Summary
In dieser Studie wurde ein Fütterungssystem für Nymphal- und Larvenstadien von harter Zecke mit einer Kapsel entwickelt, die an laboratorischen Mäusen befestigt ist. Die Fütterungskapsel besteht aus flexiblen Materialien und bleibt mindestens eine Woche lang fest an der Maus befestigt und ermöglicht eine komfortable Überwachung der Zeckenfütterung.
Abstract
Zecken sind obligatorische Blutfütterung Parasiten in allen Stadien der Entwicklung (außer Eier) und werden als Vektoren von verschiedenen Krankheitserregern anerkannt. Die Verwendung von Mausmodellen in der Zeckenforschung ist entscheidend für das Verständnis ihrer Biologie und Zecken-Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen. Hier zeigen wir eine nicht-aufwendige Technik zur Fütterung unreifer Stadien harter Zecken an Labormäusen. Der Vorteil der Methode ist ihre Einfachheit, kurze Dauer und die Fähigkeit, Ticks zu verschiedenen Zeitpunkten eines Experiments zu überwachen oder zu sammeln. Darüber hinaus ermöglicht die Technik die Befestigung von zwei einzelnen Kapseln an der gleichen Maus, was für eine Vielzahl von Experimenten von Vorteil ist, bei denen zwei verschiedene Gruppen von Zecken erforderlich sind, um sich von demselben Tier zu ernähren. Die nicht reizende und flexible Kapsel besteht aus leicht zugänglichen Materialien und minimiert die Beschwerden der Versuchstiere. Darüber hinaus ist Sterbehilfe nicht notwendig, Mäuse erholen sich nach dem Experiment vollständig und stehen zur Wiederverwendung zur Verfügung.
Introduction
Zecken sind wichtige Vektoren mehrerer Krankheitserreger und stellen ein ernstes Risiko für die Gesundheit von Mensch und Tierdar 1. Die Einrichtung eines effektiven Fütterungssystems ist entscheidend, wenn sie ihre Biologie, Zeckenwirt-Pathogen-Wechselwirkungen oder die Einführung wirksamer Kontrollmaßnahmen untersuchen. Derzeit stehen mehrere künstliche Fütterungssysteme zur Verfügung, die den Einsatz lebender Tiere vermeiden, für Zecken2,3,4 und diese sollten immer dann eingesetzt werden, wenn es die Versuchsbedingungen zulassen. In verschiedenen experimentellen Umgebungen imitieren diese Systeme jedoch nicht die spezifischen physiologischen Merkmale und der Einsatz lebender Tiere ist notwendig, um relevante Ergebnisse zu erzielen.
Labormäuse werden häufig für die Untersuchung vieler biologischer Systeme verwendet und werden routinemäßig als Wirte für die Fütterung von Zecken5,6,7,8,9verwendet. Die beiden häufigsten Methoden der Fütterung unreifer Zecken an Mäusen sind freier Befall und die Verwendung von Einschließungskammern, die an der Maus befestigt sind. Freie Befall werden in erster Linie für Larvenstadien verwendet und engorged Zecken können in einen Bereich fallen, wo sie zurückgewonnen werden können. Einfriedungskammern bestehen in der Regel aus Acryl- oder Polypropylenkappen, die auf den Rücken der Maus geklebt sind. Die erste Technik ist ein effektives natürliches System für die Zeckenfütterung, erlaubt aber keine genaue Überwachung während des Experiments, da die einzelnen Zecken in verschiedenen Teilen des Wirtskörpers verteilt sind. Zusätzlich können engorged Zecken, die in einen Erholungsbereich fallen, mit Kot und Urin kontaminiert werden10,11,12,13,14, die die Zeckenfitness stark beeinträchtigen können oder sie können von der Maus beschädigt oder gegessen werden, wenn es keine Trennung zwischen dem Tier und dem Erholungsbereich15. Kammerbasierte Systeme erlauben die Eingrenzung von Zecken in einen definierten Bereich, jedoch ist der Klebeprozess mühsam und die Kappen sind oft schwach an den Kleber haften und lösen sich daher oft während des Experiments16,17,18,19. Die Kappen sind auch steif, unbequem und führen zu Hautreaktionen, die die Wiederverwendung der Mäuse verhindern und ihre Euthanasie nach dem Experiment erforderlich machen.
