Summary
该协议描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于神经-胶质-血管结构、相互作用和功能在健康和患病条件下的纵向成像。它是颅内成像方法的补充替代品，虽然通常倾向于，但具有一些关键限制。
Abstract
中枢神经系统（CNS）由神经元、胶质细胞、频闪细胞和血管细胞的复杂相互作用调节，促进其正常功能。虽然在体外或体外一起单独研究这些细胞提供了有用的生理信息;在这样的语境中，神经细胞生理学的显著特征将会被遗漏。因此，有必要研究神经细胞在原生体内环境。此处详述的协议描述了啮齿动物皮层中神经细胞的重复体内双光子成像，作为在从数小时到数月的较长时间段内可视化和研究特定细胞的工具。我们详细描述使用严重稳定的脑血管作为粗糙的地图或荧光标记的树突作为特定大脑区域感兴趣的精细地图。使用这些映射作为视觉键，我们展示神经细胞如何精确重新定位，以便随后进行重复的体内成像。使用荧光标记微胶质、神经元和NG2+ 细胞的体内成像示例，该协议演示了该技术在较长时间段内允许在同一大脑位置重复可视化细胞动力学的能力，这进一步有助于理解这些细胞在正常生理学或病理侮辱中的结构和功能反应。必要时，此方法可与神经细胞的功能成像相结合，例如，与钙成像相结合。当基因小鼠模型或具有不同荧光标签的特定染料可用于标记感兴趣的细胞时，这种方法尤其具有一种强大的技术，用于可视化体内不同细胞类型中 CNS 的物理相互作用。
Introduction
中枢神经系统（CNS）受各种居民细胞类型（包括神经元、胶质细胞和血管相关细胞）之间相互作用的复杂相互作用的支配。传统上，神经细胞研究在分离，共培养1,21，2，3，4，5（体外）或切除脑组织（体外,3,4,5）6，7，8，9，10个上下文。6,7,8,9,10然而，需要进一步了解神经细胞行为和相互作用在原生环境中的完整的大脑体内。在此协议中，我们描述了一种在体内绘制感兴趣区域并在未来成像会话中精确重新成像这些区域的方法，以跟踪各种 CNS 细胞类型之间长时间的复杂相互作用。
体内成像方法的发展为正确理解神经,功能,11、12、13、14、15,1213,14提供了显著收益。具体来说，与传统的体外和体外方法相比，这些方法具有若干优势。首先，体内成像系统具有生理相关的细胞和组织成分，如血管与细胞相互作用的完整剧目，以提供神经网络生理学的全面了解。其次，最近的发现表明，当从原生环境中去除时，某些神经细胞（如微胶质）会失去其特性的重要特征，因此生理特性16，17,17可以保留在体内环境中。第三，体内成像系统为数周至数月的稳定纵向调查提供了研究CNS细胞相互作用的机会。最后，鉴于越来越多的证据表明来自周围免疫系统18、19和19中枢神经系统生理学中的微生物群20、21,21的贡献，体内系统提供了一个平台来询问这些贡献和对CNS细胞的影响。因此，使用纵向体内成像来研究健康、受伤和患病状态的神经免疫生理学和相互作用的方法是传统方法的一大补充。
在这个协议中，我们描述了一种可靠的方法，以图像大脑中不同的细胞类型，包括微胶质，神经元和NG2+细胞为例。开发了两种在体内可视化神经细胞的方法：瘦头骨方法和颅窗法的开放头骨。虽然瘦身的头骨方法正在使用，是首选，因为他们克服了开放性头骨方法的一些缺点，如胶质细胞活化，高于生理的脊椎动力学和使用抗炎剂22，23，24，25，瘦化头骨方法也显示了一些关键缺点。22,23,24,25首先，变薄过程是一个非常微妙的程序，许多研究人员发现很难完善，尤其是当重新变薄是必要的。