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Immunology and Infection

चूहों में न्यूरो-इम्यून डायनेमिक्स के वीवो इमेजिंग में दोहराव करने के लिए सटीक ब्रेन मैपिंग

Published: August 7, 2020 doi: 10.3791/61454
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia, 2Department of Neuroscience, University of Virginia

Summary

यह प्रोटोकॉल एक पुरानी कपाल खिड़की प्रत्यारोपण तकनीक का वर्णन करता है जिसका उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त दोनों स्थितियों में न्यूरो-ग्लियो-वैस्कुलर संरचनाओं, बातचीत और कार्य के देशांतर इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। यह ट्रांसक्रैनियल इमेजिंग दृष्टिकोण के पूरक विकल्प के रूप में कार्य करता है, जबकि अक्सर पसंद किया जाता है, कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं होती हैं।

Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को न्यूरोनल, ग्लियल, स्ट्रोमल और संवहनी कोशिकाओं के जटिल परस्पर क्रिया द्वारा विनियमित किया जाता है जो इसके उचित कार्य को सुविधाजनक बनाता है। हालांकि इन कोशिकाओं का अध्ययन इन कोशिकाओं में विट्रो में अलगाव या एक साथ पूर्व वीवो उपयोगी शारीरिक जानकारी प्रदान करता है; तंत्रिका कोशिका शरीर विज्ञान की मुख्य विशेषताएं ऐसे संदर्भों में याद किया जाएगा। इसलिए वीवो वातावरण में अपने मूल में तंत्रिका कोशिकाओं का अध्ययन करने की आवश्यकता है। यहां विस्तृत प्रोटोकॉल कृंतक प्रांतस्था में तंत्रिका कोशिकाओं के वीवो दो-फोटॉन इमेजिंग में दोहराए जाने का वर्णन करता है ताकि घंटे-घंटों से महीनों तक समय की विस्तारित अवधि में विशिष्ट कोशिकाओं की कल्पना और अध्ययन किया जा सके। हम विस्तार से एक मोटे नक्शे के रूप में घोर स्थिर मस्तिष्क vasculature के उपयोग का वर्णन या फ्लोरोसेंटी ब्याज के चुनिंदा मस्तिष्क क्षेत्रों का एक अच्छा नक्शा के रूप में dendrites लेबल । एक दृश्य कुंजी के रूप में इन नक्शे का उपयोग करना, हम दिखाते हैं कि कैसे तंत्रिका कोशिकाओं को वीवो इमेजिंग में बाद में दोहराव के लिए ठीक से जगह दी जा सकती है। फ्लोरोसेंटली-लेबल माइक्रोग्लिया, न्यूरॉन्स और एनजी 2+ कोशिकाओं के वीवो इमेजिंग के उदाहरणों का उपयोग करके, यह प्रोटोकॉल इस तकनीक की क्षमता को दर्शाता है ताकि विस्तारित समय अवधि के साथ एक ही मस्तिष्क स्थान में सेलुलर गतिशीलता के दोहराव वाले दृश्य की अनुमति दी जा सके, जो सामान्य शरीर विज्ञान या निम्नलिखित पैथोलॉजिकल अपमान में इन कोशिकाओं की संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को समझने में और सहायता कर सकता है। जहां आवश्यक हो, इस दृष्टिकोण को कैल्शियम इमेजिंग के साथ तंत्रिका कोशिकाओं की कार्यात्मक इमेजिंग के साथ युग्मित किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण वीवो में सीएनएस के विभिन्न सेल प्रकारों के बीच शारीरिक बातचीत की कल्पना करने के लिए विशेष रूप से एक शक्तिशाली तकनीक है जब आनुवंशिक माउस मॉडल या विशिष्ट रंगों को अलग फ्लोरोसेंट टैग के साथ ब्याज की कोशिकाओं को लेबल करने के लिए उपलब्ध हैं।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) न्यूरॉन्स, ग्लिया और पोत से जुड़े कोशिकाओं सहित विभिन्न निवासी सेल प्रकारों के बीच बातचीत के एक जटिल परस्पर क्रिया द्वारा नियंत्रित होता है। परंपरागत रूप से, तंत्रिका कोशिकाओं का अध्ययन अलग- अलग, सह-संस्कारी1,,2,,3,,4,,5 (इन विट्रो) या उत्पादित मस्तिष्क ऊतक (पूर्व वीवो)6,7,,8,,,9,,10 संदर्भों में किया गया था। हालांकि, वीवो में बरकरार मस्तिष्क के मूल वातावरण में तंत्रिका कोशिका व्यवहार और बातचीत को और समझने की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम रुचि के वीवो क्षेत्रों में मानचित्रण करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और भविष्य के इमेजिंग सत्रों में उन क्षेत्रों को ठीक से फिर से छवि देते हैं ताकि विस्तारित अवधि में विभिन्न सीएनएस सेल प्रकारों के बीच जटिल बातचीत को ट्रैक किया जा सके।

वीवो इमेजिंग दृष्टिकोणों के विकास ने तंत्रिका कार्य 11 ,12 , 13,,,1414,,15की उचित समझ के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान किया है ।15 विशेष रूप से, ये दृष्टिकोण पारंपरिक इन विट्रो और पूर्व वीवो दृष्टिकोणों पर कई फायदे प्रदान करते हैं। सबसे पहले, वीवो इमेजिंग सिस्टम में तंत्रिका नेटवर्क फिजियोलॉजी की पूरी समझ प्रदान करने के लिए सेलुलर इंटरैक्शन के पूर्ण प्रदर्शनों की सूची के साथ वैक्यूलेचर जैसे शारीरिक रूप से प्रासंगिक कोशिका और ऊतक घटक होते हैं। दूसरा, हाल के निष्कर्षों से पता चलता है कि जब उनके मूल वातावरण से हटा दिया जाता है, तो कुछ तंत्रिका कोशिकाएं (जैसे माइक्रोग्लिया) अपनी पहचान की महत्वपूर्ण विशेषताएं खो देती हैं और इस प्रकार शरीर विज्ञान16,,17 जिसे वीवो सेटिंग में संरक्षित किया जा सकता है। तीसरा, वीवो इमेजिंग सिस्टम में सीएनएस सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए हफ्तों से महीनों की स्थिर देशांतर जांच का अवसर प्रदान करता है। अंत में, परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली18,19 और माइक्रोबायोम20,,सीएनएस फिजियोलॉजी में21 से योगदान के लिए बढ़ते सबूतों को देखते हुए, वीवो सिस्टम में सीएनएस कोशिकाओं पर ऐसे योगदान और प्रभावों से पूछताछ करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।, इस प्रकार, दृष्टिकोण है कि वीवो इमेजिंग में देशांतर रोजगार के लिए न्यूरो प्रतिरक्षा शरीर विज्ञान और स्वस्थ, घायल, और रोगग्रस्त राज्यों में बातचीत का अध्ययन पारंपरिक दृष्टिकोण के लिए एक महान पूरक इसके अलावा हैं ।

