Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Præcis brain mapping til at udføre gentagne In Vivo Imaging af Neuro-Immune Dynamics i mus

Published: August 7, 2020 doi: 10.3791/61454
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia, 2Department of Neuroscience, University of Virginia

Summary

Denne protokol beskriver en kronisk kraniel vindue implantation teknik, der kan bruges til langsgående billeddannelse af neuro-glio-vaskulære strukturer, interaktioner, og funktion i både sunde og syge betingelser. Det tjener som et supplerende alternativ til den transkranielle billeddannelse tilgang, der, mens ofte foretrækkes, har nogle kritiske begrænsninger.

Abstract

Centralnervesystemet (CNS) er reguleret af et komplekst samspil af neuronal, glia, stromale, og vaskulære celler, der letter dens rette funktion. Selv studere disse celler i isolation in vitro eller sammen ex vivo giver nyttige fysiologiske oplysninger; fremtrædende træk ved neuralcellefysiologi vil blive savnet i sådanne sammenhænge. Derfor er der behov for at studere neurale celler i deres oprindelige in vivo miljø. Protokollen detaljeret her beskriver gentagne in vivo to-foton billeddannelse af neurale celler i gnaver cortex som et redskab til at visualisere og studere specifikke celler over længere perioder fra timer til måneder. Vi beskriver i detaljer brugen af den groft stabile hjernevaskekulatur som et groft kort eller fluorescerende mærket dendritter som et fint kort over udvalgte hjerneregioner af interesse. Ved hjælp af disse kort som en visuel nøgle, viser vi, hvordan neurale celler kan præcist flyttes til efterfølgende gentagne in vivo imaging. Ved hjælp af eksempler på in vivo-billeddannelse af fluorescerende-mærket mikroglia, neuroner, og NG2+ celler, denne protokol viser evnen til denne teknik til at tillade gentagne visualisering af cellulære dynamik i samme hjerne placering over længere perioder, der kan yderligere støtte til at forstå de strukturelle og funktionelle reaktioner af disse celler i normal fysiologi eller efter sti fornærmelser. Hvor det er nødvendigt, kan denne tilgang kobles til funktionel billeddannelse af neurale celler, f.eks. Denne fremgangsmåde er især en kraftfuld teknik til at visualisere den fysiske interaktion mellem forskellige celletyper af CNS in vivo, når genetiske musemodeller eller specifikke farvestoffer med forskellige fluorescerende tags til at mærke de celler af interesse er tilgængelige.

Introduction

Centralnervesystemet (CNS) styres af et komplekst samspil mellem forskellige hjemmehørende celletyper, herunder neuroner, glia og kar-associerede celler. Traditionelt, neurale celler blev undersøgt i isolerede, co-kulturperler1,,2,,3,,4,,5 (in vitro) eller punkterede hjernevæv (ex vivo)6,,7,,8,,9,10 sammenhænge. Men der er behov for yderligere at forstå neurale celle adfærd og interaktioner i det oprindelige miljø af den intakte hjerne in vivo. I denne protokol beskriver vi en metode til at kortlægge in vivo-områder af interesse og præcist re-image disse regioner i fremtidige billedbehandlingssessioner for at spore de komplekse interaktioner mellem de forskellige CNS-celletyper over længere perioder.

Udviklingen af in vivo-billeddannelsesmetoder har givet betydelige gevinster for en korrekt forståelse af neural funktion11,12,13,14,15. Disse tilgange giver specifikt flere fordele i forhold til traditionelle in vitro- og ex vivo-metoder. For det første, in vivo billeddannelse systemer har fysiologisk relevante celle-og væv komponenter såsom vaskulaturen med det fulde repertoire af cellulære interaktioner til at give en komplet forståelse af neurale netværk fysiologi. For det andet, de seneste resultater tyder på, at når de fjernes fra deres oprindelige miljø, visse neurale celler (såsom mikroglia) mister vigtige elementer i deres identitet og dermed fysiologi16,17, som kan bevares i in vivo indstilling., For det tredje giver in vivo-billeddannelsessystemer mulighed for stabile langsgående undersøgelser fra uger til måneder for at studere CNS-celleinteraktioner. Endelig, i betragtning af den voksende dokumentation for bidrag fra det perifere immunsystem18,19 og mikrobiom20,21 i CNS fysiologi, in vivo-systemer giver en platform til at afhøre sådanne bidrag og virkninger på CNS-celler. Således tilgange, der anvender langsgående in vivo imaging at studere neuro-immune fysiologi og interaktioner i raske, sårede, og syge stater er en stor supplerende tilføjelse til traditionelle tilgange.

