Summary
Dit protocol beschrijft de implantatie van menselijke coronaire stents in de abdominale aorta van ratten met een apoE-/- achtergrond met behulp van een trans-femurtoegang. In vergelijking met andere diermodellen hebben murinemodellen de voordelen van een hoge doorvoer, reproduceerbaarheid, gebruiksgemak en huisvesting en een brede beschikbaarheid van moleculaire markers.
Abstract
Percutane coronaire interventie (PCI), gecombineerd met de inzet van een coronaire stent, vertegenwoordigt de gouden standaard in interventionele behandeling van coronaire hartziekte. In-stent restenosis (ISR) wordt bepaald door een overmatige proliferatie van neointimaal weefsel in de stent en beperkt het succes van stents op lange termijn. Een verscheidenheid van dierlijke modellen zijn gebruikt om pathofysiologische processen te verduidelijken die ten grondslag liggen aan in-stent restenosis (ISR), waarbij de varkenskransslagader en de konijnen-iliacale slagadermodellen het meest worden gebruikt. Murine-modellen bieden de voordelen van een hoge doorvoer, gebruiksgemak en behuizing, reproduceerbaarheid en een brede beschikbaarheid van moleculaire markers. Het apolipoproteïne E-deficiënte (apoE-/- ) muismodel is veel gebruikt om hart- en vaatziekten te bestuderen. Stents moeten echter worden geminiaturiseerd om in muizen te worden geïmplanteerd, met belangrijke veranderingen van hun mechanische en (potentieel) biologische eigenschappen. Het gebruik van apoE-/- ratten kunnen deze tekortkomingen als apoE overwinnen-/- ratten maken de evaluatie van coronaire stents van menselijke grootte mogelijk en bieden tegelijkertijd een atherogene fenotype. Dit maakt ze een uitstekend en betrouwbaar model om ISR te onderzoeken na stentimplantatie. Hier beschrijven we in detail de implantatie van commercieel beschikbare menselijke coronaire stents in de abdominale aorta van ratten met een apoE-/- achtergrond met behulp van een trans-femurtoegang.
Introduction
Percutane coronaire interventie (PCI), gecombineerd met de inzet van een coronaire stent, vertegenwoordigt de gouden standaard in interventionele behandeling van coronaire hartziekte1. Het succes op lange termijn van stents kan echter worden beperkt door het optreden van in-stent restenosis (ISR) dat wordt bepaald door een overmatige proliferatie van neointimaal weefsel in de stent2,3. ISR kan een herinterventie vereisen, hetzij met coronaire bypass of re-PCI. Er zijn verschillende diermodellen voorgesteld voor de studie van ISR, elk met voordelen en tekortkomingen. De belangrijkste nadelen van de meest gebruikte varkenskransslagader- en konijnen-iliacale slagadermodellen, hoewel het ontwikkelen van laesies die duidelijk vergelijkbaar zijn met mensen na stentimplantatie4,5, zijn grote dier- en huisvestingskosten die logistieke problemen veroorzaken, vooral in langetermijnstudies, evenals beperkingen in behandeling en apparatuur. Bovendien is de beschikbaarheid van antilichamen tegen cellulaire eiwitten van varkens en konijnen beperkt. Aan de andere kant bieden murinemodellen de belangrijkste voordelen van hoge doorvoer en reproduceerbaarheid, evenals gebruiksgemak, behuizing en dus kosteneffectiviteit. Bovendien zijn er een hoger aantal antilichamen beschikbaar. Hoewel apolipoproteïne E-deficiënte (apoE-/-) muizen breed zijn gebruikt voor de studie van atherosclerose6,7,8, zijn ze ongeschikt voor de studie van ISR omdat stents moeten worden geminiaturiseerd om in muizen te worden geïmplanteerd, waardoor de mechanische eigenschappen van de stents mogelijk veranderen. Bovendien meet de aortawand van muizen tussen 50 μm bij jonge muizen en 85 μm bij oude muizen9, en stents moeten worden ingezet met drukniveaus van slechts 2 atm, wat kan leiden tot malappositie van de stent10. Ratten maken echter de implantatie van in de handel verkrijgbare menselijke coronaire stents mogelijk en vertonen een vasculaire genezingscursus vergelijkbaar met grotere dieren na aorta-stentimplantatie, voor het eerst gerapporteerd door Langeveld et al.11. Deze techniek vereiste oorspronkelijk een trans-abdominale toegang, die een fysieke vernauwing van de aorta noodzakelijk maakte om een tijdelijke onderbreking van de bloedstroom te bereiken. Om de mogelijk geassocieerde vaatletsels en ontstekingsreacties te voorkomen, werd de techniek later verfijnd door de introductie van een trans-iliacale toegang, wat bovendien resulteerde in een hogere overlevingskans van de dieren12.
