Summary
Detta protokoll beskriver en kronisk hjärnskålen fönster implantation teknik som kan användas för longitudinell avbildning av neuro-glio-vaskulära strukturer, interaktioner och funktion i både friska och sjuka villkor. Det fungerar som ett komplement till den transkraniella bildbehandling strategi som, även om det ofta föredras, besitter vissa kritiska begränsningar.
Abstract
Det centrala nervsystemet (CNS) regleras av ett komplext samspel mellan neuronala, glia, stromala och vaskulära celler som underlättar dess korrekta funktion. Även om studera dessa celler i isolering in vitro eller tillsammans ex vivo ger användbar fysiologisk information; framträdande funktioner i neural cellfysiologi kommer att saknas i sådana sammanhang. Därför finns det ett behov av att studera neurala celler i deras inhemska in vivo-miljö. Protokollet beskrivs här beskriver repetitiva in vivo två foton imaging av neurala celler i gnagare cortex som ett verktyg för att visualisera och studera specifika celler under längre tidsperioder från timmar till månader. Vi beskriver i detalj användningen av den grovt stabila hjärnan vasculature som en grov karta eller fluorescerande märkta dendriter som en fin karta över utvalda hjärnan regioner av intresse. Med hjälp av dessa kartor som en visuell nyckel visar vi hur neurala celler kan flyttas exakt för efterföljande repetitiva in vivo imaging. Med hjälp av exempel på in vivo imaging av fluorescerande märkta mikroglia, nervceller och NG2+ celler, detta protokoll visar förmågan hos denna teknik för att möjliggöra repetitiva visualisering av cellulära dynamik i samma hjärnan plats under längre tidsperioder, som ytterligare kan bidra till att förstå de strukturella och funktionella svar av dessa celler i normal fysiologi eller följande patologiska förolämpningar. Vid behov kan detta tillvägagångssätt kopplas till funktionell avbildning av neurala celler, t.ex. Detta tillvägagångssätt är särskilt en kraftfull teknik för att visualisera den fysiska interaktionen mellan olika celltyper av CNS in vivo när genetiska musmodeller eller specifika färgämnen med distinkta fluorescerande taggar för att märka de celler av intresse finns tillgängliga.
Introduction
Det centrala nervsystemet (CNS) styrs av ett komplext samspel mellan olika inhemska celltyper inklusive nervceller, glia och kärl-associerade celler. Traditionellt studerades neurala celler i isolerade, co-odlade1,2,,3,,4,5 (in vitro) eller strukits hjärnvävnad (ex vivo)6,7,8,9,10 sammanhang. Emellertid, Det finns behov av att ytterligare förstå neurala cellen beteende och interaktioner i den inhemska miljön i den intakta hjärnan in vivo. I det här protokollet beskriver vi en metod för att kartlägga in vivo-regioner av intresse och exakt återskapa dessa regioner i framtida bildsessioner för att spåra de komplexa interaktionerna mellan de olika CNS-celltyperna under längre tidsperioder.
Utvecklingen av in vivo imaging metoder har gett betydande vinster för korrekt förståelse av neural funktion11,12,13,14,15. Närmare bestämt ger dessa metoder flera fördelar jämfört med traditionella in vitro- och ex vivo-metoder. För det första har in vivo bildsystem fysiologiskt relevanta cell- och vävnadskomponenter såsom vaskulaturen med hela repertoaren av cellulära interaktioner för att ge en fullständig förståelse av neurala nätverksfysiologi. För det andra, nya rön tyder på att när de tas bort från sin inhemska miljö, vissa neurala celler (såsom microglia) förlorar viktiga funktioner i sin identitet och därmedfysiologi 16,17 som kan bevaras i in vivo inställningen. För det tredje, in vivo bildsystem ger möjlighet till stabila longitudinella undersökningar av veckor till månader för att studera CNS cellulära interaktioner. Med tanke på de ökande bevisen för bidrag från det perifera immunsystemet18,,19 och mikrobiomet20,,21 i CNS fysiologi, ger in vivo-system en plattform för att förhöra sådana bidrag och effekter på CNS-celler. Således, metoder som använder längsgående in vivo imaging att studera neuro-immun fysiologi och interaktioner i friska, skadade och sjuka tillstånd är ett bra komplement till traditionella metoder.