这种情况之所以如此，是因为实验者往往很难确定他们把头骨稀释到±20μm的深度。其次，为了在小鼠之间进行适当的比较，变薄需要是相同的，成像会话或小鼠之间的各种变薄成功可能会使神经结构的可视化复杂化。第三，当用于纵向成像时，头骨变薄的动物只能在头骨重新变薄时用于数量有限的会话。第四，由于一些骨组织仍然存在，成像深度的清晰度可能会从薄的头骨方法中受损，从而能够对更肤浅但更深的区域进行出色的可视化。有鉴于此，更深的大脑结构，如海马，不能成功地用薄头骨的方法成像。这些考虑提出了需要采取替代和补充办法，以克服这些关切。
除了薄头骨方法外，开放的头骨窗口植入方法使用用光学透明玻璃盖玻片替换头骨的程序。这允许几乎无限数量的成像会话。此外，鉴于用玻璃盖玻片替换头骨，这种方法允许在数小时到数月的长时间内对荧光标记脑细胞进行清晰的观察，因此，可用于研究与生理学、衰老和病理学相关的细胞活动和相互作用。
总的来说，我们详细介绍了通过立体轴颅切除术植入慢性颅骨窗口的步骤，这种颅骨切除术使感兴趣的大脑区域在体内成像。我们还描述了如何利用严重稳定的脑血管或荧光标记的树突分别生成感兴趣的大脑区域的粗糙或精细图。然后，此方法可用于多个会话的重复映像。因此，这种技术的重要性在于它能够成像大脑元素的长期变化或停滞，包括不同细胞类型的排列、形态和相互作用。
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Protocol
所有步骤都符合弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会制定和批准的准则。
1. 小鼠为颅窗植入做准备
注：各种带荧光标签的转基因小鼠线适合成像。
- 使用 CX3CR1GFP/+小鼠26在体内可视化微胶质。通常，使用体重为17-25克的幼鼠至4至10周大小鼠。
注：虽然这种方法甚至适合预奶小鼠，但需要让小鼠与母亲一起回到笼子里喂养，如果母亲在手术后对幼崽没有适当照顾，可能会使恢复变得复杂。因此，建议使用奶后奶。 - 在麻醉室中使用异氟兰化（5% 氧气流量，诱导 1 分钟）麻醉小鼠。检查鼠标是否对头趾和/或尾部捏合没有任何移动或抽搐反应。将鼠标从室内拿出，在露天使用修剪器彻底剃光耳朵之间耳朵之间的头部头发，从眼睛水平到颈部顶部。
注：所用异氟的浓度取决于感应室的大小。因此，对于较小的腔室，3-4%的异氟兰可用于有效诱导麻醉，而较大的腔室将需要高达5%。 - 将鼠标移到立体定向手术站鼻锥进行麻醉（手术维护为1.5-2%），使用耳杆稳定头部，并在加热垫上保持鼠标保持体温温暖。
- 用眼软膏润滑两只眼睛。注射100 μL的0.25%的布皮维卡因（为小鼠提供局部镇痛，将持续8-12小时）和100μL的4毫克/mL德沙米松（以减少手术过程中可能导致的炎症）在切口部位皮下。在移动到下一步之前，让鼠标至少坐 5 分钟。
- 用三个交替的贝塔丁拭子和 70% 的酒精清洁剃光头。使用手术刀片或剪刀从耳朵之间的头骨区域后面延伸到眼睛之间的前部区域，进行中线头皮切口。剩下的皮肤被切割，以暴露头骨。
- 用3%过氧化氢（H 2 O2）清洁头皮和下颅之间的结缔组织2，并定位大脑区域，用立体定向坐标进行成像。
注：头骨表面的切口经常有一些出血（步骤1.5）。这种出血通常在3-5分钟内自行解决。先前的布普瓦卡因治疗（步骤1.4）也注意到，以限制在此期间的出血量。
2. 小鼠颅窗植入手术