Omdat wildtype ratten geen atherosclerotische laesies ontwikkelen13, zijn apoE-/- ratten gegenereerd met behulp van nucleasetechnieken zoals Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN)14, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)15, en Zinc Finger (ZF)16. ApoE-/- ratten zijn sinds 2011 in de handel verkrijgbaar. ApoE-/- ratten bieden een atherogene achtergrond en zorgen voor een meer realistische evaluatie van coronaire stents van menselijke grootte, vooral met betrekking tot ISR.
Hierin beschrijven we de methode via de transfemorale toegangsroute en met behulp van een in de handel verkrijgbare dun-strut kobalt-chroom-eluting stent (DES), maar het kan ook worden toegepast voor de studie van andere stenttypes, zoals bare metal stents (BMS) of biologisch afbreekbare stents.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dierenwelzijnswet (TSchG) en Richtlijn 2010/63/EU betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. De officiële goedkeuring voor dit onderzoek werd verleend door de Government Animal Care and Use Committee (Protocolnr.: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Duitsland). Het onderzoeksprotocol voldeed aan de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Postoperatieve pijnbehandeling is gebaseerd op de aanbevelingen van de Duitse Vereniging voor Laboratoriumdierkunde (GV-SOLAS) en Initiative Veterinary Pain Therapy.
1. Basistechnieken en gemeenschappelijke procedures
- Gebruik homozygote apoE-/- Sprague-Dawley ratten. Identificeer het genotype van elk dier met behulp van standaardmethoden17.
- Houd de dieren onder identieke omstandigheden (21 °C ± 2 °C, 60% ± 5% vochtigheid en een licht/donkere cyclus van 12 uur) en zorg voor vrije toegang tot water en voedsel.
- Voer alle procedures uit onder schone maar niet-steriele omstandigheden.
- Zodra de rat is verdoofd, voert u alle procedures uit onder een chirurgische microscoop bij een vergroting van 16x.
- Gebruik wattenstaafjes voor compressiehemostase. Gaasdoekjes (5 cm x 5 cm) gedrenkt in een ringeroplossing met lactaat zijn nuttig om de lies vochtig te houden.
- Volg de afvalverwijderingsvoorschriften om gebruikte materialen te verwijderen.
2. Voorbereidingen voor de operatie
- Bereid de diergeneesmiddelen voor voordat u met de operatie begint. Bewaar alle oplossingen op kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.
- Dertig minuten voor de ingreep 0,03-0,05 mg/kg buprenorfine subcutaan toedienen.
- Verdoof de rat met een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg lichaamsgewicht (BW) (S)-ketamine en 8 mg/kg BW xylazine.
- Beoordeel het gewicht van de rat met behulp van een weegschaal.
- Plaats de rat op een verwarmingskussen en bevestig de bovenste en onderste ledematen met behulp van medische tape. Plaats de rat met zijn linkerachterbeen volledig uitgeschoven en zoveel mogelijk in lijn met zijn wervelkolom om een rechte lijn tussen femurslagader en aorta te creëren. Dit vergemakkelijkt het oprukken van de ballongemonteerde stent door de aorta bifurcatie.
- Zorg voor anesthesie bij inademing van 1,5 vol% isofluraan in 97,5% zuurstof bij een debiet van 2 L/min.
OPMERKING: Laat de rat spontaan ademen, zonder intubatie. - Breng oogzalf aan om oogbeschadiging tijdens bewusteloosheid te voorkomen.
- Scheer de vacht uit de lies en onderbuik van de rat en steriliseer de overeenkomstige huid met een povidone-jodiumoplossing.
- Voordat u met de operatie begint, controleert u de voldoende diepte van de anesthesie door de staartpunt en het interdigitale weefsel te knijpen.