I denne protokol beskriver vi en pålidelig tilgang til billede forskellige celletyper i hjernen, herunder mikroglia, neuroner og NG2+ celler som eksempler. To tilgange til at visualisere neurale celler in vivo er blevet udviklet: den fortyndede kraniet tilgang og det åbne kranium med en kraniel vindue tilgang. Selv tyndet kraniet tilgange er i brug ogforetrækkes,fordi de overvinde nogle af ulemperne ved den åbne kraniet tilgang såsom gliacelle aktivering, højere end fysiologiske rygsøjlen dynamik og brugen af anti-inflammatoriske midler22,23,24,25, fortyndet kraniet tilgange viser også et par kritiske ulemper. For det første er udtyndingsproceduren en meget delikat procedure, som mange forskere har svært ved at perfektionere, især når genfortynding er nødvendig. Dette er tilfældet, fordi det ofte er vanskeligt for eksperimentatorer at fastslå, at de har fortyndet kraniet til en ~ 20 μm dybde. For det andet, for passende sammenligninger mellem mus, udtynding skulle være identiske og en række udtynding succes mellem billeddannelse sessioner eller mus kunne komplicere visualisering af neurale strukturer. For det tredje, når de anvendes til langsgående billeddannelse, dyr med fortyndede kranier kan kun bruges til et begrænset antal sessioner, når re-udtynding af kraniet er ansat. Forth, da nogle af knoglevævet stadig er tilbage, klarhed i dybden af billeddannelse kunne blive kompromitteret fra den fortyndede kraniet tilgang giver mulighed for stor visualisering af mere overfladisk, men ikke så meget med dybere regioner. I lyset af dette, dybere hjernestrukturer såsom hippocampus, kan ikke med held afbildet med den tyndede kraniet tilgang. Disse overvejelser rejser behovet for alternative og komplementære tilgange, der kan løse disse problemer.

Alternativ til den fortyndede kraniet tilgang, det åbne kranium vindue implantation tilgang bruger en procedure, hvor kraniet er erstattet med en optisk klar glas coverslip. Dette giver mulighed for et næsten ubegrænset antal billedbehandlingssessioner. Desuden, i betragtning af udskiftning af kraniet med glasset coverslip, denne metode giver mulighed for en klar visning vindue af fluorescerende mærkede hjerneceller i lange perioder fra timer til måneder, og derfor kan anvendes til at studere celleaktivitet og interaktioner, der er relevante for fysiologi, aldring og patologi.

Samlet set vi detaljer trin, der kan følges for at gøre implantat kronisk kraniel vinduer gennem en stereotaxic kraniotomi, der gør det muligt in vivo billeddannelse af hjernen regioner af interesse. Vi beskriver også, hvordan den groft stabile hjernevaskekulatur eller de fluorescerende mærket dendritter kan bruges til at generere et groft eller fint kort, henholdsvis af hjernen regioner af interesse. Denne fremgangsmåde kan derefter bruges til gentagne billedbehandling over flere sessioner. Betydningen af denne teknik, derfor ligger i dens evne til at billedet de langsigtede ændringer eller stasis i hjernen elementer, herunder arrangement, morfologi, og interaktioner af de forskellige cellulære typer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle trin er i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat og godkendt af institutional Animal Care and Use Committee of the University of Virginia.

1. Museforberedelse til kranievinduesimplantatering

BEMÆRK: Forskellige transgene muselinjer med lysstofmærker er velegnede til billeddannelse.