इस प्रोटोकॉल में, हम उदाहरण के रूप में माइक्रोग्लिया, न्यूरॉन्स और एनजी 2+ कोशिकाओं सहित मस्तिष्क में विभिन्न कोशिका प्रकारों की छवि के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। वीवो में तंत्रिका कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए दो दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं: पतली खोपड़ी दृष्टिकोण और एक कपाल खिड़की दृष्टिकोण के साथ खुली खोपड़ी। यद्यपि पतली खोपड़ी दृष्टिकोण उपयोग में हैं और पसंद किए जाते हैं क्योंकि वे खुले खोपड़ी दृष्टिकोण के कुछ नुकसानों जैसे ग्लियल सेल सक्रियण, उच्च-से-शारीरिक रीढ़ की गतिशीलता और विरोधी भड़काऊ एजेंटों के उपयोग को दूर करते हैं22,,23,24,,25,पतली खोपड़ी दृष्टिकोण भी कुछ महत्वपूर्ण कमियां दिखाते हैं।, सबसे पहले, पतली प्रक्रिया एक बहुत ही नाजुक प्रक्रिया है कि कई शोधकर्ताओं को सही करने के लिए मुश्किल लगता है, खासकर जब फिर से पतला आवश्यक है । यह मामला है क्योंकि प्रयोगकर्ताओं के लिए यह पता लगाना अक्सर मुश्किल होता है कि उन्होंने खोपड़ी को ~ 20 माइक्रोन गहराई तक पतला कर दिया है। दूसरा, चूहों के बीच पर्याप्त तुलना के लिए, पतले होने के लिए समान होने की आवश्यकता होगी और इमेजिंग सत्र या चूहों के बीच विभिन्न प्रकार की पतली सफलता तंत्रिका संरचनाओं के दृश्य को जटिल बना सकती है। तीसरा, जब देशांतर इमेजिंग के लिए कार्यरत है, पतली खोपड़ी के साथ जानवरों को केवल सत्र की एक सीमित संख्या के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब खोपड़ी के फिर से पतला कार्यरत है । आगे, के बाद से हड्डी ऊतक के कुछ अभी भी रहता है, इमेजिंग की गहराई में स्पष्टता पतली खोपड़ी अधिक सतही के महान दृश्य के लिए अनुमति दृष्टिकोण से समझौता किया जा सकता है, लेकिन गहरे क्षेत्रों के साथ ज्यादा नहीं । इस के प्रकाश में, हिप्पोकैम्पस जैसे गहरे मस्तिष्क संरचनाओं को पतला खोपड़ी दृष्टिकोण के साथ सफलतापूर्वक चित्रित नहीं किया जा सकता है। ये विचार वैकल्पिक और पूरक दृष्टिकोणों की आवश्यकता को बढ़ाते हैं जो इन चिंताओं को दूर कर सकते हैं ।

पतली खोपड़ी दृष्टिकोण के लिए वैकल्पिक, खुली खोपड़ी खिड़की प्रत्यारोपण दृष्टिकोण एक प्रक्रिया है जिसमें खोपड़ी एक ऑप्टिकली स्पष्ट ग्लास कवरस्लिप के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है का उपयोग करता है । यह इमेजिंग सत्रों की एक के पास असीमित संख्या के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, ग्लास कवरलिप के साथ खोपड़ी के प्रतिस्थापन को देखते हुए, यह विधि घंटों से महीनों तक समय की व्यापक अवधि के लिए फ्लोरोसेंटली टैग की मस्तिष्क कोशिकाओं की एक स्पष्ट देखने की खिड़की के लिए अनुमति देती है और इसलिए, कोशिका गतिविधि और बातचीत का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है जो शरीर विज्ञान, उम्र बढ़ने और विकृति के लिए प्रासंगिक हैं।

कुल मिलाकर, हम उन चरणों का विस्तार करते हैं जिनका पालन स्टीरियोटैक्सिक क्रैनियोटॉमी के माध्यम से पुरानी कपाल खिड़कियों को प्रत्यारोपित करने के लिए किया जा सकता है जो ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों के वीवो इमेजिंग में सक्षम बनाता है। हम यह भी वर्णन करते हैं कि कैसे मोटे मस्तिष्क वास्कुलेचर या फ्लोरोसेंटी लेबल वाले डेनड्राइट्स का उपयोग ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों के क्रमशः एक मोटे या ठीक नक्शे को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग तब कई सत्रों में दोहराए जाने वाले इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का महत्व, इसलिए, विभिन्न सेलुलर प्रकारों की व्यवस्था, आकृति विज्ञान और बातचीत सहित मस्तिष्क तत्वों में दीर्घकालिक परिवर्तन या स्टेसिस को छवि देने की क्षमता में निहित है।

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Protocol

सभी कदम वर्जीनिया विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित और अनुमोदित दिशा-निर्देशों के अनुसार हैं ।

1. कपाल खिड़की प्रत्यारोपण के लिए माउस तैयारी

नोट: फ्लोरोसेंट टैग के साथ विभिन्न ट्रांसजेनिक माउस लाइनें इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं।