3. Chirurgie
- Maak een mediale incisie van ~0,5\u20121 cm in de linker lies om de huid en de onderliggende fascia te openen.
- Ontleed en sonde bot in de diepten totdat de pulserende linker femurslagader kan worden geïdentificeerd.
- Bereid met behulp van een zeer fijne tang de femurslagader voor door het omringende bindweefsel voorzichtig te verwijderen. Wees voorzichtig om noch de femurzenuw, noch de femurader te beschadigen, die mediaal is voor de slagader.
- Bereid ongeveer 1 cm van de dijbeenslagader voor. Plaats de punt van de tang voorzichtig onder het vat om deze voorzichtig op te tillen.
- Draadstukken van 4-0 zijden hechtdraad onder de distale en proximale delen van de slagader en vormen stroppen. Klem de uiteinden van elk van de twee draadbanden tussen de takken van een chirurgische klem. Gebruik de chirurgische klemmen om de slagader te controleren. Strek en til de slings voorzichtig op om de bloedstroom tijdelijk te onderbreken.
OPMERKING: Werk snel om een langdurig tourniquet te voorkomen dat kan leiden tot weefselschade. - Voer met een scherpe microschaar een arteriotomie uit in het midden van de femurslagader.
- Introduceer een geleidingsdraad door de arteriotomie. Wanneer u de proximale draadsling bereikt, laat u de spanning van de draad los door de chirurgische klem te bewegen en de geleidedraad verder naar de abdominale aorta te brengen.
OPMERKING: Knip de geleidingsdraad af met behulp van een draadsnijder om de hantering te vergemakkelijken. - Plaats het proximale uiteinde van de geleidingsdraad tussen het middenrif en de nierslagaders.
OPMERKING: Als u de geleidingsdraad te ver opstrukt, bestaat het risico op aorta- of hartletsel. We raden aan om de buik te openen om een adequate positionering van de geleidedraad en de stent te garanderen, ten minste voor de eerste verschillende dieren. - Introduceer een gekrompen en ballongemonteerde coronaire stent van 2,25 mm x 8 mm (max. 2,5 mm x 8 mm) over de geleidedraad in de femurslagader en schuif deze naar de abdominale aorta.
- Plaats de stent net boven de aorta bifurcatie maar onder de nierslagaders. Zet de stent in door de ballonkatheter gedurende 15 s naar 12 atm te blazen met behulp van een inflatiespuitsysteem.
- Laat de ballonkatheter leeglopen en behoud de negatieve druk volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor de stent die in gebruik is.
- Trek de leeggelopen katheter langzaam terug terwijl u de stent op zijn plaats laat.
- Net voordat u de katheter eruit haalt, creëert u spanning op de draadlus boven de incisie met de chirurgische klem om de bloedstroom opnieuw te onderbreken. Verwijder vervolgens de ballonkatheter en ligaer het vat proximally.
- Bind de proximale en distale draadlussen vast om de femurslagader te verbinden en bevestig voldoende hemostase van de arteriotomie. Collaterale slagaders zorgen voor verdere perfusie naar het ledemaat.
- Sluit de spier die de slagader overstijt, evenals de huidincisie met behulp van 10-0 niet-resorbeerbare hechtingen.
4. Dierverzorging na stentimplantatie
- Laat de rat onmiddellijk na de operatie 60 minuten herstellen in een speciale kooi op de intensive care met opgewarmde lucht (30\u201235 °C) en een zuurstoftoevoer.
- Let goed op de dieren tot ze volledig hersteld zijn. Verplaats daarna de ratten in een normale kooi. Bied ad libitum toegang tot water en voedsel.
- Dien postoperatieve analgesie elke 6-12 uur toe met 0,03-0,05 mg/kg buprenorfine (s.c., in 500μl NaCl) gedurende in totaal 72 uur onder klinische beoordeling.
- Laat het voedsel mengen met clopidogrel (15 mg/kg) om trombose van de geïmplanteerde stent te voorkomen.
- Om hypercholesterolemische aandoeningen en plaquevorming te verbeteren, begint u 6\u20128 weken na de geboorte met westerse dieetvoeding en gaat u door tot euthanasie. Indien gewenst kan een cohort dieren die normaal rattenvoer krijgen als controle dienen.