- 使用牙科钻头（0.7 mm 尖端直径）将圆形开口 ±4 mm 钻入头骨中，并使用尖钳小心地取出头骨的这一部分。对于6-8周大小鼠的躯体感觉皮层成像，将颅骨切除术中心定位为-2.5后侧和+2.0侧向胸腺。在钻探过程中，定期用无菌盐水和棉签润湿头骨，以冷却大脑，清除骨骼碎片并软化头骨，最终去除头骨。
注：颅骨切除术的坐标会因感兴趣区域和小鼠的年龄而异。 - 取出头骨后，小心地将小盖玻璃（尺寸#0厚度为 0.1 ± 0.02 mm）在颅骨切除术中用盐水润湿。使用无菌抹布擦干多余的盐水。
- 使用尖施器（如移液器尖端或破木棉签棒的尖端），在窗户周围涂抹氰酸酯胶水，并允许其附着在大脑和头骨上。将底胶涂抹在头骨的其余部分上，用固化灯固化20-40 s。用最后的胶水在窗户周围准备一个井，用固化灯固化20-40 s。
- 将一个小头板粘在颅骨切除术的反向半球的头骨上，首先用底面胶水作为底面，然后用最后一块胶水。用固化灯固化，每个固化灯为 20-40 s。
注：如果头骨在此过程期间完全被胶水覆盖，不需要缝合。
3. 手术后护理
- 允许鼠标在没有麻醉的情况下醒来（在加热垫上完成恢复可缩短恢复时间），并在完全清醒后将其返回到其家庭笼中。注射一种皮下剂量的丁丙诺啡SR（0.5毫克/千克）作为术后镇痛，足以72小时。
- 为了促进手术的健康恢复，为小鼠提供额外的软食物，可以在水中以常规固体周的形式软化咀嚼或凝胶形式的食物。
注：手术后立即提供一次软食物就足够了。 - 每天监测小鼠的健康和适当的恢复，在手术前72小时。之后，从窗口植入手术开始，从2周开始进行成像。
注：如果做得好，小鼠恢复良好，表现出正常的流动行为，足够的笼探索，良好的水化，稳定的体重增加和广泛互动与其他小鼠在笼子里和在笼子里的其他项目。手术后显示嗜睡、脱水和超过10%体重减轻的小鼠被安乐死，并从研究中去除。
4. 初始成像的双光子脑图
- 麻醉鼠标（异氟兰、5 % 感应和 1.5% 维护）。使用螺钉将头板安装在双光子显微镜舞台上，在 35°C 的加热板上保持。注射100μL的血管染料，如罗丹胺B（2毫克/mL）。
注：成像也可以在清醒的小鼠中进行，无需麻醉。然而，最近的研究表明，麻醉影响微胶质监测动力学27，28，29,28和29头部固定两个光子成像在清醒小鼠增加压力，即使在慢性成像至少25天（见Juczewski等人，2020年）30。 - 使用用 70% 乙醇涂抹的棉签轻轻清洁颅窗表面。将几滴水或盐水放在颅窗上，将客观透镜放入溶液中，因为目标是浸入式透镜。
- 手拉粗糙的地图，以表示实验室笔记本中的主要血管地标，同时通过墓志铭浏览目镜。使用此图形可以标识两次光子成像期间的特定区域。或者，通过安装在显微镜上的相机或手持相机或手机拍摄血管的照片。
注：这些手绘图像和图片是为了便于在两次光子成像之前在显微镜下重新访问相同的广泛区域。这些不是精确的图像映射。 - 在两次光子成像下，根据需要收集荧光细胞和血管的图像。用适当的坐标仔细记录，以确保可以重新访问精确区域，以便进行后续成像。在此初始成像会话中收集多个视场，例如，通过组织体积每 1-2 μm 获取 z-stack 图像。
注：通过两个光子收集图像时，血管地标用于粗略映射。如果需要精细映射，则使用 Thy1-YFP31小鼠的 YFP 标记树突。- 使用这些推荐的成像参数：波长为880-900 nm是最佳的;用于 GFP 和/或 dsRed / Rhodamine 激发，使用 565 nm 双色镜，带 525/50 nm（绿色通道）和 620/60 nm（红色通道）排放过滤器;对于 GFP 和 YFP 分离，使用 509 nm 双色镜，带 500/15 和 537/26 nm 发射滤波器;大脑的功率保持在25mW或以下;图像分辨率为 1024 x 1024 像素，在 1.5 倍变焦系数下以 25X 0.9 NA 目标拍摄的视场为 295.24 x 295.24 μm。