I detta protokoll beskriver vi en tillförlitlig metod för bild olika celltyper i hjärnan inklusive mikroglia, nervceller och NG2+ celler som exempel. Två metoder för att visualisera neurala celler in vivo har utvecklats: den tunnade skallen strategi och den öppna skallen med en kranial fönster strategi. Även tunnas skalle metoder används och är att föredra eftersom de övervinna några av nackdelarna med den öppna skallen strategi såsom glia cell aktivering, högre än fysiologiska ryggraden dynamik och användning av antiinflammatoriska medel22,23 ,24,,25, tunnas skalle metoder visar också några kritiska nackdelar.24 För det första är gallringsproceduren ett mycket känsligt förfarande som många forskare har svårt att fullända, särskilt när det är nödvändigt att gallring. Detta beror på att det ofta är svårt för försöksmän att konstatera att de har tunnat skallen till ett ~ 20 μm djup. För det andra, för adekvata jämförelser mellan möss, gallring skulle behöva vara identiska och en mängd gallring framgång mellan imaging sessioner eller möss kan komplicera visualisering av neurala strukturer. För det tredje, när de används för longitudinell avbildning, kan djur med tunna skallar endast användas för ett begränsat antal sessioner när återförtunnande av skallen används. Forth, eftersom en del av benvävnaden fortfarande kvarstår, klarhet på djupet av bildframställning kan äventyras från den tunnade skallen strategi möjliggör stor visualisering av mer ytliga men inte så mycket med djupare regioner. Mot bakgrund av detta kan djupare hjärnstrukturer som hippocampus inte framgångsrikt avbildas med den tunnade skallen. Dessa överväganden ger upphov till behovet av alternativa och kompletterande tillvägagångssätt som skulle kunna övervinna dessa farhågor.
Alternativ till den tunnade skallen strategi, den öppna skallen fönster implantation tillvägagångssätt använder ett förfarande där skallen ersätts med ett optiskt klart glas täcket. Detta möjliggör ett nästan obegränsat antal bildsessioner. Dessutom, med tanke på byte av skallen med glas täcket, denna metod möjliggör en tydlig visning fönster fluorescerande taggade hjärnceller under långa perioder från timmar till månader och därför kan användas för att studera cellaktivitet och interaktioner som är relevanta för fysiologi, åldrande och patologi.
Sammantaget detalj vi steg som kan följas för att göra implantat kronisk kranial fönster genom en stereotaxic craniotomy som möjliggör in vivo imaging av hjärnan regioner av intresse. Vi beskriver också hur den grovt stabila hjärnan vasculature eller fluorescerande märkta dendriter kan användas för att generera en grov eller en fin karta, respektive av hjärnan regioner av intresse. Den här metoden kan sedan användas för upprepad avbildning under flera sessioner. Vikten av denna teknik ligger därför i dess förmåga att avbilda de långsiktiga förändringarna eller stasis i hjärnans element inklusive arrangemang, morfologi, och interaktioner av de olika cellulära typer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla steg är i enlighet med de riktlinjer som fastställts och godkänts av institutionella Animal Care and Use Committee vid University of Virginia.
1. Mus förberedelse för kranial fönster implantation
OBS: Olika transgena muslinjer med fluorescerande taggar är lämpliga för avbildning.
- Använd CX3CR1GFP/+ möss26 för att visualisera mikroglia in vivo. Vanligtvis används unga till unga vuxna 4 till 10 veckor gamla möss som väger 17-25 g.
OBS: Även om detta tillvägagångssätt är även apt för pre-avvanda möss, behovet av att återvända möss till sin bur med sina mödrar för utfodring, kan komplicera återhämtningen om modern inte tar tillräcklig hand om valpar efter operationen. Därför rekommenderas användning av möss efter avvänjning. - Söva musen med isofluran (5% flöde i syre för induktion i 1 min) i en bedövningskammare. Kontrollera att musen inte visar några rörelser eller ryckande svar på tå och / eller svans klämmer. Ta musen ut ur kammaren och i utomhus noggrant raka håret på huvudet mellan öronen från ungefär ögonnivån till toppen av halsen regionen med hjälp av en hårtrimmer.