5. Weefselverzameling en -verwerking
- Voordat u begint met de weefselverplanting op het aangewezen tijdstip, euthanaseert u het dier volgens de IACUC-richtlijnen. Oogst de stented aorta voor histologische analyse aan het einde van de observatieperiode.
- Open de buik door een middellijnincisie en verwijder het stented segment van de aorta en aangrenzende niet-gestenteerde delen van de aorta, elk met een afmeting van 0,5 cm.
- Plaats het weefsel in een oplossing van 4% gebufferd formaline gedurende 24 uur voor fixatie.
- Integreer het gestenteerde arteriële weefsel in plastic en voer histologische en immunohistochemische kleuring uit volgens standaardprotocollen18,19.
6. Histomorfometrische analyse
- Voer histomorfometrische analyse uit van sequentiële secties van het proximale, middelste en distale deel van de stented aorta door middel van een microscoop die is gekoppeld aan een computer met een geschikte beeldanalysesoftware.
- Traceer de contouren van de externe elastische lamina (paling, tussen adventitia en media), interne elastische lamina (IEL, tussen media en neointima) en lumen met een grafische tekentablet. Bereken op deze waarden het palinggebied, het IEL-gebied en het lumengebied met de software.
- Bereken het percentage cross-sectionele gebied in-stent restenosis (ISR):
- Bereken het totale neointimale gebied (Ai):
- Meet de neointimale dikte (NIT) over elke stentveer als de afstand tussen strut en lumen. Meet de NIT tussen de stentveren als de afstand tussen IEL en lumen.
OPMERKING: U kunt ook NIT berekenen als
waarbij PL en PIEL respectievelijk de lumen- en interne elastische lamina-omtrekzijn 20. - Voer aanvullende analyses uit volgens de vereisten van het onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft stentimplantatie in de abdominale aorta van ratten met behulp van een trans-femurtoegangsroute (Figuur 1). Het eerste centrale punt van dit diermodel is dat het de inzet van coronaire stents van menselijke grootte mogelijk maakt. Een in de handel verkrijgde gekrompen en op ballonnen gemonteerde coronaire stent kan in de abdominale aorta van ratten worden geplaatst. Zo kan bovendien hetzelfde principe van stent-inzet als bij mensen worden toegepast. Een ander voordeel van het gebruik van ratten is de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen, zoals apoE-/- ratten, die in de handel verkrijgbaar zijn.
We hebben onlangs deze methode gebruikt om te evalueren of apolipoproteïne E-deficiënte ratten meer vatbaar zijn voor het ontwikkelen van ISR in vergelijking met wilde ratten21. Van de in totaal 42 mannelijke ratten die stentimplantatie ondergingen, voltooiden 36 ratten het onderzoeksprotocol na 28 dagen (overlevingskans = 85,71%). Twee ratten stierven elk aan een defect aan de sluiting van de bloedvaten, een inwendige bloeding en stenttrombose. Stents van drie dieren konden niet worden geanalyseerd omdat het weefsel ernstig was beschadigd of verstoord als gevolg van verwerkingsfouten. Hoogstwaarschijnlijk gebeurde dit tijdens de zaagprocedure. We raden aan om deze techniek meerdere keren uit te voeren voor het begin van het onderzoek.
Bij de overige 33 ratten werden coronaire stents ter grootte van een mens met succes ingezet zonder tekenen van malappositie of letsel van het vat (tabel 1). Het lichaamsgewicht was vergelijkbaar bij wilde apoE+/+ en apoE-/- ratten (530,1 ± 15,94 g versus 513,6 ± 16,45 g). Homozygote apoE-/- ratten ontwikkelden duidelijk verhoogde neointimale hyperplasie en ISR in vergelijking met wildtype apoE+/+ ratten (Figuur 2). Hoewel een apoE-/- achtergrond dieren vatbaarder maakt voor atherosclerose, vooral wanneer ze een westers dieet krijgen, hebben we geen antecedente atherosclerotische plaques bij onze ratten waargenomen, waarschijnlijk omdat een westers dieet pas met een operatie werd gestart en de daaropvolgende observatieperiode van vier weken te kort was voor de ontwikkeling van atherosclerotische laesies.
Figuur 1: Schema van de stentimplantatie in de abdominale aorta van ratten met behulp van een trans-femurtoegang.