  1. Brug CX3CR1GFP/+ mus26 til at visualisere mikroglia in vivo. Typisk anvendes unge til unge voksne 4 til 10 uger gamle mus, der vejer 17-25 g.
    BEMÆRK: Selv om denne fremgangsmåde er endda egnet til præ-fravænnede mus, behovet for at returnere mus til deres bur med deres mødre til fodring, kan komplicere opsving, hvis moderen ikke tager tilstrækkelig pleje af hvalpe efter operationen. Derfor anbefales det at bruge mus efter fravænning.
  2. Bedøvelse musen ved hjælp af isofluran (5% flow i ilt til induktion i 1 min) i et bedøvelsesmiddel kammer. Kontroller, at musen ikke viser nogen bevægelse eller trækninger svar på tå og / eller hale klemmer. Tag musen ud af kammeret og i fri luft grundigt barbere håret på hovedet mellem ørerne fra omkring øjenhøjde til toppen af halsen regionen ved hjælp af en hårtrimmer.
    BEMÆRK: Koncentrationen af den anvendte isofluran afhænger af induktionskammerets størrelse. Derfor, for mindre kamre, 3-4% isofluran kan bruges til effektivt at fremkalde anæstesi, mens større kamre vil kræve op til 5%.
  3. Flyt musen til stereotaktisk kirurgi station næse kegle for anæstesi (1,5-2% for vedligeholdelse til operationen), stabilisere hovedet ved hjælp af ørestænger, og vedligeholde musen på en varmepude for at holde kropstemperaturen varm.
  4. Smør begge øjne med øjensalve. Indsprøjt 100 μL 0,25% bupivicain (for at give lokal analgesi til musen, der vil vare 8-12 timer) og 100 μL af 4 mg/ml dexamethason (for at reducere den inflammation, der kan skyldes operationen procedure) subkutant på incisionsstedet. Lad musen sidde i mindst 5 minutter, før du går videre til næste trin.
  5. Rengør det barberede hoved med tre vekslende podninger af betadin og 70% alkohol. Lav en midline hovedbund indsnit ved hjælp af kirurgiske klinge eller saks strækker sig fra bagsiden af kraniet regionen mellem ørerne til frontal området mellem øjnene. Den resterende hud er skåret til at udsætte kraniet.
  6. Rengør bindevævet mellem hovedbunden og det underliggende kranium med 3% hydrogenperoxid (H2O2)og lokalisere hjernen område, der skal afbildes med stereotaktiske koordinater.
    BEMÆRK: Der er ofte nogle blødninger (trin 1.5) fra snittet på kraniets overflade. Denne blødning normalt forsvinder af sig selv inden for 3-5 min. Rengøring med peroxid hjælper. Forudgående bupivacainbehandling (trin 1.4) bemærkes også for at begrænse mængden af blødning i denne periode.

2. Mus kraniel vindue implantation kirurgi

  1. Bor en cirkulær åbning ~ 4 mm ind i kraniet ved hjælp af en tandboremaskine (0,7 mm spids diameter) og forsigtigt fjerne denne del af kraniet ved hjælp af spidse tandsjet. Til billeddannelse den somatosensoriske cortex af 6-8-ugergamle mus, finde midten af kraniotomi på -2,5 posterior og ± 2,0 lateral til bregma. Under boring, regelmæssigt fugte kraniet med sterile saltvand og vatpinde til at køle hjernen, rense knoglerester og blødgøre kraniet knoglen til eventuel fjernelse.
    BEMÆRK: Koordinaterne for kraniotomien varierer afhængigt af området af interesse og musens alder.
  2. Når kraniet er fjernet, forsigtigt placere en lille coverglass (størrelse #0 på 0,1 ± 0,02 mm tykkelse) fugtet med saltvand i kraniotomi. Tør overskydende saltvand med en steril klud af.
  3. Ved hjælp af en spids applikator (såsom en pipette spids eller den spidse ende af en brækket træ vatpind stick), anvende cyanoacrylat lim omkring vinduet og lad det knytte til hjernen og kraniet. Påfør primer lim til resten af kraniet og helbrede det med en hærdning lys for 20-40 s. Forbered en brønd rundt om vinduet med den endelige lim og helbrede med en hærdning lys for 20-40 s.
  4. Lim en lille hovedplade på kraniet på kraniotomiens kontralaterale halvkugle først med primerlimen som primer og derefter med den endelige lim. Cure både med hærdning lys for 20-40 s hver.
    BEMÆRK: Suturer er ikke nødvendige, hvis kraniet er helt dækket med limen under denne procedure.