In unserer vorherigen Studie haben wir erfolgreich ein effektives System mit Kammern aus Ethylen-Vinylacetat (EVA)-Schaum zur Fütterung von Zecken an Laborkaninchen20entwickelt. Hierbei haben wir dieses System an ein Mausmodell angepasst und schlagen eine einfache und saubere Methode vor, um unreife harte Zeckenstufen in geschlossenen Kapseln aus EVA-Schaum zu füttern. Insbesondere verwendet unser System elastische EVA-Schaumkapseln, die mit schnell trocknendem (3 min) nicht reizenden Latexkleber an die rasierten Mäuse geklebt werden. Diese Technik ermöglicht eine feste und langanhaltende Befestigung von Kapseln an der experimentellen Maus sowie einen effektiven Zeckenbefall/-sammlung während des gesamten Experimentsverlaufs. Die flache Kapsel besteht aus flexiblen Materialien und behindert nicht die Manipulation der Maus für die Blutentnahme oder andere Zwecke. Das System eignet sich hauptsächlich für die Nymphenzzstufen, kann aber mit leichter Modifikation auch zur Fütterung von Larven verwendet werden. Die Methode kann von einer einzigen erfahrenen Person abgeschlossen werden und eine umfassende Ausbildung ist nicht erforderlich.
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Protocol
Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll nur angewendet werden kann, wenn alle Wohlfahrts- und Sicherheitsmaßnahmen im Labor erfüllt sind. Dieses Protokoll erhielt die Erlaubnis, Mäuse zur Zeckenfütterung von der Ethikkommission für TierversucheComEth Anses/ENVA/UPEC, Genehmigungsnummern E 94 046 08, zu verwenden. Für den Endpunkt wurden die Tiere in zwei Phasen von jeweils 4 und 5 min CO2 für 9 min ausgesetzt.
1. Zubereitung der Kapsel
- Stick 2 mm dicker EVA-Schaum und der Klebstoff Doppelhaftschaum zusammen (Abbildung 1A).
- Schneiden Sie mit einem Lederlochstanzen mit einem Durchmesser von 20 mm einen Kreis aus den geklebten Schaumstoffstücken. Dann, mit einem 12 mm Durchmesser Lochstanz, schneiden Sie das Innere, um den Doppelschaumkreis zu erstellen (Abbildung 1B).
HINWEIS: Die Rahmendicke der Kapsel sollte größer als 3 mm sein, um eine ausreichende Oberfläche für den Klebevorgang an die Wirtshaut zu gewährleisten (siehe unten). - Den Schutzpapierstreifen vom Klebe-Doppelhaftschaum schälen (Abbildung 1C) und befestigen Sie einen transparenten kreisförmigen Kunststoff mit 20 mm Durchmesser (Abbildung 1D).
HINWEIS: Wenn Sie Larven füttern, entfernen Sie den Schutzpapierstreifen nicht aus dem Klebeschaum und bewegen Sie sich direkt zur Stufe 2 im Protokoll. Kleben Sie den doppelten Schaumstoffring, einschließlich Schutzpapierstreifen, an die Maus. - Machen Sie einen Schlitz von ca. 1 cm im transparenten Kunststoff (Abbildung 1E).
- Erstellen Sie mindestens 10 kleine Löcher mit einem entomologischen Stift (Abbildung 1F), um eine übermäßige Feuchtigkeitsverdunstung während des Experiments zu ermöglichen.
HINWEIS: Die Kapsel (Abbildung 1G) hat eine Gesamthöhe von 4 mm (2 mm EVA-Schaum zusammen mit 2 mm Klebstoffschaum) und kann verwendet werden, um Nymphen und Larven aller Harten Zeckenarten zu füttern. Die Kapselgröße(Abbildung 1H) von 20 mm Außendurchmesser ist für die meisten Mausstämme geeignet, kann aber bei Bedarf geändert werden.