  1. वीवो में माइक्रोग्लिया की कल्पना करने के लिए CX3CR1GFP/+ चूहों26 का उपयोग करें । आमतौर पर, युवा वयस्क 4 से 10 सप्ताह पुराने चूहों कि वजन 17-25 ग्राम के लिए किशोर का उपयोग किया जाता है ।
    नोट: हालांकि, यह दृष्टिकोण पूर्व-दूध पिलाने वाले चूहों के लिए भी उपयुक्त है, चूहों को खिलाने के लिए उनकी माताओं के साथ उनके पिंजरे में लौटने की आवश्यकता है, अगर मां सर्जरी के बाद पिल्ले की पर्याप्त देखभाल नहीं करती है तो वसूली जटिल हो सकती है। इसलिए, चूहों के बाद प्रात: का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  2. एनेस्थेटिक कक्ष में आइसोफ्लुन (1 मिनट के लिए प्रेरण के लिए ऑक्सीजन में 5% प्रवाह) का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें। जांच करें कि माउस किसी भी आंदोलन या अंगुली और/ माउस को कक्ष से बाहर निकालें और खुली हवा में बाल ट्रिमर का उपयोग करके आंखों के स्तर के बारे में कान ों के बीच सिर पर बालों को गर्दन के क्षेत्र के शीर्ष तक अच्छी तरह से शेव करें।
    नोट: इस्तेमाल आइसोफ्लुन की एकाग्रता इंडक्शन चैंबर के आकार पर निर्भर करेगी। इसलिए, छोटे कक्षों के लिए, 3-4% आइसोफ्लुन का उपयोग एनेस्थीसिया को प्रभावी ढंग से प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है जबकि बड़े कक्षों को 5% तक की आवश्यकता होगी।
  3. संज्ञाहरण के लिए स्टीरियोटाक्टिक सर्जरी स्टेशन नाक शंकु (सर्जरी के लिए रखरखाव के लिए 1.5-2%) के लिए माउस ले जाएँ, कान सलाखों का उपयोग कर अपने सिर को स्थिर, और शरीर के तापमान को गर्म रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर माउस बनाए रखने के लिए।
  4. दोनों आंखों को आंखों के मरहम से चिकनाई करें। 0.25% bupivicaine के 100 माइक्रोल इंजेक्ट (माउस है कि 8-12 घंटे पिछले जाएगा करने के लिए स्थानीय एनाल्जेसिया प्रदान करने के लिए) और 4 मिलीग्राम/ अगले चरण में जाने से पहले माउस को कम से कम 5 मिनट तक बैठने दें।
  5. मुंडा सिर को बीटाडीन और 70% शराब के तीन बारी-बारी से झाड़ू के साथ साफ करें। सर्जिकल ब्लेड या कैंची का उपयोग करके एक मिडलाइन खोपड़ी चीरा बनाएं जो कान के बीच खोपड़ी क्षेत्र के पीछे से आंखों के बीच ललाट क्षेत्र तक फैली हुई है। खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए बची हुई त्वचा को काटा जाता है।
  6. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ2)के साथ खोपड़ी2और अंतर्निहित खोपड़ी के बीच स्थित संयोजी ऊतक को साफ करें और मस्तिष्क क्षेत्र को स्टीरियोटाटिक निर्देशांक के साथ चित्रित करने के लिए स्थानीयकृत करें।
    नोट: खोपड़ी की सतह पर चीरा से अक्सर कुछ रक्तस्राव (चरण 1.5) होता है। यह रक्तस्राव आमतौर पर 3-5 मिनट के भीतर खुद को हल करता है। पेरोक्साइड के साथ सफाई करने से मदद मिलती है। पूर्व bupivacaine उपचार (चरण 1.4) भी इस समय के दौरान रक्तस्राव की मात्रा को सीमित करने के लिए उल्लेख किया है।

2. माउस कपाल खिड़की प्रत्यारोपण सर्जरी

  1. एक दंत ड्रिल बिट (0.7 मिमी टिप व्यास) का उपयोग करके खोपड़ी में ~ 4 मिमी खोलने के लिए एक परिपत्र ड्रिल करें और इंगित संदंश का उपयोग करके खोपड़ी के इस हिस्से को ध्यान से हटा दें। 6-8-सप्ताह पुराने चूहों के सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स इमेजिंग के लिए, -2.5 पीछे और ± 2.0 पार्श्व में ब्रेग्मा के लिए क्रैनियोटॉमी के केंद्र का पता लगाएं। ड्रिलिंग के दौरान, नियमित रूप से मस्तिष्क को ठंडा करने के लिए बाँझ नमकीन और कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी गीला, हड्डी मलबे को साफ और अंततः हटाने के लिए खोपड़ी की हड्डी नरम ।
    नोट: क्रैनिओटॉमी के लिए निर्देशांक ब्याज के क्षेत्र और चूहों की उम्र के आधार पर भिन्न होंगे।
  2. खोपड़ी को हटाने के बाद, क्रेनियोटॉमी में खारा के साथ गीला एक छोटा कवरग्लास (0.1 ± 0.02 मिमी मोटाई पर आकार #0) ध्यान से रखें। बाँझ पोंछ का उपयोग करके अतिरिक्त नमकीन को सुखा लें।
  3. एक नुकीले एप्लिकेटर (जैसे कि एक पिपेट टिप या टूटे हुए लकड़ी के सूती झाड़ू छड़ी के नुकीले छोर) का उपयोग करना, खिड़की के चारों ओर साइनोएक्रिलेट गोंद लागू करें और इसे मस्तिष्क और खोपड़ी से जोड़ने की अनुमति दें। खोपड़ी के बाकी हिस्सों में प्राइमर गोंद लागू करें और इसे 20-40 एस के लिए एक इलाज प्रकाश के साथ ठीक करें। 20-40 एस के लिए एक इलाज प्रकाश के साथ खिड़की के चारों ओर एक अच्छी तरह से तैयार करें।
  4. एक प्राइमर के रूप में प्राइमर गोंद के साथ पहले क्रैनियोटॉमी के कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध पर खोपड़ी पर एक छोटी सिर की प्लेट गोंद और फिर अंतिम गोंद के साथ। 20-40 एस प्रत्येक के लिए इलाज प्रकाश के साथ दोनों का इलाज करें।
    नोट: अगर खोपड़ी पूरी तरह से इस प्रक्रिया के दौरान गोंद के साथ कवर किया जाता है टांके की जरूरत नहीं है ।