- 在成像结束时，将鼠标从舞台上带走，让其从麻醉中醒来，然后回到其家庭笼子，直到将来进行成像。
5. 双光子成像和再成像
- 对于以后的后续成像会议，可能是在初始成像会议后几个小时到几个月的任何地方，麻醉小鼠（Isoflurane，5%诱导和1.5%的维护），安装在双光子显微镜上，保持加热板，并重新注入100μl血管染料，如罗达明B（2毫克/mL）。
- 打开 ImageJ 中以前获得的图像，并使用这些图像以及上一个会话中的注释，识别以前的图像区域并仔细重新成像它们。
- 只要成像窗口清晰或对研究范围至关重要，就重复此数据。
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Representative Results
为了在体内可视化微胶质动力学，使用了双转基因CX3CR1GFP/+：Thy1YFP小鼠。Thy1-YFP H 线与 Thy1-GFP M 线相比，以避免微胶质 （GFP） 和神经元 （YFP） 的荧光重叠。替代方法可以使用记者行，其中微胶质标记为 tdTomato，然后可以使用 Thy1-GFP M 线。H 线的缺点是 YFP 标记大量神经元，并且标签随着年龄的增长而增加（个人观察）。M 线显示神经元的稀疏标记。在窗口植入手术的2~4周之间，微胶质动力学可以随后重复成像。大型血管用于本地化特定区域，然后使用 YFP 标记的树突用于大脑区域的精细映射。使用这种方法，特定的树突可以用作大脑区域精细映射的稳定地标（图1，图1b中的箭头）。虽然树突是稳定的，但一些微胶质每天移动（图1c）。
此外，这种方法对于长期每周纵向成像来说已经足够了。因此，单转基因CX3CR1GFP/+ 小鼠用于跟随微胶质与罗达明B的内皮内注射，在每个成像会话中标记血管长达8周（图2）。或者，如上所述，Thy1 小鼠可用于纵向精细映射。执行每周成像时，血管被记录为稳定固定，但微胶质可以被视为动态的，如图2中的三个特定感兴趣区域（ROI、虚线圆圈）所示。在最高 ROI 中，微胶质开始在成像的第4周进入 ROI，并一继续到成像的第 8周。在具有分体血管的中间 ROI 中，在第3周下血管周围出现微胶质细胞，在第6周丢失，在第7周在上血管上出现另一个微胶质，并维持到第 8周。最后，在底部ROI中，微胶质细胞在第6周保持，并在第7周和8周的成像中丢失。这些结果表明，在数周到数月的微胶定位网络中，动态变化。
这种方法还可用于研究急性损伤后或病理疾病进展期间的细胞动力学。单转基因CX3CR1GFP/+ 小鼠用于跟随微胶质与罗达明B的内皮内注射，以标记血管之前（数据未显示）和后严重癫痫发作诱导的凯尼酸（图3）。癫痫发作后，血管床结构保持无过度扰动（图3a）。然而，微胶质细胞网络和位置景观是瞬态改变（一些细胞是"获得"，其他是"丢失"在视野中），更大的变化在24-48小时癫痫发作内，恢复到正常72小时（图3b），因为我们先前报告32。