(a) Na onderbreking van de bloedstroom wordt een geleidingsdraad via een mediale arteriotomie ingebracht. (b) Een gekrompen en ballongemonteerde coronaire stent wordt over de geleidingsdraad in de femurslagader gebracht. c) De op ballonnen gemonteerde stent wordt naar de abdominale aorta beschoven, waar deze wordt ingezet door balloninflatie. De stent moet boven de bifurcatie en onder de nierslagaders worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Representatieve fotomicrografen van giemsa-bevlekte abdominale aorta op 28 dagen na stentimplantatie in westers-dieet-gevoed.
a) Wildtype apoE+/+ ratten en (b) Homozygote apoE-/- ratten. High power beelden: NI = neointima, St = stent strut, M = tunica media, L = lumen. Figuur is gereproduceerd met wijzigingen uit Cornelissen, A. et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| aantal ratten | |
| sluiting van het vaartuig mislukt | 2 |
| inwendige bloeding | 2 |
| stent trombose | 2 |
| weefselverwerkingsfout | 3 |
| succesvolle voltooiing van het protocol | 33 |
Tabel 1: Uitkomst van stentimplantatie in de abdominale aorta van ratten met behulp van een trans-femurtoegang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de implantatie van coronaire stents ter grootte van een mens in de abdominale aorta van apoE-/- ratten. Verschillende technische punten zijn de moeite waard om te benadrukken. Ten eerste moet een mismatch tussen de grootte van de stent en de grootte van de aorta worden vermeden. Het plaatsen van een te kleine stent kan leiden tot stent malappositie, terwijl implantatie van een stent die te groot is voor de aorta kan leiden tot overstrekken, scheuren en letsel van het vat. Daarom raden we aan om stents met een diameter tussen 2,0 en 2,5 mm te gebruiken en de implantatiedruk binnen het aanbevolen bereik te houden zonder de stent te overstrekken. De meest geschikte implantatiedruk wordt meestal gegeven door de fabrikant van de stent. Overmatig letsel van de femurader en vervolgens de vena cava moet worden vermeden omdat de vaatwanden extreem dun zijn en zeer gemakkelijk te verwonden, wat resulteert in bloedingen die moeilijk te stoppen zijn. De femurslagader is te onderscheiden van de femurader door pulsatie, die zorgvuldig moet worden waargenomen. Een andere valkuil is de mogelijkheid van arteriële letsel en dissectie bij het introduceren van de voerdraad en/of de ballonkatheter. Arteriële dissectie kan worden geminimaliseerd door de femurslagader distaal te controleren en uit te rekken met slings met behulp van zijden banden tijdens het introduceren van de ballonkatheter. Het is noodzakelijk om onmiddellijk te stoppen met het oprukken van het apparaat wanneer weerstand wordt ondervonden. In dit geval helpen kleine bewegingen tussen duim en wijsvinger de richting van het apparaat te veranderen. In onze ervaring is dit meestal het geval net onder het liesband en verder omhoog, wanneer de gemeenschappelijke iliacale slagader de bifurcatie nadert, omdat deze hier dieper in de retroperitoneale ruimte afdaalt. Er zal zeker een leercurve zijn voor de operator voordat de overlevingspercentages stabiel zijn en met enige ervaring is de gemiddelde chirurgische tijd ongeveer 20 minuten.
Bij mensen worden stents meestal geïmplanteerd in ernstig vernauwde atherosclerotische slagaders. Hoewel apoE-deficiëntie in het algemeen dieren vatbaarder maakt voor de ontwikkeling van atherosclerotische laesies, hebben we geen plaquevorming bij onze ratten waargenomen, waarschijnlijk omdat de westerse dieetvoeding pas werd gestart met stentimplantatie. Als stentimplantatie in atherosclerotische laesies gewenst is, moet het westerse dieet beginnen bij 6\u20128 weken na de geboorte en doorgaan tot het offer. Atherosclerotische laesies in gevoelige stammen zullen zich ontwikkelen na 7\u201214 weken op het vetrijke dieet22. Tot nu toe zijn er slechts beperkte gegevens over apoE-/- ratten gepubliceerd. Echter, geen studie gemeld spontane laesie ontwikkeling vóór de leeftijd van 20 weken23. Zhao et al. waargenomen typische atherosclerose bij apoE-/- ratten na ten minste 24 weken met een voortdurende toename van plaquelast en laesie ernst tot offer na 72 weken15. Volgens de literatuur is het dus onwaarschijnlijk dat ratten spontane atherosclerose zouden ontwikkelen op de leeftijd van 14-16 weken. Daarom raden we aan om oudere ratten te gebruiken en zo vroeg mogelijk met het westerse dieet te beginnen als stentimplantatie in voorgevormde atherosclerotische laesies gewenst is voor het onderzoek.