OBS: Koncentrationen av isofluran som används beror på induktionskammarens storlek. Därför, för mindre kammare, 3-4% isofluran kan användas för att effektivt inducera anestesi medan större kammare kommer att kräva upp till 5%. - Flytta musen till stereotaktiska kirurgi stationen näsa kon för anestesi (1,5-2% för underhåll för operationen), stabilisera huvudet med hjälp av öronstänger, och underhålla musen på en värmedyna för att hålla kroppstemperaturen varm.
- Smörj båda ögonen med ögonsalva. Injicera 100 μL 0,25% bupivicaine (för att ge lokal analgesi till musen som kommer att pågå 8-12 h) och 100 μL av 4 mg/mL dexametason (för att minska den inflammation som kan uppstå till följd av operation proceduren) subkutant vid snittstället. Låt musen sitta i minst 5 min innan du går vidare till nästa steg.
- Rengör det rakade huvudet med tre alternerande svabbprover av betadin och 70% alkohol. Gör ett midline hårbotten snitt med kirurgiska blad eller sax sträcker sig från baksidan av skallen regionen mellan öronen till frontalområdet mellan ögonen. Den återstående huden skärs för att exponera skallen.
- Rengör bindväven som ligger mellan hårbotten och den underliggande skallen med 3% väteperoxid (H2O2) och lokalisera hjärnområdet som ska avbildas med stereotaktiska koordinater.
OBS: Det finns ofta en viss blödning (steg 1.5) från snittet på skallytan. Denna blödning löser vanligtvis av sig själv inom 3-5 min. Rengöring med peroxid hjälper. Tidigare bupivacaine behandling (steg 1.4) noteras också för att begränsa mängden blödning under denna tid.
2. Mus kranial fönster implantation kirurgi
- Borra en cirkulär öppning ~4 mm i skallen med hjälp av en tandborrkrona (0,7 mm spetsdiameter) och ta försiktigt bort denna del av skallen med spetsiga pincett. För avbildning somatosensory cortex av 6-8-veckors gamla möss, lokalisera centrum av craniotomy på -2,5 bakre och ± 2,0 laterala till bregma. Under borrning, regelbundet fukta skallen med sterilsaltlösning och bomullspinnar för att kyla hjärnan, rensa bort benskräp och mjuka upp skallbenet för eventuell borttagning.
OBS: Koordinaterna för craniotomy skulle variera beroende på vilken region av intresse och mössens ålder. - När skallen har avlägsnats, placera försiktigt ett litet täckglas (storlek #0 på 0,1 ± 0,02 mm tjocklek) fuktad med saltlösning i craniotomy. Torka av överflödig saltlösning med hjälp av en steril torka.
- Använd en spetsig applikator (t.ex. en pipettspets eller den spetsiga änden av en trasig bomullspinne i trä), applicera cyanoakrylatlim runt fönstret och låt den fästa på hjärnan och skallen. Applicera primernlimmet på resten av skallen och bota det med en härdningslampa för 20-40 s. Förbered en brunn runt fönstret med det slutliga limmet och bota med en härdningslampa för 20-40 s.
- Limma en liten huvudplatta på skallen på craniotomys kontralaterala halvklot först med primernlim som primer och sedan med det slutliga limmet. Härda båda med härdningslampan i 20-40 s vardera.
OBS: Suturer behövs inte om skallen är helt täckt med limmet under denna procedur.
3. Vård efter operationen
- Låt musen vakna i avsaknad av anestesi (återhämtning gjort på en värmedyna förkortar återhämtningstiden) och returnera den till sin hembur när den är helt vaken. Injicera en subkutan dos av buprenorfin SR (0,5 mg/kg) som postoperativ analgesi som är tillräcklig för 72 timmar.
- För att underlätta en hälsosam återhämtning från operationen, ge musen en extra mjuk mat, som kan vara i form av vanlig fast chow i vatten för att mjuka upp chow eller mat i form av en gel.
OBS: En engångsbestämmelse av den mjuka maten omedelbart efter operationen är tillräcklig. - Övervaka musen dagligen för hälsa och korrekt återhämtning för de första 72 h av operationen. Därefter, utföra imaging från så tidigt som 2 veckor från fönstret implantation kirurgi.