最后，此方法还可用于研究细胞-细胞相互作用或比较神经细胞类型之间的动力学。双转基因CX3CR1GFP/+：NG2dsRed/+小鼠用于跟踪体内微胶质和NG2+细胞。在不标记血管的情况下，可以识别微胶质和NG2细胞（图4a）。NG2是一种蛋白细胞，它同时标记与血管相关的心向和脂肪细胞前体前体细胞（OPCs）33，34。33,34佩里西特人通常沿着血管壁有拉长的过程（在图4a中假定用箭头识别），而OPCs通常显示更大的细胞体，这些细胞体位于远离血管的脑膜瘤中（假设用图4a中的箭头识别）。为了充分区分心向和OPCs，血管标有罗达明B。NG2+- 容器相关细胞（围热细胞、箭头）的荧光度更亮，尽管两个光子成像具有类似的激发作用，但可与发光罗达明的微弱荧光度区分开来（图4 b，c）。每日成像显示，百色是稳定定位的，而OPCs（图4b中的星号）和微胶（图4b中的圆圈）是动态的，与之前的报告32、35、36,35,。
图1：在双转基因CX3CR1GFP/+：Thy1YFP小鼠中，使用神经元树突的精细映射对微胶质进行每日成像。（a） 双转基因 CX3CR1GFP/+：Thy1YFP 鼠标中微胶（绿色）和树突（红色）的代表性双光子图像。（b-c）， 盒装区域（a） 中的每日图像，显示重复成像的树突（b 中的箭头）和带微胶（c）的树突。虽然树突结构位置稳定，但注意到在随后的几天内，一些微胶质从原来的位置转位。这些细胞被识别为数字（1、2或3）。前一天，他们的位置被用白色星号注意到，在随后的一天，他们的位置被注意到一个黄色星号。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：CX3CR1GFP/+小鼠中微胶质的长期每周成像数月。（a-h），在重复成像过程中，使用具有急性标记的血管（红色、罗达胺、2毫克/mL，即p.）作为粗糙地标，用于跟踪微胶网络长达 8 周的重复成像期间，来自 CX3CR1GFP/+小鼠的微胶质（绿色）代表双光子图像。在成像期间，血管结构稳定。加显了三个带血管的小区域（虚线圆），以指示微胶质索马塔进入（前两个虚线圆）或从（底部圆）这些区域的运动。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在CX3CR1 GFP/+ 小鼠癫痫发作后进行长期日成像。（a-b）， 代表双光子图像在日常成像的特定大脑区域与微胶（绿色）和急性标记的血管（红色，罗达胺，2毫克/mL，即.p.）的特定大脑区域的相同视野。成像开始后，诱导严重癫痫发作使用化疗惊厥剂，凯尼奇酸。血管结构保持为单独的血管段（箭头）可以通过时间（a） 进行识别。然而，在癫痫发作后头两天，微胶网络动态增加，第三天恢复正常水平（b）。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：CX3CR1 GFP/+：NG2 dsRed/+ 小鼠中微胶质和NG2+细胞的每日成像。+ GFP/+（a） 体内微胶质（绿色）和NG2+细胞（红色）的代表性双光子图像。未标记的血管不能区分NG2细胞（与箭头假定的认同）和NG2细胞与血管（利戈登细胞前体前体细胞或OPCs，假定与箭头识别）。（b） 连续几天用标有罗达明的血管进行成像，代表微胶质（绿色）和NG2+细胞（红色）的两光子图像。百色（箭头）是静止的，而OPC是动态的（白色到黄色星号）。微胶也是动态的（圆：虚线圆表示不带微胶的位置，填充圆表示具有相应微胶位的位置）。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