3. सर्जरी के बाद की देखभाल

  1. माउस को संज्ञाहरण के अभाव में जागने की अनुमति दें (एक हीटिंग पैड पर की गई वसूली वसूली समय को छोटा करती है) और इसे पूरी तरह से जागने के बाद अपने घर पिंजरे में वापस करें। पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया के रूप में बुप्रेनोरफिन एसआर (0.5 मिलीग्राम/किलो) की एक चमड़े की खुराक इंजेक्ट करें जो 72 घंटे के लिए पर्याप्त है।
  2. सर्जरी से स्वस्थ वसूली की सुविधा के लिए, माउस को एक अतिरिक्त नरम भोजन प्रदान करें, जो जेल के रूप में चाउ या भोजन को नरम करने के लिए पानी में नियमित ठोस चाउ के रूप में हो सकता है।
    नोट: सर्जरी के तुरंत बाद नरम भोजन की एक बार की व्यवस्था पर्याप्त है।
  3. सर्जरी प्रक्रिया के पहले 72 घंटे के लिए स्वास्थ्य और उचित वसूली के लिए दैनिक माउस की निगरानी करें। बाद में, खिड़की प्रत्यारोपण सर्जरी से 2 सप्ताह के रूप में जल्दी से इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: यदि अच्छी तरह से किया जाता है, तो चूहों अच्छी तरह से सामान्य आंचल व्यवहार, पर्याप्त पिंजरे की खोज, अच्छा जलयोजन, स्थिर वजन और पिंजरे में अन्य चूहों और पिंजरे में अन्य वस्तुओं के साथ व्यापक बातचीत दिखाते हैं। सर्जरी के बाद सुस्ती, निर्जलीकरण और 10% से अधिक वजन घटाने दिखा चूहों इच्छामृत्यु और अध्ययन से हटा रहे हैं ।

4. प्रारंभिक इमेजिंग के लिए दो फोटॉन ब्रेन मैपिंग

  1. माउस (आइसोफलुरेन, 5% प्रेरण और 1.5% रखरखाव) को एनेस्थेटाइज करें। दो फोटॉन माइक्रोस्कोप चरण पर हेडप्लेट माउंट करने के लिए शिकंजा का उपयोग कर सिर को स्थिर करें, 35 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग प्लेट पर बनाए रखा जा रहा है। इंट्रापेरिटोनली 100 माइक्रोन ब्लड वेसल डाई जैसे रोडामाइन बी (2 मिलीग्राम/एमएल) इंजेक्ट करें।
    नोट: इमेजिंग भी संज्ञाहरण के बिना जाग चूहों में किया जा सकता है । हालांकि, हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि संज्ञाहरण माइक्रोग्लियल निगरानी गतिशीलता को प्रभावित करता है27,,28,,29 और जाग चूहों में दो फोटॉन इमेजिंग के लिए सिर निर्धारण कम से कम 25 दिनों के लिए पुरानी इमेजिंग के दौरान भी तनाव बढ़ जाता है (देखें Juczewski एट अल, 2020)30.
  2. कपाल खिड़की की सतह को धीरे से 70% इथेनॉल में एक कपास झाड़ू डब का उपयोग कर साफ करें। कपाल खिड़की पर पानी या खारा की कुछ बूंदें रखो और उद्देश्य लेंस को समाधान में कम करें क्योंकि उद्देश्य एक विसर्जन लेंस है।
  3. हाथ से एक मोटे नक्शे आकर्षित करने के लिए एक प्रयोगशाला नोटबुक में प्रमुख रक्त वाहिका स्थलों निरूपित करते हुए epiflorescence द्वारा आंख के माध्यम से देख रहे हैं । दो फोटॉन इमेजिंग के दौरान विशिष्ट क्षेत्रों की पहचान करने के लिए इस ड्राइंग का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, रक्त वाहिकाओं की तस्वीरें या तो माइक्रोस्कोप में लगे कैमरे के माध्यम से या हाथ से आयोजित कैमरे या फोन के माध्यम से लें।
    नोट: ये हाथ से खींची गई छवियां और चित्र दो फोटॉन इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप के तहत एक ही व्यापक क्षेत्रों की समीक्षा की सुविधा प्रदान करने के लिए हैं । ये सटीक इमेज मैपिंग नहीं हैं।
  4. दो फोटॉन इमेजिंग के तहत, आवश्यकतानुसार फ्लोरोसेंट कोशिकाओं और जहाजों की छवियों को इकट्ठा करें। यह सुनिश्चित करने के लिए उचित निर्देशांक के साथ सावधानीपूर्वक नोट्स लें कि बाद में इमेजिंग के लिए सटीक क्षेत्रों पर फिर से गौर किया जा सकता है। इस प्रारंभिक इमेजिंग सत्र में देखने के कई क्षेत्रों को इकट्ठा करें जैसे ऊतक की मात्रा के माध्यम से हर 1-2 माइक्रोन जेड-स्टैक छवियों का अधिग्रहण करें।
    नोट: दो फोटॉन द्वारा छवियों को इकट्ठा करते समय, रक्त वाहिका स्थलों का उपयोग मोटे मानचित्रण के लिए किया जाता है। यदि ठीक मानचित्रण की आवश्यकता है, तो Thy1-YFP31 चूहों से वाईएफपी-लेबल डेंड्राइट्स का उपयोग किया जाता है।
    1. इमेजिंग के लिए इन अनुशंसित मापदंडों का उपयोग करें: 880-900 एनएम की तरंगदैर्ध्य इष्टतम है; जीएफपी और/या dsRed/रोडामाइन एक्सिटेशन के लिए, 525/50 एनएम (ग्रीन चैनल) और 620/60 एनएम (रेड चैनल) उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक ५६५ एनएम डिक्रोइक मिरर का उपयोग किया जाता है; जीएफपी और वाईएफपी पृथक्करण के लिए, 500/15 और 537/26 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ 509 एनएम डिक्रोइक मिरर का उपयोग किया जाता है; मस्तिष्क में शक्ति 25 एमडब्ल्यू या उससे नीचे रखी जाती है; इमेज रेजोल्यूशन 1024 x 1024 पिक्सल है, 1.5X जूम फैक्टर पर 25X 0.9 NA ऑब्जेक्टिव के साथ लिया गया व्यू का क्षेत्र 295.24 x 295.24 माइक्रोन है।
  5. इमेजिंग के अंत में, माउस को मंच से दूर ले जाएं, इसे संज्ञाहरण से जागने और भविष्य के इमेजिंग सत्र तक अपने घर के पिंजरे में लौटने की अनुमति दें।