OBS: Om det görs bra, möss återhämta sig väl visar normala ambulatoriska beteenden, tillräcklig bur utforskning, god hydrering, stabil viktökning och omfattande interaktioner med andra möss i buren och andra objekt i buren. Möss som visar letargi, uttorkning och större än 10% viktminskning efter operationen avlivas och tas bort från studien.
4. Två foton hjärnkartläggning för inledande avbildning
- Söva musen (Isofluran, 5 % induktion och 1,5 % underhåll). Stabilisera huvudet med skruvarna för att montera huvudplattan på stadiet med två foton och underhålls på en värmeplatta vid 35 °C. Injicera intraperitoneally 100 μL blodkärl färgämne såsom Rhodamine B (2 mg/ml).
OBS: Imaging kan också göras i vakna möss utan anestesi. Emellertid, nyligen genomförda studier visar att anestesi påverkar mikroglial övervakning dynamik27,28,29 och att huvudet fixering för två foton imaging i vakna möss ökar stress även under kronisk avbildning i minst 25 dagar (se Juczewski et al., 2020)30. - Rengör ytan av kranialfönstret försiktigt med hjälp av en bomullspinne dabbed i 70% etanol. Sätt några droppar vatten eller saltlösning på kranialfönstret och sänka objektivet i lösningen eftersom målet är en nedsänkning lins.
- Hand-rita en grov karta för att beteckna de stora blodkärlen landmärken i ett labb anteckningsbok medan du tittar genom okularet av epiflorescence. Använd den här ritningen för att identifiera specifika områden under två fotonbilder. Alternativt kan du ta bilder av blodkärlen antingen genom en kamera monterad på mikroskopet eller via en handhållen kamera eller telefon.
OBS: Dessa handritade bilder och bilder är att underlätta återbesök samma breda regioner under mikroskopet innan två foton imaging. Dessa är inte exakt bildmappning. - Under två foton imaging, samla bilder av florescent celler och fartyg efter behov. Gör noggranna anteckningar med lämpliga koordinater för att säkerställa att de exakta regionerna kan ses över för efterföljande avbildning. Samla flera synfält i denna inledande bildsession t.ex.
OBS: Samtidigt samla bilder med två foton, blodkärlen landmärken används för grov kartläggning. Om finkartläggning behövs används YFP-märkta dendriter från Thy1-YFP31 möss.- Använd dessa rekommenderade parametrar för avbildning: en våglängd på 880-900 nm är optimal; För GFP och/eller dsRed / Rhodamine excitation används en 565 nm dichroic spegel med 525/50 nm (grön kanal) och 620/60 nm (röd kanal) utsläppsfilter; För GFP- och YFP-separation används en 509 nm-dikroisk spegel med utsläppsfilter på 500/15 och 537/26 nm. kraften vid hjärnan bibehålls vid 25 mW eller lägre; bildupplösning är 1024 x 1024 pixlar, synfältet tas med en 25X 0,9 NA mål på en 1,5 X zoomfaktor är 295,24 x 295,24 μm.
- I slutet av avbildningen, ta musen från scenen, låt den vakna upp från anestesi och återvända till sin hembur tills en framtida bildbehandling session.
5. Två foton bildbehandling och ny bildbehandling
- För framtida efterföljande bildsessioner, som kan vara allt från några timmar till månader efter den första bildsessionen, söva musen (Isofluran, 5% induktion och 1,5% underhåll), montera på tvåfotonmikroskopet, underhåll på en värmeplatta och injicera 100 μl ett blodkärl färgämne såsom Rhodamine B (2 mg/ml).
- Öppna de tidigare erhållna bilderna i ImageJ och identifiera de tidigare avbildade områdena med hjälp av dessa bilder och identifiera de tidigare avbildade områdena och avbilda dem noggrant.