3. Pleje efter operationen

  1. Lad musen vågne op i mangel af anæstesi (nyttiggørelse udført på en varmepude forkorter restitutionstiden) og returnere den til sit hjem bur, når helt vågen. Indsprøjt en subkutan dosis buprenorphin SR (0,5 mg/kg) som postoperativ analgesi, der er tilstrækkelig til 72 timer.
  2. For at lette en sund genopretning fra operationen, give musen en ekstra blød mad, som kan være i form af regelmæssig fast chow i vand for at blødgøre chow eller mad i form af en gel.
    BEMÆRK: En engangsforsyning af den bløde mad umiddelbart efter operationen er tilstrækkelig.
  3. Overvåg musen dagligt for sundhed og korrekt genopretning for de første 72 timer af operationen procedure. Derefter skal du udføre billeddannelse fra så tidligt som 2 uger fra vinduesimplantatationsoperationen.
    BEMÆRK: Hvis det gøres godt, mus inddrive godt viser normal ambulant adfærd, tilstrækkelig bur udforskning, god hydrering, stabil vægtøgning og omfattende interaktioner med andre mus i buret og andre elementer i buret. Mus, der viser sløvhed, dehydrering og større end 10% vægttab efter operationen er aflivet og fjernet fra undersøgelsen.

4. To-foton hjerne kortlægning for indledende billeddannelse

  1. Anesthetize musen (Isoflurane, 5 % induktion og 1,5 % vedligeholdelse). Hovedet stabiliseres ved hjælp af skruer til montering af hovedpladen på mikroskopstadiet med to foton, der fastholdes på en varmeplade ved 35 °C. Intraperitoneal 100 μL blodkar farvestof såsom Rhodamin B (2 mg/ml).
    BEMÆRK: Imaging kunne også gøres i vågen mus uden anæstesi. Men, nylige undersøgelser tyder på, at anæstesi påvirker mikroglial overvågningdynamik 27,28,29 ogat hoved fiksering for to foton billeddannelse i vågen mus øger stress selv under kronisk billeddannelse i mindst 25 dage (se Juczewski et al., 2020)30.
  2. Rengør overfladen af kranievinduet forsigtigt ved hjælp af en vatpind dabbed i 70% ethanol. Put et par dråber vand eller saltvand på kranievinduet og sænke den objektive linse i løsningen, da målet er en nedsænkning linse.
  3. Håndtegne et groft kort for at betegne de store blodkar landemærker i en lab notesbog, mens du kigger gennem okularet ved epiflorescens. Brug denne tegning til at identificere de specifikke områder under to fotonbilleder. Alternativt kan du tage billeder af blodkarrene enten gennem et kamera monteret på mikroskopet eller via et håndholdt kamera eller telefon.
    BEMÆRK: Disse håndtegnede billeder og billeder skal gøre det lettere at revidere de samme brede områder under mikroskopet før to fotonbilleder. Disse er ikke præcise billede kortlægning.
  4. Under to foton billeddannelse, indsamle billeder af lysstofceller og fartøjer efter behov. Der skal tages nøje noter med passende koordinater for at sikre, at de præcise områder kan tages op til fornyet overvejelse med hensyn til efterfølgende billeddannelse. Indsamle flere synsfelter i denne første billeddannelse session f.eks erhverve z-stack billeder hver 1-2 μm gennem et volumen af væv.
    BEMÆRK: Mens indsamling af billeder af to foton, blodkarrene landemærker bruges til grov kortlægning. Hvis finkortlægning er nødvendig, anvendes YFP-mærket dendritter fra Thy1-YFP31 mus.
    1. Brug disse anbefalede parametre til billeddannelse: En bølgelængde på 880-900 nm er optimal; for gfp og/eller dsRed /Rhodamin excitation anvendes et dichroic spejl på 525/50 nm (grøn kanal) og 620/60 nm (rød kanal) emissionsfiltre for efFL-adskillelse og YFP-adskillelse anvendes et 509 nm dichroic spejl med 500/15 og 537/26 nm emissionsfiltre kraften i hjernen holdes på 25 mW eller derunder; billedopløsning er 1024 x 1024 pixels, synsfeltet taget med en 25X 0,9 NA mål på en 1,5 X zoomfaktor er 295,24 x 295,24 μm.
  5. I slutningen af billeddannelse, tage musen ud af scenen, gør det muligt at vågne op fra anæstesi og vende tilbage til sit hjem bur, indtil en fremtidig billeddannelse session.