Zes dieren overleefden de operatie niet. Twee dieren stierven aan stenttrombose ondanks toediening van clopidogrel. Om stenttrombose te verminderen, kunnen dieren gedurende 48 uur worden voorbehandeld met aspirine of postoperatief een intraperitoneale injectie met enoxaparine krijgen. De introductie van clopidogrel een dag voor de operatie kan ook het risico op trombose verminderen, maar elke intensivering van de antitrombotische therapie verhoogt tegelijkertijd het risico op bloedingen. Stenttrombose is een veel voorkomende complicatie van PCI24,25,26 en kan verschillende redenen hebben. Mogelijk, in onze studie, stent trombose sterfgevallen als gevolg van onvoldoende ballon inflatie en gelijktijdige stent malappositie. In tegenstelling tot stentimplantatie bij mensen werd de inzet van stent in de abdominale aorta van de rat niet gecontroleerd door angiografie. Daarom kan ineffectieve balloninflatie niet worden gedetecteerd en gecorrigeerd tijdens de operatie. Evenzo kan stent-inzet leiden tot een onbedoelde occlusie van een vertakkend vat. Gezien het feit dat het niet haalbaar is om de operatie uit te voeren die het gebruik van een chirurgische microscoop onder fluoroscopische controle vereist, raden we aan de buik te openen om de precieze inzet van de stent te bevestigen, althans voor de eerste verschillende procedures. Andere mogelijke oorzaken voor stenttrombose kunnen ontstekingsreacties, ernstig letsel of dissecties van de vaatwand zijn. De chirurg moet op de hoogte zijn van klinische symptomen die wijzen op deze complicaties en de dieren moeten gedurende de observatieperiode elke dag worden geïnspecteerd.
De abdominale aorta van de rat heeft een diameter tussen 1,8 mm en 3,0 mm, afhankelijk van het gewicht van het dier27,28. Het oprukken van een omvangrijke stent door de nog kleinere femur- en iliacale slagaders kan intimale scheur en schade aan de vaatwand veroorzaken. Daarom is deze techniek beperkt tot het implanteren van kleinere stents (tussen 2,0 en 2,5 mm in diameter) om overstrekken of letsel van de vaatwand van de aorta te voorkomen.
Een andere beperking is de noodzaak van het ligeren van de femurslagader om hemostase na de procedure te bereiken, mogelijk met het risico op ischemie van de onderste ledematen. Eerdere studies toonden echter aan dat collaterale slagaders en aanpassingen van de microvasculatuur distaal aan de occlusie in staat zijn om de perfusie van de onderste ledematen te behouden na ligatie van de femurslagader bij ratten29, en geen van onze ratten vertoonde klinische tekenen van ischemie van de onderste ledematen tijdens de observatieperiode. Toch moeten de onderzoekers zich bewust zijn van dit potentiële risico, omdat ischemie van ledematen niet alleen een mogelijke oorzaak van postoperatieve dood vertegenwoordigt, maar ook mogelijk een systemische ontstekingsreactie kan veroorzaken, waardoor de resultaten mogelijk worden bevooroordeeld.
Hoewel ratten in het algemeen een kosteneffectief diermodel zijn, verhoogt het gebruik van genetisch gemodificeerde apoE-/- ratten de kosten. Een andere beperking is dat het relatief lang duurt voordat atherosclerotische plaques zich bij ratten hebben ontwikkeld. Verder zijn er enkele belangrijke hemodynamische verschillen tussen de aorta en de kransslagaders die meer aandacht verdienen. Schuifspanning is hoger in de aorta in vergelijking met de kransslagaders, en bifurcataties die turbulente bloedstroom veroorzaken, zijn afwezig. Dit vermindert de ontwikkeling van intimale hyperplasie en de mate van restenose.