- Upprepa detta så länge bildfönstret är klart eller nödvändigt för studiens omfattning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att visualisera mikroglial dynamik in vivo användes dubbla transgena CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-möss. Thy1-YFP H-linjen används i motsats till Thy1-GFP M-linjen för att undvika florescenceöverlappning av mikroglia (GFP) och nervceller (YFP). Alternativa metoder skulle kunna använda en reporterlinje där mikroglia är märkta med tdTomato och sedan Thy1-GFP M-linjen kan användas. En nackdel med H-linjen är att YFP etiketter en hel del nervceller och etiketten ökar med ökande ålder (personlig observation). M-linjen uppvisar gles märkning av nervceller. Mellan 2 – 4 veckor av fönstret implantation kirurgi, mikroglial dynamik kan följas av upprepad bildbehandling. Stora blodkärl används för att lokalisera specifika regioner och sedan YFP-märkta dendriter används för fin kartläggning av hjärnregioner. Med detta tillvägagångssätt kan specifika dendriter användas som stabila landmärken för finkartläggning av hjärnregioner (figur 1, pilar i figur 1b). Medan dendriter är stabila, vissa mikroglia flytta dagligen (Figur 1c).
Dessutom är detta tillvägagångssätt tillräckligt för veckovis longitudinell bildbehandling på lång sikt. Således användes enstaka transgena CX3CR1GFP/+ möss för att följa mikroglia tillsammans med intraperitoneala injektioner av Rhodamine B för att märka vaskulaturen under varje bildbehandlingssession i upp till 8 veckor (figur 2). Alternativt, som diskuterats ovan, Thy1 möss kan användas för longitudinell fin kartläggning. När veckovis avbildning utförs, är vaskulaturen noteras vara stabilt fast, men microglia kan ses som dynamisk som visas i tre specifika regioner av intresse (ROI, streckade cirklar) i figur 2. I den övre ROI, microglia börjar komma in i ROI av den4: e veckan av bildbehandling och fortsätta genom den 8:e veckan av bildbehandling. I mitten ROI med en bifurcated fartyg, en mikroglial cell framträder runt det nedre kärlet i3: e veckan, är förlorad den 6:e veckan och en annan mikroglia framträder på övre blodkärlet i 7:e veckan och bibehålls i 8:e veckan. Slutligen, i den nedre ROI, en mikroglial cell i upprätthålls genom6: e veckan och förlorade i 7:e och 8veckor av bildbehandling. Dessa resultat indikerar dynamiska förändringar i det mikrogliala positionsnätverket under veckor till månader.
Detta tillvägagångssätt kan också användas för att undersöka cellulär dynamik efter akut skada eller under patologisk sjukdomsprogression. Enstaka transgena CX3CR1GFP/+ möss användes för att följa mikroglia tillsammans med intraperitoneal injektioner av Rhodamine B för att märka vaskulaturen före (data som inte visas) och efter svåra anfall som framkallats av kainic syra (figur 3). Efter anfall bibehålls kärlbäddsstrukturen utan förteelser (figur 3a). Det mikrogliala mobilnätet och positionslandskapet ändras dock övergående (vissa celler "vunnits" och andra är "förlorade" inom synfältet) med större förändringar inom 24-48 h av anfall som återställs till det normala med 72 h (figur 3b) som vi tidigare rapporterat32.
Slutligen kan den här metoden också användas för att undersöka cellcellinteraktioner eller jämföra dynamik mellan neurala celltyper. Dubbla transgena CX3CR1GFP/+: NG2dsRed/+ möss användes för att spåra mikroglia och NG2+ celler in vivo. Utan märkning kan vaskulaturen, mikroglia- och NG2-cellerna identifieras (figur 4a). NG2 är en proteoglykan som etiketter både fartygsassocierade pericyter och oligodendrocyte prekursorceller (OPCs)33,34. Pericyter har vanligtvis långsträckta processer som följer längs kärlväggen (presumtivt identifieras med pilspetsar i figur 4a) och OPCs visar vanligtvis större cellkroppar som finns i hjärnan parenkym bort från vaskulatur (presumtivt identifieras med pilar i figur 4a). För att på ett adekvat sätt skilja pericyter och OPC är vaskulaturen märkt med Rhodamine B. Den ljusare blomställning av NG2+-fartyg associerade celler (pericytes, pilspetsar) kan skiljas från svagare blomställning av luminal Rhodamine trots liknande excitering av två foton imaging (Figur 4b, c). Daglig bildbehandling visar att pericyter är stabilt placerade, medan OPCs (asterisker i figur 4b) och mikroglia (cirklar i figur 4b) är dynamiska överensstämmer med tidigare rapporter32,,35,36.