5. To-foton billeddannelse og re-imaging

  1. For fremtidige efterfølgende billeddiagnostiske sessioner, som kunne være alt fra et par timer til måneder efter den første billeddannelse session, anesthetize musen (Isoflurane, 5% induktion og 1,5% vedligeholdelse), montere på to-foton mikroskop, vedligeholde på en varmeplade og re-injicere 100 μl et blodkar farvestof såsom Rhodamin B (2 mg /ml).
  2. Åbn de tidligere opnåede billeder i ImageJ, og ved hjælp af disse billeder samt noterne fra den foregående session skal du identificere de tidligere afbildede områder og omhyggeligt genbillede dem.
  3. Gentag dette, så længe billeddannelsesvinduet er klart eller så vigtigt for undersøgelsens omfang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at visualisere mikroglial dynamik in vivo blev der anvendt dobbelttransgen CX3CR1GFP/+:Thy1YFP mus. Thy1-YFP H-linjen anvendes i modsætning til Thy1-GFP M-linjen for at undgå overlapning af mikroglia (GFP) og neuroner (YFP). Alternative tilgange kunne bruge en reporter linje, hvor mikroglia er mærket med f.eks tdTomato og derefter Thy1-GFP M linje kan anvendes. En ulempe ved H-linjen er, at YFP etiketter en masse neuroner og etiketten stiger med stigende alder (personlig observation). M-linjen udstiller sparsom mærkning af neuroner. Mellem 2 – 4 uger af vinduesimplantatationsoperationen kan mikroglial dynamik efterfølges af gentagen billeddannelse. Store blodkar bruges til at lokalisere bestemte regioner og derefter YFP-mærket dendritter bruges til fin kortlægning af hjernen regioner. Med denne fremgangsmåde kan specifikke dendritter bruges som stabile landemærker til fin kortlægning af hjerneregioner (Figur 1, pile i figur 1b). Mens dendritter er stabile, nogle microglia flytte dagligt (Figur 1c).

Desuden er denne fremgangsmåde tilstrækkelig til ugentlig billeddannelse i længderetningen på lang sigt. Der blev således anvendt enkelte transgene CX3CR1GFP/+ mus til at følge mikroglia kombineret med intraperitoneale injektioner af Rhodamin B for at mærke vaskulaturen under hver billeddannelse i op til 8 uger (figur 2). Alternativt, som beskrevet ovenfor, Thy1 mus kunne anvendes til langsgående fin kortlægning. Når der udføres ugentlig billeddannelse, bemærkes vaskulaturen at være stabilt fastgjort, men mikroglia kan ses at være dynamisk som vist i tre specifikke områder af interesse (ROI, stiplede cirkler) i figur 2. I den øverste ROI, microglia begynder at indtaste ROI ved 4th uge af billeddannelse og fortsætte gennem den 8th uge af billeddannelse. I midten ROI med en togrenet fartøj, en mikroglial celle opstår omkring den nederste fartøj i den 3rd uge, er tabt på 6th uge og en anden mikroglia opstår på den øverste blodkar i den7 th uge og vedligeholdes i den 8. Endelig, i bunden ROI, en mikroglial celle i opretholdes gennem 6th uge og tabt i 7th og 8th uger af billeddannelse. Disse resultater indikerer dynamiske ændringer i det mikrogliale positionelle netværk over uger til måneder.

Denne fremgangsmåde kan også bruges til at undersøge cellulære dynamik efter akut skade eller under patologisk sygdomsprogression. Enkelttransgen cx3CR1GFP/+ mus blev anvendt til at følge mikroglia kombineret med intraperitoneale injektioner af Rhodamin B for at mærke vaskulaturen før (data ikke vist) og efter alvorlige anfald forårsaget af kainsyre (Figur 3). Efter anfald, den vaskulære seng struktur opretholdes uden overt perturbations (Figur 3a). Men det mikrogliale cellulære netværk og positionelle landskab er forbigående ændret (nogle celler er "vundet", og andre er "tabt" i synsfeltet) med større ændringer inden for 24-48 h af anfald, der er genoprettet til normal med 72 h (Figur 3b), som vi tidligere rapporteret32.