2. Vorbereitung der Mäuse vor Zeckenbefall
HINWEIS: In dieser Studie wurden 10 - 12 Wochen alte weibliche Versuchsmäuse (Stamm C57BL/6 und BALB/cByJ) in Standardkäfigen mit Jelibitum (Grüne Linie belüftete Regale bei -20 Pa) bei der französischen Agentur für Ernährung, Umwelt und Arbeitsmedizin (ANSES) akkreditierte Tiereinrichtungen in Maisons-Alfort, Frankreich, gehalten. Die Tiere wurden zweimal täglich von erfahrenen Technikern auf abnorme Hautreaktionen, Gesundheitsprobleme oder Komplikationen überwacht.
- Anästhesisieren Sie Maus mit Isofluran in der Induktionskammer. Nach der Anästhesisierung die Maus auf das Manipulationspad legen und an einem Nasenkegel für die kontinuierliche Isofluranversorgung befestigen (Abbildung 2A). Überwachen Sie die Atemfrequenz und reduzieren Sie den Isofluranspiegel, um sicherzustellen, dass sie weniger als 80 Atemzüge pro Minute beträgt.
HINWEIS: Beschriften Sie vor der Manipulation die einzelne Maus bei Bedarf durch Tätowierung oder Hochfrequenz-Identifikationschip. Es wird empfohlen, die einzelnen Mäuse in separaten Käfigen zu halten, um Kapselschäden durch Beißen zu vermeiden. - Rasieren Sie den vorderen Teil der Maus hinter den Schulterblättern bis zum Bereich direkt hinter den Ohren(Abbildung 2A).
HINWEIS: Der rasierte Bereich sollte größer als die Kapseloberfläche sein. - Nicht reizenden Latexkleber auf die gesamte EVA-Schaumstelle der vorbereiteten Kapsel auftragen und 1 min warten (Abbildung 2B).
- Kleben Sie die Kapsel mit leichtem 3 min konstantem Druck mit dem Finger(Abbildung 2C), insbesondere auf der linken und rechten Seite der Kapsel, an die Maus zurück. Heben Sie die Kapsel leicht an, um ihre Befestigung an der Haut visuell zu überprüfen. Wenn nicht angefügte Bereiche gefunden werden, wenden Sie mehr Kleber mit einem Spachtel an und drücken Sie weitere 3 Minuten.
3. Zeckenbefall
- Für Nymphenbefall, führen Sie die einzelnen Nymphen in die Kapsel über den Schnitt in Schritt 1.4 (Abbildung 2D).
HINWEIS: Für Ixodes Zeckenarten wird pro Kapsel maximal 20 Nymphen empfohlen. - Drücken Sie die Kapsel von zwei Seiten leicht, damit sich der transparente Kunststoff für eine einfachere Einführung einzelner Nymphen mit feinen Sezierzangen biegen kann (Abbildung 2D). Drücken Sie die einzelnen Nymphen über den Schnitt in die Kapsel. Sobald sie drinnen sind, drehen Sie die Zange in 90° und ziehen Sie die Zange heraus, um Zecken in der Kapsel zu deponieren.
- Bei Larvenbefall den Papierschlupf aus der beigefügten Kapsel entfernen (Abbildung 2E). Legen Sie die Spritze, die Larven enthält (Abbildung 2F), direkt in die Kapsel und legen Sie Zecken ab, indem Sie den Spritzenkolben drücken. Drehen Sie den Kolben vorsichtig zur Haut, um die verbleibenden Larven zu entfernen.
HINWEIS: Legen Sie Larven in eine 1 ml Spritze mit schnittem Ende, das vor dem Experiment von einem Stück Baumwolle gesteckt wurde. - Sobald die Larven auf der Haut abgelagert sind, schließen Sie die Kapsel, indem Sie den transparenten Kunststoff befestigen (Abbildung 2G).