Restenose is een van de belangrijkste factoren die het succes van coronaire stents op lange termijn beperken. Een verscheidenheid aan diermodellen zijn gebruikt om de pathofysiologie van restenose te bestuderen, elk met hun eigen voordelen en tekortkomingen. In vergelijking met andere diermodellen hebben ratten het voordeel van een hoge doorvoer, een gemak van hantering en huisvesting, reproduceerbaarheid en kosteneffectiviteit, terwijl ze tegelijkertijd de implantatie van coronaire stents van menselijke grootte mogelijk maken. Het eerste protocol van abdominale aorta stenting bij ratten werd gemeld door Langeveld et al.11. Dit model vereist echter een trans-abdominale toegang om de stent te introduceren, die wordt geassocieerd met een fysieke vernauwing van de aorta om een tijdelijke onderbreking van de bloedstroom te bereiken. De resulterende manipulatie en vaatletsel kunnen mogelijk ontstekingsreacties veroorzaken, wat niet alleen kan leiden tot complicaties, maar ook tot uitgesproken ISR12. Later wijzigden Oyamada et al. het protocol door de stent door de gemeenschappelijke iliacale slagader te introduceren12. Ze vergeleken de overlevingskans tussen de twee verschillende benaderingen (trans-aorta versus trans-iliacale slagader) en vonden een significant hoger sterftecijfer bij dieren met trans-abdominale stents (57% versus 11%, p < 0,05). Ratten stierven meestal aan trombose op de incisie / hechtplaats, wat catastrofaal is wanneer ze optreden in de abdominale aorta12. Om trauma verder te verminderen en de implantatietechniek bij mensen beter na te bootsen, gebruikten we een trans-femurtoegang om de stent te introduceren en rapporteerden we een sterftecijfer van 14%. Twee ratten stierven elk aan een defect aan de sluiting van de bloedvaten, een inwendige bloeding en stenttrombose. Recentere studies meldden echter sterftecijfers van slechts 6% na stentimplantatie in de abdominale aorta van ratten, zelfs met de trans-aortatoegang30,31. Toch was het gecombineerde morbiditeits- en sterftecijfer 13,4%, in een studie van Nevzati et al. na implantatie van magnesiumstents in de rataorta30. Hoewel noch vaatsluitingsfalen noch interne bloedingen in hun reeks werden gemeld, was stenttrombose duidelijk bij 10,5% van de ratten30. Aan de andere kant rapporteerden Aquarius et al. geen stenttrombose na de behandeling van zijwandaneurysma's met stroomomleidingen, maar deze studie gebruikte dunnere stent strut-apparaten en dubbele antiplatelettherapie werd toegediend aan de ratten31. We probeerden een evenwicht te vinden tussen het risico op stenttrombose en bloedingsrisico en toegediende clopidogrel en heparine in onze studie. Hoewel dit het risico op stenttrombose, die bij 4,76% van de ratten voorkwam, had kunnen verminderen, kan dit ook de reden zijn geweest voor het relatief hogere risico op bloedingen (9,52% van de ratten), hetzij vanwege interne bloedingen of falende vaatsluiting.
Hier hebben we de implantatie van een medicijn-eluting stent in de rat abdominale aorta gedemonstreerd, maar ook deze methode kan worden gebruikt voor de evaluatie van andere, vergelijkbare stentapparaten, bijvoorbeeld kale metalen stents of bioresorbeerbare vasculaire steigers.
Kortom, abdominale aorta stenting van apolipoproteïne E-deficiënte ratten is een betrouwbaar en reproduceerbaar model om ISR na stentimplantatie te onderzoeken. Het model kan worden uitgebreid tot het gebruik van oudere ratten, die meer kans hebben om spontaan atherosclerotische laesies te ontwikkelen, en door andere apparaten te testen die worden gebruikt voor menselijke coronaire interventie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We willen mevrouw Angela Freund bedanken voor haar onschatbare technische hulp bij het inbedden en produceren van dia's. We willen ook de heer Tadeusz Stopinski van het Institute for Laboratory Animal Science &experimental Surgery bedanken voor zijn inzichtelijke hulp bij het veterinaire werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
References
- Patel, M. R., et al. ACC/AATS/AHA/ASE/ASNC/SCAI/SCCT/STS 2017 Appropriate Use Criteria for Coronary Revascularization in Patients With Stable Ischemic Heart Disease: A Report of the American College of Cardiology Appropriate Use Criteria Task Force, American Association for Thoracic Surgery, American Heart Association, American Society of Echocardiography, American Society of Nuclear Cardiology, Society for Cardiovasular Angiography and Interventions, Society of Cardiovascular Computed Tomography, and Society of Thoracic Surgeons. Journal of the American College of Cardiology. 69 (17), 2212-2241 (2017).