5. दो फोटॉन इमेजिंग और री-इमेजिंग

  1. भविष्य के बाद इमेजिंग सत्रों के लिए, जो प्रारंभिक इमेजिंग सत्र के बाद कुछ घंटों से महीनों तक कहीं भी हो सकता है, माउस (आइसोफलुरेन, 5% प्रेरण और 1.5% रखरखाव) को एनेस्थेटाइज करें, दो फोटॉन माइक्रोस्कोप पर माउंट करें, एक हीटिंग प्लेट पर बनाए रखें और 100 माइक्रोन को रोडेबीमीन (2 मिलीग्राम/एमएलएएल) जैसे रक्त वाहिका डाई करें।
  2. इमेजजे में पहले से प्राप्त छवियों को खोलें और, पिछले सत्र से इन छवियों के साथ-साथ नोटों का उपयोग करके, पहले चित्रित क्षेत्रों की पहचान करें और उन्हें ध्यान से फिर से छवि दें।
  3. जब तक इमेजिंग विंडो स्पष्ट है या अध्ययन की सीमा के लिए आवश्यक है, तब तक इसे दोहराएं।

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Representative Results

वीवो में माइक्रोग्लियल गतिशीलता की कल्पना करने के लिए, डबल ट्रांसजेनिक CX3CR1GFP/+:Thy1YFP चूहों का इस्तेमाल किया गया । Thy1-YFP एच लाइन का उपयोग माइक्रोग्लिया (जीएफपी) और न्यूरॉन्स (वाईएफपी) के फ्लोरेस ओवरलैप से बचने के लिए Thy1-GFP एम लाइन के विपरीत किया जाता है। वैकल्पिक दृष्टिकोण एक रिपोर्टर लाइन का उपयोग कर सकते हैं जिसमें माइक्रोग्लिया को उदाहरण के साथ लेबल किया जाता है, tdTomato और फिर Thy1-GFP M लाइन का उपयोग किया जा सकता है। एच लाइन की एक कमी यह है कि वाईएफपी बहुत सारे न्यूरॉन्स को लेबल करता है और बढ़ती उम्र (व्यक्तिगत अवलोकन) के साथ लेबल बढ़ता है। एम लाइन न्यूरॉन्स की विरल लेबलिंग प्रदर्शित करता है। खिड़की प्रत्यारोपण सर्जरी के 2 - 4 सप्ताह के बीच, माइक्रोग्लियल गतिशीलता दोहराया इमेजिंग के बाद किया जा सकता है। बड़ी रक्त वाहिकाओं का उपयोग विशिष्ट क्षेत्रों को स्थानीयकृत करने के लिए किया जाता है और फिर वाईएफपी-लेबल डेंड्राइट्स का उपयोग मस्तिष्क क्षेत्रों के ठीक मानचित्रण के लिए किया जाता है। इस दृष्टिकोण के साथ, विशिष्ट dendrites मस्तिष्क क्षेत्रों के ठीक मानचित्रण के लिए स्थिर स्थलों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है(चित्रा 1, चित्रा 1bमें तीर) । जबकि dendrites स्थिर हैं, कुछ माइक्रोग्लिया दैनिक कदम(चित्रा 1c)।

इसके अलावा, यह दृष्टिकोण लंबी अवधि में साप्ताहिक देशांतर इमेजिंग के लिए पर्याप्त है। इस प्रकार, एकल ट्रांसजेनिक CX3CR1GFP/+ चूहों का उपयोग 8 सप्ताह तक(चित्रा 2)के लिए प्रत्येक इमेजिंग सत्र के दौरान वाक्यूलेचर को लेबल करने के लिए रोडामाइन बी के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ मिलकर माइक्रोग्लिया का पालन करने के लिए किया गया था । वैकल्पिक रूप से, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, Thy1 चूहों का उपयोग देशांतर ठीक मानचित्रण के लिए किया जा सकता है। जब साप्ताहिक इमेजिंग की जाती है, तो वैक्यूलेचर को स्थिर रूप से तय किया जाता है, लेकिन माइक्रोग्लिया को चित्र 2में ब्याज के तीन विशिष्ट क्षेत्रों (आरओआई, धराशायी हलकों) में दिखाए गए गतिशील देखा जा सकता है। शीर्ष आरओआई में, माइक्रोग्लिया इमेजिंग के4 सप्ताह तक आरओआई में प्रवेश करना शुरू कर देता है और इमेजिंग के 8सप्ताह के माध्यम से जारी रखता है। बीच में एक विभाजित पोत के साथ, एक माइक्रोग्लियल सेल3 सप्ताह में निचले पोत के आसपास उभरता है, 6सप्ताह में खो जाता है और एक और माइक्रोग्लिया7 सप्ताह में ऊपरी रक्त वाहिका पर उभरता है और 8वें सप्ताह में बनाए रखा जाता है । अंत में, नीचे आरओआई में, 6सप्ताह के माध्यम से बनाए रखा में एक माइक्रोग्लियल सेल और इमेजिंग के 7 और8 सप्ताह में खो दिया है । ये परिणाम सप्ताह से महीनों में माइक्रोग्लियल स्थितीय नेटवर्क में गतिशील परिवर्तन का संकेत देते हैं ।