- Tragen Sie das schützende Kunststoffband um die Kapsel auf (Abbildung 2H).
HINWEIS: Das schützende Kunststoffband hat die Haltbarkeit der Kapsel während der gesamten Dauer des Experiments erheblich verbessert (Abbildung 2I,J). Es ist möglich, zwei Kapseln an einer einzelnen Maus zu befestigen (Abbildung 2K). In diesem Fall ist ein Mindestabstand von 3 mm zwischen den Kapseln erforderlich und der rasierte Bereich sollte entsprechend vergrößert werden. - Bringen Sie die Mäuse in den Käfig zurück.
4. Sammlung von Zecken
- Anästhetisieren Sie die Maus wie in Schritt 2.1 oben.
- Machen Sie einen kreuzförmigen Schnitt (Abbildung 3A) zum Kunststoff mit einem Skalpell.
HINWEIS: Dieser kreuzförmige Schnitt ermöglicht eine einfache Sammlung von engorged Zecken oder Ablösung der Fütterung Zecken, wenn nötig. - Schließen Sie die Kapsel bei Bedarf erneut, indem Sie ein klebendes Kunststoffpflaster an den transparenten Kunststoff (20 mm Durchmesser, Abbildung 3B )kleben.
HINWEIS: Wenn die Sammlung von Ticks an mehreren Zeitpunkten gewünscht wird, kann das gleiche klebrige Kunststoffpflaster verwendet werden. Wenn das Protokoll erfordert, kann man auch die Maus einschläfern, die Kapsel entfernen und die Zecken sammeln/ablösen (Abbildung 3C).
5. Rückgewinnung der Mäuse
- Halten Sie die Mäuse für eine weitere Woche im Käfig.
- Lassen Sie die Kapsel natürlich lösen.
HINWEIS: In diesem Fall dauert es etwa 8-9 Tage, bis Kapseln abfallen. Wenn die Kapsel entfernt wird, ist es wichtig, auf abnormale Reaktionen auf der Haut der Mäuse zu überprüfen. Bei Reizung eine Weichmacherlotion auftragen, obwohl normalerweise keine Behandlung erforderlich ist. Wenn das ethische Protokoll es zulässt, können die wiedergewonnenen Mäuse (Abbildung 3D) für einen anderen Zeckenbefall oder andere Experimente wiederverwendet werden.
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Representative Results
Wir schlagen die detaillierte Schritt-für-Schritt-Methode zur Fütterung unreifer harter Zeckenstufen in EVA-Schaumkapseln vor, die auf den Rücken einer Maus aufgetragen werden (Abbildung 2). Dieses nicht-aufwendige Protokoll eignet sich für verschiedene Arten von Experimenten, wenn eine präzise Tick-Überwachung und -Sammlung erforderlich ist. Die Hauptvorteile dieser Methode sind seine Einfachheit, leicht zugängliche kostengünstige Materialien und kurze Dauer. Darüber hinaus ist es uns gelungen, zwei Kapseln an einem Mausindividuum(Abbildung 2K) zu befestigen, so dass wir zwei verschiedene Gruppen von Zecken auf ein und dasselbe Tier füttern konnten. Die Verwendung des hochwirksamen, schnell trocknenden und nicht reizenden Latexklebers sorgt dafür, dass die Kapsel innerhalb von 3 min fest befestigt ist. Auch blieb die Kapsel für mindestens eine Woche befestigt(Abbildung 2J), was genug Zeit für die Engorgement der meisten der unreifen harten Zeckenarten21,22,23,24war. Aufgrund der Kapselelastizität war eine weitere Manipulation der Maus zur Blutentnahme oder zu anderen Zwecken sehr praktisch. Dieses Verfahren ermöglicht auch eine vollständige Genesung der Mäuse nach den Experimenten (Abbildung 3D), die die Möglichkeit gibt, die Tiere wiederzuverwenden und Euthanasie zu vermeiden. Unser System wurde erfolgreich eingesetzt, um Ixodes ricinus nymphs zu füttern (Abbildung 4). Bei C57BL/6 bzw. BALB/cByJ-Mausstämmen wurde eine mäßige bis hohe Engorgement-Erfolgsrate erreicht. In beiden Fällen beendeten alle Nymphen die Fütterung innerhalb von 4 – 5 Tagen, während die Mehrheit (ca. 75%) am vierten Tag ab.