- Virmani, R., Farb, A.
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal of Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- Perkins, L. E. Preclinical models of restenosis and their application in the evaluation of drug-eluting stent systems. Veterinary Pathology. 47 (1), 58-76 (2010).
- Kim, W. H., et al. Histopathologic analysis of in-stent neointimal regression in a porcine coronary model. Coronary Artery Disease. 11 (3), 273-277 (2000).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Breslow, J. L. Transgenic mouse models of lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8314-8318 (1993).
- Knowles, J. W., Maeda, N.
- Wheeler, J. B., Mukherjee, R., Stroud, R. E., Jones, J. A., Ikonomidis, J. S. Relation of murine thoracic aortic structural and cellular changes with aging to passive and active mechanical properties. Journal of the American Heart Association. 4 (3), 001744 (2015).
- Rodriguez-Menocal, L., et al. A novel mouse model of in-stent restenosis. Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).
- Langeveld, B., et al. Rat abdominal aorta stenting: a new and reliable small animal model for in-stent restenosis. Journal of Vascular Research. 41 (5), 377-386 (2004).
- Oyamada, S., et al. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. Journal of Surgical Research. 166 (1), 9 (2011).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Wei, S., et al. Apolipoprotein E-deficient rats develop atherosclerotic plaques in partially ligated carotid arteries. Atherosclerosis. 243 (2), 589-592 (2015).
- Zhao, Y., et al. Hyperlipidemia induces typical atherosclerosis development in Ldlr and Apoe deficient rats. Atherosclerosis. 271, 26-35 (2018).
- Ekuni, D., et al. Occlusal disharmony accelerates the initiation of atherosclerosis in apoE knockout rats. Lipids in Health and Disease. 13 (144), 13 (2014).
- Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Scientific Reports. 9 (1), 39950 (2019).
- Malik, N., et al. Intravascular stents: a new technique for tissue processing for histology, immunohistochemistry, and transmission electron microscopy. Heart. 80 (5), 509-516 (1998).
- Kumar, A. H., McCauley, S. D., Hynes, B. G., O'Dea, J., Caplice, N. M. Improved protocol for processing stented porcine coronary arteries for immunostaining. Journal of Molecular Histology. 42 (2), 187-193 (2011).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), 18 (2004).
- Cornelissen, A., et al. Apolipoprotein E deficient rats generated via zinc-finger nucleases exhibit pronounced in-stent restenosis. Scientific Reports. 9 (1), 54541 (2019).
- Ritskes-Hoitinga, M. G. T., Jensen, T. L., Mikkelsen, L. F. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Elsevier Academic Press. Chapter 4.3 567-599 (2012).
- Rune, I., et al. Long-term Western diet fed apolipoprotein E-deficient rats exhibit only modest early atherosclerotic characteristics. Scientific Reports. 8 (1), 23835 (2018).
- Daemen, J., et al. Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxel-eluting stents in routine clinical practice: data from a large two-institutional cohort study. Lancet. 369 (9562), 667-678 (2007).
- Cornelissen, A., Vogt, F. J. The effects of stenting on coronary endothelium from a molecular biological view: Time for improvement. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (1), 39-46 (2019).
- Mori, H., et al. Pathological mechanisms of left main stent failure. International Journal of Cardiology. 263, 9-16 (2018).
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circulation Research. 25 (6), 677-686 (1969).
- Lowe, H. C., James, B., Khachigian, L. M. A novel model of in-stent restenosis: rat aortic stenting. Heart. 91 (3), 393-395 (2005).
- Unthank, J. L., Nixon, J. C., Lash, J. M. Early adaptations in collateral and microvascular resistances after ligation of the rat femoral artery. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 73-82 (1985).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique. Journal of Visualized Experiments. (128), e56359 (2017).
- Aquarius, R., Smits, D., Gounis, M. J., Leenders, W. P. J., de Vries, J. Flow diverter implantation in a rat model of sidewall aneurysm: a feasibility study. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (1), 88-92 (2018).