体内双光子成像的出现为探索健康大脑中过多的细胞相互作用和动态提供了机会。初步研究的重点是使用开放颅骨切除术的方法，通过急性和慢性成像37，38图像神经元树突图像。这也可以用来阐明大脑中的神经免疫相互作用。该协议描述了一种短期或长期对荧光标记细胞（特别是微胶质，大脑的常驻免疫细胞）进行可靠成像的方法。使用染料标记的血管和/或荧光标记的树突详细用于对感兴趣的大脑区域进行粗糙或精细的映射，以便对细胞进行重复、可靠的成像。虽然Thy1YFP线被建议用于精细的大脑映射，替代方法可以使用其他技术或小鼠线标记选择神经元群体，如在子宫电穿孔39，40，,40产后早AV注射41或使用陷阱小鼠42。此外，虽然皮质成像是本次讨论的焦点，但这种方法可以适应于长期和43年，以可视化深层大脑结构。
对于此方案，每只小鼠的手术程序可以在麻醉开始到麻醉恢复的30-60分钟内完成。在手术过程中，头骨被小心地切除，并更换为无菌盖玻璃，在至少两周后植入进行长期成像。死亡率极为罕见（低于5%）在野生型小鼠中，虽然有凝血问题的小鼠，如P2Y12R敲除小鼠，显示更高的死亡率和手术失败。在这类小鼠中，出血可能会持续较长时间，小鼠可能在颅骨切除术前48小时内死亡，大概是由于内出血并发症。从该协议植入窗口的小鼠尚未注意到有任何感染迹象，该协议可以可靠地用于为50-80%的小鼠生成清晰的窗口，用于长期成像。
除了目前的慢性窗口植入方法，薄头骨方法的存在，以可视化脑细胞在完整的大脑反复。几项研究已经突出了价值，甚至优先选择薄头骨方法比窗口植入方法22，23，24，25。22,23,24,25这种方法的承诺不应被忽视，因为如果处理得当，它抵消了目前方法的一些突出限制或缺点，包括缺乏活化胶质细胞，脊柱的周转率低，更具有生理学性，以及缺乏使用抗炎剂，这也可能影响大脑生理。在选择特定研究问题的方法时，在选择本协议中详细的方法之前，应考虑这些严重的限制。
然而，这种方法的吸引力是四倍。首先，颅窗植入方法具有吸引力，因为相对于薄颅骨程序，该程序易于掌握。适当的头骨变薄不能总是由实验者掌握，如果做得不好可能会导致胶质激活限制其吸引力。其次，这种颅窗植入方法为大脑结构提供了强大的深度清晰度，因为大脑是通过光学清晰的窗口成像的。可用于成像的窗口通常也比薄头骨方法中使用的窗口大得多，允许访问更大的组织体积进行分析。第三，与深度清晰度一样，这种方法允许通过窗口实现均匀的清晰度，因为玻璃盖玻片是均匀的薄和清晰的。这有助于会话之间和动物之间的比较。薄头骨技术需要特殊的专业知识，以确保在反复会话期间和动物之间窗窗均匀清晰。最后，这种方法在成像频率上提供了极大的灵活性，从数小时到数天到数周甚至数年。对于薄头骨的方法，最多五次重复已被建议24。
这种方法的未来应用很多。首先，应用可能涉及在正常生理学和病理学中阐明大脑中新的神经-胶质-血管相互作用。其次，虽然本程序讨论了留用细胞，但这种方法可用于研究渗透免疫细胞的动态和相互作用，例如，在急性损伤、慢性脑感染和/或神经退行性疾病期间，只要有相应荧光标记细胞的小鼠可用。最后，在脑细胞结构研究的背景下讨论了这种方法。然而，随着功能成像的出现，例如使用钙44、45、46,45,46或电压成像技术47、48，这种方法可用于功能成像在健康和疾病中随着时间的推移。47,48
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Eyo 实验室的成员讨论本手稿中提出的想法。我们感谢弗吉尼亚大学基普尼斯实验室的贾斯汀·鲁斯滕霍芬博士为NG2DSRed小鼠33的礼物。这项工作得到了国家卫生研究所神经疾病和中风研究所的资助，为U.B.E（K22 NS104392）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
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