Abbildung 1: EVA-Schaumkapselvorbereitung. (A) Befestigung von EVA-Schaum (schwarz) und Klebstoff-Doppelhaftschaum (weiß). (B) Schneiden 20 mm Durchmesser Außen- und 12 mm Innenkreis mit Lederlochstanzen. (C) Entfernen des Papierschutzbandes vom Klebe-Doppelhaftschaum. (D) Befestigung des transparenten Kunststoffs an der Kapsel. (E) Schneiden Sie den Schlitz im transparenten Kunststoff mit einem Skalpell. (F) Erstellen von Löchern mit einem entomologischen Stift im Kunststoff. (G-H) Schematische Zeichnung der verschiedenen Teile der Kapsel und Abmessungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Verkleben der Kapsel an die Mäuse und Zeckenbefall. (A) Rasieren des vorderen Teils der Maus. (B) Auftragen des Latexklebers auf die EVA-Schaumseite der Kapsel. (C) Befestigung der Kapsel an der Maus. (D) Die Nymphe über den Schnitt in den transparenten Kunststoff in die Kapsel legen. (E) Das Papierschutzband vor dem Larvenbefall vom klebedoppelten Klebeschaum abziehen. (F) Injektionen von Larven in der Kapsel mit einer geschnittenen Spritze. (G) Schließen Sie die Kapsel mit dem transparenten Kunststoff. (H) Platzieren eines schützenden Kunststoffbandes um die Kapsel. (I) Maus mit der beigefügten Kapsel -1. Tag. (J) Maus mit der beigefügten Kapsel -7. Tag. (K) Maus mit zwei Kapseln befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Tick-Sammlung und Maus-Wiederherstellung. (A) Schneiden kreuz-Form-Öffnung für Tick-Sammlung. (B) Versiegeln der Kapsel mit Klebekunststoff-Patch. (C) Kapselentfernung von einer eingeschläferten Maus. Pfeile zeigen die angehängten Ticks an. (D) Wiederhergestellte Maus nach dem Abgeworfenen der Kapsel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Engorgement-Erfolg und Fütterungsdauer von Ixodes ricinus Nymphen, die sich von Mäusen ernähren. (A) Gesamtprozentsatz der engorged Nymphen in C57BL/6 und BALB/cByJ Mäuse. (B) Dauer der Nymphenzürung bei C57BL/6 und BALB/cByJ-Mäusen. Die (n) Zahlen für befallene Nymphen sind 130 bzw. 25 für 15 einzelne C57BL/6 bzw. 5 einzelne BALB/cByJ-Mäuse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der wichtigste Schritt im Protokoll ist das feste Kleben der Kapsel an die Maushaut. Daher sollte der Latexkleber homogen auf die gesamte EVA-Schaumoberfläche der Kapsel aufgetragen und 3 Minuten lang konstanter Druck aufgebracht werden, insbesondere auf die linke und rechte Seite der Kapsel. Wir empfehlen auch, die Kapsel so weit nach vorne wie möglich auf dem Rücken zu platzieren, um zu vermeiden, dass die Maus mit ihren hinteren Pfoten entfernt wird. In unseren Experimenten wurde nur die Haftung des EVA-Schaum- und Latexklebers auf der Maushaut validiert und wir können die Erreichung der gleichen Ergebnisse mit unterschiedlichen Materialien nicht garantieren.