Figur 1: Daglig avbildning av mikroglia med hjälp av fina kartläggning med neuronala dendriter i dubbla transgena CX3CR1GFP/+:Thy1YFP möss. (a)Representativ tvåfotonbild av mikroglia (grön) och dendriter (röd) från en dubbel transgen CX3CR1GFP/+:Thy1YFP mus. (b-c),Dagliga bilder av förpackade område i (a) som visar upprepade avbildade dendriter (pilar i b) och dendriter med mikroglia (c). Medan dendritiska strukturer var positionally stabil, noterades några microglia att flytta från sin ursprungliga position i efterföljande dagar. Sådana celler identifierades med ett nummer (1, 2 eller 3). Föregående dag noterades deras position med en vit asterisk och på en efterföljande dag noterades deras position med en gul asterisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Långtidsavbildning av mikroglia i CX3CR1GFP/+ möss i flera månader. (a-h),Representant två foton bilder av mikroglia (grön) från en CX3CR1GFP / + mus under upprepade bildbehandling med akut märkt vaskulatur (röd, Rhodamine, 2 mg/mL, i.p.) som ett grovt landmärke för att spåra mikroglialnätet i upp till 8 veckor. Vasculature var strukturellt stabil genom bildframställning perioden. Tre små regioner med vaskulatur (streckade cirklar) markerades för att ange förflyttning av mikroglial somata i (topp två streckade cirklar) eller ur (nedre cirkeln) dessa regioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Långvarig daglig avbildning av mikroglia i CX3CR1GFP/+ möss efter anfall. (a-b),Representativa tvåfotonbilder under daglig bildbehandling av samma synfält i en specifik hjärnregion med mikroglia (grön) och akut märkning av vaskulaturen (röd, Rhodamin, 2 mg/mL, i.p.). Imaging börjar efter induktion av svåra anfall med hjälp av ett kemokonvulsivt medel, kainic syra. Kärlstrukturen bibehölls eftersom enskilda kärlsegment (pilar) kan identifieras genom tiden (a). Den mikrogliala nätverksdynamiken ökade dock under de två första dagarna efter anfallen och återgår till normala nivåer den tredje dagen (b). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Daglig avbildning av mikroglia och NG2+ celler i CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ möss. (a)En representativ tvåfotonbild av mikroglia (grön) och NG2+ celler (röda) in vivo. Den omärkta vasculature misslyckas med att skilja NG2 celler (pericyter, presumtivt identifieras med pilspetsar) och NG2 celler som inte är associerade med vasculature (oligodendrocyte prekursorceller eller OPCs, presumtivt identifieras med pilar). b) Representativa tvåfotonbilder av mikroglia (grön) och NG2+ celler (röda) i följd av avbildning med vaskulaturen märkt med Rhodamin. Pericytes (pilspetsar) står stilla medan OPCs är dynamiska (vita till gula asterisker). Microglia är också dynamiska (cirklar: streckade cirklar representerar en position utan mikroglia och fylld cirkel representerar en position med en motsvarande mikroglia). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillkomsten av in vivo två foton imaging har öppnat möjligheter att utforska den uppsjö av cellulära interaktioner och dynamik som uppstår i den friska hjärnan. Inledande studier fokuserade på att använda den öppna skallen craniotomy strategi för bild neuronala dendriter av både akut och kronisk avbildning37,38. Detta kan också användas för att belysa neuroimmun interaktioner i hjärnan. Detta protokoll beskriver en metod för tillförlitlig avbildning av fluorescerande taggade celler (särskilt mikroglia, den inhemska immuncellen i hjärnan) under längre tidsperioder på kort eller lång sikt. Användningen av färgämne-märkt vaskulär och / eller fluorescerande taggade dendriter är detaljerad för grova eller fina kartläggning av hjärnan regioner av intresse för att möjliggöra upprepade, tillförlitlig avbildning av celler. Även om Thy1YFP linje föreslås för användning för fin hjärnan kartläggning, alternativa metoder kan använda andra tekniker eller muslinjer för märkning välja neuronala populationer såsom in utero elektroporation39,40, tidig postnatal AAV injektioner41 eller användning av TRAP möss42. Dessutom, även om kortikal avbildning var i fokus för denna diskussion, kan detta tillvägagångssätt anpassas för att visualisera djupa hjärnstrukturer på lång sikt samt43.