इस दृष्टिकोण का उपयोग तीव्र चोट के बाद या रोग रोग प्रगति के दौरान सेलुलर गतिशीलता की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। एकल ट्रांसजेनिक CX3CR1GFP/+ चूहों का उपयोग रोडामाइन बी के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ मिलकर माइक्रोग्लिया का पालन करने के लिए किया गया था ताकि वेक्यूलेचर को पहले लेबल किया जा सके (डेटा नहीं दिखाया गया है) और कायनिक एसिड(चित्रा 3)द्वारा प्रेरित गंभीर बरामदगी के बाद । बरामदगी के बाद, संवहनी बिस्तर संरचना खुलकर क्षोभ(चित्रा 3a)के बिना बनाए रखा जाता है । हालांकि, माइक्रोग्लियल सेलुलर नेटवर्क और स्थितीय परिदृश्य क्षणिक रूप से बदल जाता है (कुछ कोशिकाओं को "प्राप्त" किया जाता है और अन्य को देखने के क्षेत्र में "खो" जाते हैं) 24-48 h के दौरे के भीतर अधिक परिवर्तन के साथ जो 72 घंटे(चित्रा 3b)द्वारा सामान्य रूप से बहाल किया जाता है जैसा कि हमने पहले32बताया था।

अंत में, इस दृष्टिकोण का उपयोग सेल-सेल इंटरैक्शन की जांच करने या तंत्रिका कोशिका प्रकारों के बीच गतिशीलता की तुलना करने के लिए भी किया जा सकता है। डबल ट्रांसजेनिक CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ चूहों का उपयोग वीवो में माइक्रोग्लिया और एनजी 2+ कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए किया गया था । वैक्यूलेचर लेबलिंग के बिना, माइक्रोग्लिया और एनजी 2 कोशिकाओं की पहचान की जा सकतीहै (चित्रा 4a)। NG2 एक प्रोटेओग्लाइकन है जो पोत से जुड़े पेरिसाइट्स और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी)33, 34,34दोनों को लेबल करता है। पेरिसाइट्स में आम तौर पर विस्तारित प्रक्रियाएं होती हैं जो संवहनी दीवार के साथ पालन करती हैं (चित्रा 4aमें एरोहेड के साथ संभावित रूप से पहचानी जाती हैं) और ओपीसी आम तौर पर बड़े सेल निकायों को दिखाते हैं जो मस्तिष्क परंकिकामा में वैक्यूलेचर से दूर रहते हैं (संभवतः चित्रा 4aमें तीर के साथ पहचाने जाते हैं)। पेरिसाइट्स और ओपीसी को पर्याप्त रूप से अलग करने के लिए, वैक्यूलेचर को रोडामाइन बी के साथ लेबल किया गया है। एनजी 2+-पोत से जुड़ी कोशिकाओं (पेरिसाइट्स, एरोहेड) की उज्जवल फ्लोरेसेंस को दो फोटॉन इमेजिंग(चित्रा 4बी, सी)द्वारा इसी तरह की उमंग के बावजूद ल्यूमिनल रोडामाइन के बेहोश फ्लोरेस से अलग किया जा सकता है। दैनिक इमेजिंग से पता चलता है कि पेरिसाइट्स को स्थिर रूप से तैनात किया जाता है, जबकि ओपीसी (चित्रा 4bमें तारक) और माइक्रोग्लिया (चित्रा 4bमें सर्कल) पिछलीरिपोर्टों 32, 35,,,36के अनुरूप गतिशील हैं।35