Während unserer Experimente wurde die Ablösung der Kapsel von der Haut innerhalb der ersten sieben Tage nicht beobachtet. Wir empfehlen dringend, die Außenfläche der Kapsel mit dem Kunststoffband zu schützen (Abbildung 2H). Wenn das Schutzband im Laufe der Zeckenfütterung beschädigt ist, kann es durch ein neues ersetzt werden. Der Durchmesser der Kapsel kann für verschiedene Mausdehnungsgrößen geändert werden. Wir empfehlen, die Fütterungszecken mindestens zweimal täglich zu überwachen und engorged Zecken sofort nach der Ablösung zu sammeln, um ihre Austrocknung zu vermeiden.
Die Anzahl der befallenen Zecken wird durch den Kapseldurchmesser sowie die Wirtsgröße begrenzt. In unseren Experimenten verwendeten wir maximal 20 Nymphen oder 100 Larven von I. ricinus für eine Maus. Für die größeren Zecken wie Amblyomma oder Hyalomma sp., etc. sollte die Anzahl der befallenen Zecken reduziert werden, um Schäden für den Wirt durch Blutverlust zu vermeiden19,26,27. Daher ist diese Technik nicht für die Pflege von Zeckenzuchtkolonien geeignet, wo eine große Anzahl von Zecken benötigt wird, um zu füttern. Zu diesem Zweck werden größere Wirte wie Kaninchen oder Schafe20,27 empfohlen, um den gesamttierischen Bedarf zu reduzieren.
Unsere Technik eignet sich für verschiedene Arten von Experimenten, bei denen ein Mausmodell erforderlich ist, und es ist notwendig, Zecken im geschlossenen Bereich zu halten, um ihre biologischen Parameter einfach zu sammeln und/oder zu überwachen. Im Vergleich zu anderen Techniken10,11,12,13,14,15,16,17,18, reduziert dieses einfache Protokoll die Gesamtanästhesiezeit (ca. 5 Minuten) pro Maus erheblich und der schnell trocknende, nicht reizende Latexkleber schadet dem Tier nicht. Die hochklebende EVA-Schaumkapsel schützt den Zeckenzusendebereich und minimiert das Risiko verlorener, beschädigter oder gegessener Zecken, wie in den freien Befallsystemen10,11,12,13,15berichtet. Der große Vorteil der vorgeschlagenen Technik ist die flache Kapsel und ihre feste, langanhaltende Befestigung an der Haut, die bei Bedarf eine einfache Manipulation mit der Maus ermöglicht. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Verwendung von elastischen und nicht reizenden Materialien gewidmet, um die Beschwerden der Versuchstiere zu reduzieren, was eine vollständige Wiederherstellung des Mauswirts nach dem Experiment ermöglicht (Abbildung 3D).
Die Methode wird voraussichtlich für eine Vielzahl von Experimenten bei der Untersuchung von Tick-Host-Pathogen-Wechselwirkungen, Zeckenmanipulation des Wirts-Immunsystems, Bewertung verschiedener Zeckenkontrollmaßnahmen oder Zeckenbiologie verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir würdigen die technische Unterstützung von Alain Bernier French National Institute of Agricultural Research (INRAE) und Océane Le Bidel (ANSES). Die Studie wurde von der DIM One Health - Région éle-de-France (Akronym des Projekts: NeuroPaTick)unterstützt. Die Mäuse wurden von ANSES gekauft. Dr. Jeffrey L. Blair ist dafür bekannt, die frühere Version des Manuskripts überprüft zu haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVA-foam 2 mm thick, (low density) | Cosplay Shop | EVA-45kg (950/450/2 mm) | It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD) |
| Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches | Amazon | B0848S3S6T | Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon. |
| Mice BALB/cByJ | Charles River | Strain code 627 | |
| Mice C57BL/6 | Charles River | Strain code 664 | |
| No-toxic Latex Glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU) |
| Punch Tool Hand Art Tool | Amazon | B07QPWNGBF | Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap |
| PVC Binding Covers Transparent | Amazon | B078BNLSNP | Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable |
| Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape | Amazon | B07RHDZ35J | Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam |
| Transparent seal stickers (20 mm diameter circles) | Amazon | B01DAA6X66 |
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