione. (B) Resealing della capsula con cerotto di plastica adesivo. (C) Rimozione della capsula da un topo eutanasia. Le frecce mostrano le zecche associate. (D) Mouse recuperato dopo aver lasciato la capsula. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Successo dell'ingorgo e durata di alimentazione delle ninfe di Ixodes ricinus che si nutrono di topi. (A) Percentuale totale di ninfe engorged nei topi C57BL/6 e BALB/cByJ. (B) Durata dell'ingorgo di ninfa nei topi C57BL/6 e BALB/cByJ. I numeri (n) per le ninfe infestate sono rispettivamente 130 e 25 per 15 singoli topi C57BL/6 e 5 singoli BALB/cByJ. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il passo più critico nel protocollo è l'incollaggio fermo della capsula alla pelle del topo. Pertanto, la colla in lattice deve essere applicata omogeneamente all'intera superficie EVA-foam della capsula e deve essere applicata una pressione costante per 3 minuti, soprattutto sul lato sinistro e destro della capsula. Si consiglia inoltre di posizionare la capsula il più in avanti possibile sul retro per evitare la sua rimozione dal mouse utilizzando le zampe posteriori. Nei nostri esperimenti, solo l'adesione della schifeccia EVA e della colla in lattice alla pelle del topo è stata convalidata e non possiamo garantire il raggiungimento degli stessi risultati utilizzando materiali diversi.
Durante i nostri esperimenti, il distacco della capsula dalla pelle entro i primi sette giorni non è stato osservato. Si consiglia vivamente di proteggere la superficie esterna della capsula utilizzando la banda di plastica (Figura 2H). Se la fascia protettiva è danneggiata nel corso dell'alimentazione delle zecche, può essere sostituita con una nuova. Il diametro della capsula può essere modificato per diverse dimensioni di deformazione del mouse. Suggeriamo di monitorare le zecche di alimentazione almeno due volte al giorno e di raccogliere le zecche engorged immediatamente dopo il distacco per evitare la loro desorica.
Il numero di zecche infestate è limitato dal diametro della capsula, così come la dimensione dell'host. Nei nostri esperimenti abbiamo usato un massimo di 20 ninfe o 100 larve di I. ricinus per un topo. Per le zecche di dimensioni più grandi come Amblyomma o Hyalomma sp., ecc il numero di zecche infestate dovrebbe essere ridotto per evitare danni all'ospite dalla perdita disangue 19,26,27. Pertanto, questa tecnica non è adatta per la manutenzione delle colonie di allevamento delle zecche, dove sono necessarie un gran numero di zecche per nutrirsi. A tale scopo, gli ospiti più grandi come conigli o pecore sono raccomandati20,27 per ridurre il fabbisogno complessivo di animali.
La nostra tecnica è adatta a vari tipi di esperimenti in cui è richiesto un modello murino, ed è necessario mantenere le zecche in area chiusa per una facile raccolta e/o monitoraggio dei loro parametri biologici. Rispetto ad altre tecniche10,11,12,13,14,15,16,17,18, questo semplice protocollo riduce notevolmente il tempo di anestesia complessiva (circa 5 minuti) per topo e la colla in lattice ad essiccazione veloce e non irritante non causa danni all'animale. La capsula EVA-foam altamente adesivo protegge l'area di alimentazione delle zecche e riduce al minimo il rischio di zecche perse, danneggiate o mangiate come riportato nei sistemi di infestazionelibera 10,11,12,13,15. Il grande vantaggio della tecnica proposta è la capsula a forma piatta e il suo fermo attaccamento di lunga durata alla pelle che consente una facile manipolazione con il mouse, se necessario. Particolare attenzione è stata prestata all'utilizzo di materiali elastici e non irritanti per ridurre il disagio agli animali sperimentali che consentono il recupero completo dell'ospite del topo dopo l'esperimento (Figura 3D).
Il metodo dovrebbe essere utilizzato per una varietà di esperimenti durante lo studio delle interazioni tick-host-patogeno, la manipolazione delle zecche del sistema immunitario dell'ospite, la valutazione di diverse misure di controllo delle zecche o la biologia delle zecche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo l'assistenza tecnica di Alain Bernier French National Institute of Agricultural Research (INRAE), e Océane Le Bidel (ANSES). Lo studio è stato sostenuto dal DIM One Health - Région àle-de-France (acronimo del progetto: NeuroPaTick). I topi sono stati acquistati da ANSES. Il dottor Jeffrey L. Blair è riconosciuto per aver esaminato la versione precedente del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
| PVC Binding Covers Transparent | Amazon | B078BNLSNP | Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable |
| Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape | Amazon | B07RHDZ35J | Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam |
| Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) | Amazon | B01DAA6X66 |
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