Figure 1
चित्रा 1: डबल ट्रांसजेनिक CX3CR1GFP/+में न्यूरोनल dendrites के साथ ठीक मानचित्रण का उपयोग कर माइक्रोग्लियाकी दैनिक इमेजिंग/ (a)डबल ट्रांसजेनिक CX3CR1GFP/+से माइक्रोग्लिया (ग्रीन) और डेंड्राइट्स (लाल)YFP की प्रतिनिधि दो फोटॉन छवि/ (बी-सी),बॉक्स्ड क्षेत्र की दैनिक छवियां(क)बार-बार इमेज्ड डेंड्राइट्स (बी में तीर) और माइक्रोग्लिया(सी)के साथ डेंड्राइट्स दिखा रही हैं । जबकि डेंड्रिटिक संरचनाएं स्थितिपूर्वक स्थिर थीं, कुछ माइक्रोग्लिया को बाद के दिनों में अपनी मूल स्थिति से स्थानांतरित करने के लिए नोट किया गया था। ऐसी कोशिकाओं की पहचान एक संख्या (1, 2 या 3) से की गई थी। पिछले दिन, उनकी स्थिति एक सफेद तारक के साथ नोट किया गया था और एक बाद के दिन, उनकी स्थिति एक पीले तारक के साथ उल्लेख किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कई महीनों के लिए CX3CR1GFP/+ चूहों में माइक्रोग्लिया की दीर्घकालिक साप्ताहिक इमेजिंग । (ए-एच),8 सप्ताह तक माइक्रोग्लियाल नेटवर्क को ट्रैक करने के लिए एक मोटे मील का पत्थर के रूप में तीव्रता से लेबल वाले वैक्यूलेचर (लाल, रोडामाइन, 2 मिलीग्राम/एमएल, आईपी) का उपयोग करके बार-बार इमेजिंग के दौरान एक CX3CR1GFP/+ माउस से माइक्रोग्लिया (ग्रीन) के प्रतिनिधि दो-फोटॉन छवियां । वैक्यूलेचर इमेजिंग अवधि के माध्यम से संरचनात्मक रूप से स्थिर था। वैक्यूलेचर (धराशायी सर्कल) के साथ तीन छोटे क्षेत्रों को माइक्रोग्लियल सोमता के आंदोलन (शीर्ष दो धराशायी हलकों) या उन क्षेत्रों से बाहर (नीचे सर्कल) में इंगित करने के लिए हाइलाइट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: बरामदगी के बाद CX3CR1GFP/+ चूहों में माइक्रोग्लिया की दीर्घकालिक दैनिक इमेजिंग । (ए-बी),माइक्रोग्लिया (ग्रीन) और वैक्यूलेचर (लाल, रोडामाइन, 2 मिलीग्राम/एमएल, आईपी) के तीव्र लेबलिंग के साथ एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र के दृश्य के एक ही क्षेत्र की दैनिक इमेजिंग के दौरान प्रतिनिधि दो-फोटॉन छवियां। इमेजिंग एक केमोकोन्वल्सिव एजेंट, कैनिक एसिड का उपयोग करके गंभीर दौरे के शामिल होने के बाद शुरू होती है। संवहनी संरचना को व्यक्तिगत संवहनी खंडों (तीर) के रूप में बनाए रखा गया था, जिसे समय (ए) के माध्यम से पहचाना जासकता है। हालांकि, दौरे के बाद पहले दो दिनों के दौरान माइक्रोग्लियल नेटवर्क गतिशीलता में वृद्धि हुई थी और तीसरे दिन(ख)तक सामान्य स्तर पर लौटता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: CX3CR1GFP/+में माइक्रोग्लिया और NG2+ कोशिकाओं की दैनिक इमेजिंग: NG2dsRed/+ चूहों । (क)वीवो में माइक्रोग्लिया (ग्रीन) और एनजी2+ कोशिकाओं (लाल) की एक प्रतिनिधि दो फोटॉन छवि । अवेलेबल वैक्यूलेचर एनजी 2 कोशिकाओं (पेरिसाइट्स, प्रकल्पित रूप से एरोहेड के साथ पहचाने जाने वाले) और एनजी 2 कोशिकाओं को वाकुलेचर (ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं या ओपीसी) से जुड़ा नहीं करता है, जो संभवतः तीरों से पहचाना जाता है। (ख)रोडामाइन के साथ लेबल वाले वैक्यूलेचर के साथ इमेजिंग के लगातार दिनों में माइक्रोग्लिया (ग्रीन) और एनजी 2+ कोशिकाओं (लाल) की प्रतिनिधि दो फोटॉन छवियां । पेरिसाइट्स (एरोहेड) स्थिर हैं जबकि ओपीसी गतिशील (सफेद से पीले तारक) हैं। माइक्रोग्लिया भी गतिशील हैं (सर्कल: धराशायी सर्कल माइक्रोग्लिया के बिना एक स्थिति का प्रतिनिधित्व करते हैं और भरे हुए सर्कल एक इसी माइक्रोग्लिया के साथ एक स्थिति का प्रतिनिधित्व करते हैं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वीवो दो फोटॉन इमेजिंग में आगमन ने स्वस्थ मस्तिष्क में होने वाली सेलुलर इंटरैक्शन और गतिशीलता की अधिकता का पता लगाने के अवसर खोले हैं। प्रारंभिक अध्ययनों में एक्यूट और क्रॉनिक इमेजिंग37,38दोनों द्वारा छवि न्यूरोनल डेन्ड्रिट्स के लिए खुली खोपड़ी क्रैनियोटॉमी दृष्टिकोण का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया गया था। इसका उपयोग मस्तिष्क में न्यूरोइम्यून इंटरैक्शन को स्पष्ट करने के लिए भी किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल कम या लंबी अवधि में समय की विस्तारित अवधि के लिए फ्लोरोसेंटली टैग कोशिकाओं (विशेष रूप से माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क की निवासी प्रतिरक्षा कोशिका) की विश्वसनीय इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन करता है। डाई-लेबल वाले संवहनी और/या फ्लोरोसेंटी टैग किए गए डेंड्राइट्स का उपयोग कोशिकाओं के दोहराए गए, विश्वसनीय इमेजिंग की अनुमति देने के लिए ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों के मोटे या ठीक मानचित्रण के लिए विस्तृत है । यद्यपि अजवायनYFP लाइन को ठीक मस्तिष्क मानचित्रण के लिए उपयोग करने का सुझाव दिया गया है, वैकल्पिक दृष्टिकोण अन्य तकनीकों या माउस लाइनों का उपयोग चुनिंदा न्यूरोनल आबादी जैसे गर्भाशय विद्युत आबादी को लेबल करने के लिए कर सकते हैं जैसे कि गर्भाशय विद्युतआबादी में 39,,40,प्रारंभिक प्रसवोत्तर एएवी इंजेक्शन41 या ट्रैप चूहों का उपयोग42। इसके अलावा, हालांकि कॉर्टिकल इमेजिंग इस चर्चा का केंद्र था, इस दृष्टिकोण को दीर्घकालिक और साथ ही43में गहरी मस्तिष्क संरचनाओं की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के लिए, प्रत्येक माउस पर सर्जरी प्रक्रिया संज्ञाहरण की शुरुआत से 30-60 मिनट में एनेस्थीसिया से वसूली तक पूरी की जा सकती है। सर्जरी के दौरान, खोपड़ी को ध्यान से हटा दिया जाता है और एक बाँझ कवरग्लास के साथ बदल दिया जाता है जिसे कम से कम दो सप्ताह के बाद दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए प्रत्यारोपित किया जाता है। मृत्यु दर अत्यंत दुर्लभ है (5% से कम) वाइल्डटाइप चूहों में, हालांकि P2Y12R नॉकआउट चूहों जैसे थक्के की समस्याओं के साथ चूहों, उच्च मृत्यु दर और सर्जरी विफलता दिखाते हैं। ऐसे चूहों में, रक्तस्राव लंबे समय तक जारी रह सकता है और चूहों संभवतः आंतरिक रक्तस्राव से जटिलताओं के कारण क्रैनिओटॉमी के पहले 48 घंटे के भीतर मर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल से प्रत्यारोपित खिड़कियों के साथ चूहों को संक्रमण के किसी भी संकेत को दिखाने के लिए नहीं देखा गया है और प्रोटोकॉल का उपयोग चूहों के 50-80% में दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए स्पष्ट खिड़कियां उत्पन्न करने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है।