För detta protokoll kan kirurgi förfarandet på varje mus slutföras i 30-60 min från inledandet av anestesi tills återhämtningen från anestesi. Under operationen avlägsnas skallen försiktigt och ersätts med ett sterilt täckglas som implanteras för långtidsavbildning efter minst två veckor. Dödligheten är extremt sällsynt (mindre än 5 %) i wildtype möss, men möss med koagulationsproblem, såsom P2Y12R knockout möss, visar högre dödlighet och kirurgi misslyckande. Hos sådana möss kan blödningen kvarstå under längre tidsperioder och möss kan dö inom de första 48 h av craniotomy förmodligen på grund av komplikationer från inre blödningar. Möss med implanterade fönster från detta protokoll har inte märkts för att visa några tecken på infektion och protokollet kan användas på ett tillförlitligt sätt för att generera tydliga fönster för långsiktig bildbehandling hos 50-80% av möss.
Alternativ till den nuvarande kroniska fönster implantation strategi, den tunna skallen metoden finns för att visualisera hjärnceller i den intakta hjärnan upprepade gånger. Flera studier har belyst värdet och även prioritet val av tunn skalle strategi över fönstret implantation strategi22,23,24,25. Löftet om detta tillvägagångssätt bör inte ignoreras eftersom, när det görs på rätt sätt, det motverkar flera framträdande begränsningar eller nackdelar med den nuvarande metoden, inklusive bristen på aktivering av gliaceller, den låga omsättningen av taggar som är mer fysiologiska, och bristen på behov av användning av antiinflammatoriska medel som också kan påverka hjärnans fysiologi. Vid valet av en metod för specifika forskningsfrågor bör dessa allvarliga begränsningar övervägas innan man väljer den metod som beskrivs i detta protokoll.
Överklagandet av detta tillvägagångssätt är dock fyrfaldigt. För det första är hjärnskålen fönster implantation strategi attraktiv på grund av enkel behärskning av detta förfarande i förhållande till den tunna skallen förfarandet. Lämplig skalle gallring kan inte alltid behärskas av försökskaror och om inte gjort bra kan resultera i glial aktivering begränsa dess överklagande. För det andra, denna kranial fönster implantation strategi ger kraftfull djup klarhet i hjärnans strukturer som hjärnan avbildas genom ett optiskt tydligt fönster. Fönstret som finns tillgängligt för bildbehandling är också oftast mycket större än det som används i den tunna skallen metoden ger tillgång till en större volym av vävnad för analys. För det tredje, liksom djup klarhet, möjliggör detta tillvägagångssätt för en jämn klarhet genom fönstret eftersom glaset täcket är jämnt tunn och klar. Detta underlättar jämförelser mellan sessioner och mellan djur. Särskild expertis krävs för tunn skalle teknik för att säkerställa jämn klarhet över fönstret under upprepade sessioner och mellan djur. Slutligen erbjuder detta tillvägagångssätt mycket flexibilitet i frekvensen av bildbehandling från timmar, till dagar till veckor till månader och till och med år. För den tunna skallen tillvägagångssätt, högst fem repetitioner har föreslagits24.
Framtida tillämpningar av detta tillvägagångssätt är många. För det första kan tillämpningar innebära att belysa nya neuro-glio-vaskulära interaktioner i hjärnan i både normal fysiologi och patologi. För det andra, även om inhemska celler diskuteras i detta förfarande, kan metoden användas för att studera dynamiken och interaktionerna av infiltrera immunceller som inträffar t.ex. Slutligen har detta tillvägagångssätt diskuterats främst i samband med strukturella studier av hjärnceller. Men med tillkomsten av funktionell avbildning44,45,46 t.ex.47,48
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i Eyo labbet för att diskutera de idéer som presenteras i detta manuskript. Vi tackar Dr Justin Rustenhoven från Kipnis Lab vid University of Virginia för gåvan av NG2DsRed möss33. Detta arbete stöds av finansiering från National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health till U.B.E (K22 NS104392).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C.
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W.
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J.
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L.
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