वर्तमान पुरानी खिड़की प्रत्यारोपण दृष्टिकोण के लिए वैकल्पिक, पतली खोपड़ी दृष्टिकोण बरकरार मस्तिष्क में मस्तिष्क की कोशिकाओं को बार-बार कल्पना करने के लिए मौजूद है। कई अध्ययनों में खिड़की प्रत्यारोपण दृष्टिकोण 22 , 23,24 ,,24,2525पर पतली खोपड़ी दृष्टिकोण की पसंद के मूल्य और यहां तक कि प्राथमिकता पर प्रकाश डाला गया है ।23 उस दृष्टिकोण के वादे को नजरअंदाज नहीं किया जाना चाहिए, जब ठीक से किया जाता है, तो यह ग्लियल कोशिकाओं की सक्रियता की कमी, कताई के कम कारोबार जो अधिक शारीरिक है, और एंटी-भड़काऊ एजेंटों के उपयोग की आवश्यकता की कमी सहित वर्तमान दृष्टिकोण की कई प्रमुख सीमाओं या नुकसान का प्रतिकार करता है जो मस्तिष्क शरीर विज्ञान को भी प्रभावित कर सकता है। विशिष्ट अनुसंधान प्रश्नों के लिए एक दृष्टिकोण का चयन करने में, इन गंभीर सीमाओं को इस प्रोटोकॉल में विस्तृत दृष्टिकोण चुनने से पहले विचार किया जाना चाहिए ।

हालांकि इस दृष्टिकोण की अपील चार गुना है । सबसे पहले, कपाल खिड़की प्रत्यारोपण दृष्टिकोण पतली खोपड़ी प्रक्रिया के सापेक्ष इस प्रक्रिया की महारत की आसानी के कारण आकर्षक है। उपयुक्त खोपड़ी पतला हमेशा प्रयोगकर्ताओं द्वारा महारत हासिल नहीं किया जा सकता है और अगर अच्छी तरह से नहीं किया जाता है तो इसके परिणामस्वरूप इसकी अपील को सीमित करने के लिए ग्लियल सक्रियण हो सकता है। दूसरा, इस कपाल खिड़की प्रत्यारोपण दृष्टिकोण मस्तिष्क संरचनाओं की शक्तिशाली गहराई स्पष्टता देता है के रूप में मस्तिष्क एक ऑप्टिकली स्पष्ट खिड़की के माध्यम से छवि है । इमेजिंग के लिए उपलब्ध खिड़की भी आमतौर पर बहुत पतली खोपड़ी विश्लेषण के लिए ऊतक की एक बड़ी मात्रा के लिए उपयोग की अनुमति दृष्टिकोण में इस्तेमाल की तुलना में बड़ा है । तीसरा, गहराई स्पष्टता की तरह, यह दृष्टिकोण खिड़की के माध्यम से एक समान स्पष्टता के लिए अनुमति देता है क्योंकि ग्लास कवरलिप समान रूप से पतला और स्पष्ट है। यह सत्रों और जानवरों के बीच तुलना की सुविधा प्रदान करता है। दोहराया सत्र के दौरान और जानवरों के बीच खिड़की भर में भी स्पष्टता सुनिश्चित करने के लिए पतली खोपड़ी तकनीक के लिए विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता है । अंत में, यह दृष्टिकोण घंटों से इमेजिंग की आवृत्ति में बहुत लचीलापन प्रदान करता है, दिनों से हफ्तों से महीनों और यहां तक कि वर्षों तक। पतली खोपड़ी दृष्टिकोण के लिए, अधिकतम पांच दोहराता24का सुझाव दिया गया है ।

इस दृष्टिकोण के भविष्य के अनुप्रयोगों कई हैं। सबसे पहले, अनुप्रयोगों में सामान्य शरीर विज्ञान और विकृति दोनों में मस्तिष्क में उपन्यास न्यूरो-ग्लियो-वैस्कुलर इंटरैक्शन को स्पष्ट करना शामिल हो सकता है। दूसरा, हालांकि निवासी कोशिकाओं को इस प्रक्रिया में चर्चा कर रहे हैं, दृष्टिकोण गतिशीलता और प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जैसे, तीव्र चोट के दौरान, पुराने मस्तिष्क संक्रमण, और/ अंत में, इस दृष्टिकोण पर मुख्य रूप से मस्तिष्क की कोशिकाओं के संरचनात्मक अध्ययन के संदर्भ में चर्चा की गई है। हालांकि, कार्यात्मक इमेजिंग के आगमन के साथ जैसे कैल्शियम44,45, 46या वोल्टेज इमेजिंग तकनीक,47,,,48 का उपयोग करके, इस दृष्टिकोण का उपयोग स्वास्थ्य और रोग में समय के साथ कार्यात्मक इमेजिंग के लिए किया जा सकता है।48

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विचारों पर चर्चा करने के लिए Eyo प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम वर्जीनिया विश्वविद्यालय में किपनिस लैब से डॉ जस्टिन रुस्टेनहोवेन को एनजी 2डीएसरेड चूहों ३३के उपहार के लिए धन्यवाद देते हैं । यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर्स एंड स्ट्रोक ऑफ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ से यूएबीई (K22 NS104392) के वित्तपोषण द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass (3mm) Warner Instruments 64-0726
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) Amazon https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System Dental Health Products, Inc 910860-1
Dental Drill Osada: www.osadausa.edu EXL-M40
Drill Bit Fine Science Tools #19008-07
Eye Ointment Henry Schien 1338333
iBond Total Etch (Primer glue) Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) 66040094
Rhodamine B Millipore Sigma 81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue) Top Dent (Ivoclar Vivadent) #595956
Wahl Brav Mini+ Amazon https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 162 माइक्रोग्लिया न्यूरोइम्यून इमेजिंग दो फोटॉन वाक्यूलेचर डेन्ड्रेट्स एनजी 2 कोशिकाएं
चूहों में न्यूरो-इम्यून डायनेमिक्स के वीवो इमेजिंग में दोहराव करने के लिए सटीक ब्रेन मैपिंग
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Bisht, K., Sharma, K., Eyo, U. B.… More

Bisht, K., Sharma, K., Eyo, U. B. Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice. J. Vis. Exp. (162), e61454, doi:10.3791/61454 (2020).

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