Endelig kan denne tilgang også bruges til at undersøge celle-celle interaktioner eller sammenligne dynamik mellem neurale celletyper. Dobbelt transgene CX3CR1GFP/+: NG2dsRed/+ mus blev brugt til at spore mikroglia og NG2+ celler in vivo. Uden mærkning af vaskulaturen kan mikroglia- og NG2-celler identificeres (Figur 4a). NG2 er en proteoglycan , der mærker både kar-associerede pericytter og oligodendrocyt prækursorceller (OPC)33,34. Pericytter typisk har aflange processer, der følger langs den vaskulære væg (formodede identificeret med pilespidser i figur 4a) og OPC'er typisk viser større celle organer, der bor i hjernen parenkym væk fra vaskulaturen (formodede identificeret med pile i Figur 4a). For at kunne skelne pericytter og OPC'er tilstrækkeligt, er vaskulaturen mærket med Rhodamin B. Den lysere lysstofskab af NG2+-fartøj associerede celler (pericytter, pilespidser) kan skelnes fra den svagere lysstof, luminal Rhodamin trods lignende excitation af to foton billeddannelse (Figur 4b, c). Daglig billeddannelse viser, at pericytter er stabilt placeret, mens OPC'er (stjerner i figur 4b) og mikroglia (cirkler i figur 4b) er dynamiske i overensstemmelse med tidligererapporter 32,35,36.

Figure 1
Figur 1: Daglig billeddannelse af mikroglia ved hjælp af finkortlægning med neuronal dendritter i dobbelttransgen CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-mus. (a)Repræsentativt tofotonbillede af mikroglia (grøn) og dendritter (rød) fra en dobbelt transgen CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-mus. (b-c), Daglige billeder af boxed region i (a) viser gentagne gange afbildet dendritter (pile i b) og dendritter med mikroglia (c). Mens dendritiske strukturer var positionalt stabile, blev nogle mikroglia bemærket for at translokere fra deres oprindelige position i de efterfølgende dage. Sådanne celler blev identificeret med et tal (1, 2 eller 3). Den foregående dag, deres position blev noteret med en hvid stjerne og på en efterfølgende dag, deres position blev noteret med en gul stjerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Langsigtet ugentlig billeddannelse af mikroglia i CX3CR1GFP/+ mus i flere måneder. (a-h), Repræsentant to-foton billeder af mikroglia (grøn) fra en CX3CR1GFP / + mus under gentagne billeddannelse ved hjælp af akut mærket vaskulatur (rød, Rhodamin, 2 mg / ml, i.p.) som en grov milepæl til at spore mikroglialt netværk i op til 8 uger. Vaskulaturen var strukturelt stabil gennem billeddannelsesperioden. Tre små regioner med vaskulaturen (stiplede cirkler) blev fremhævet for at angive bevægelsen af mikroglial somata i (top to stiplede cirkler) eller ud af (nederste cirkel) disse regioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Langsigtet daglig billeddannelse af mikroglia i CX3CR1GFP/+ mus efter krampeanfald. (a-b), Repræsentative to-foton billeder under daglig billeddannelse af samme synsfelt af en bestemt hjerne region med mikroglia (grøn) og akut mærkning af vaskulaturen (rød, Rhodamin, 2 mg /ml, i.p.). Imaging begynder efter induktion af alvorlige anfald ved hjælp af en kemoconvulsive agent, kainic syre. Den vaskulære struktur blev opretholdt som individuelle vaskulære segmenter (pile) kan identificeres gennem tiden (a). Mikroglialnetværksdynamikken blev imidlertid øget i løbet af de første to dage efter anfaldene og vender tilbage til det normale niveau på den tredje dag (b). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Daglig billeddannelse af mikroglia og NG2+ celler i CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ mus. aa) Et repræsentativt billede med to fotoner af mikroglia (grøn) og NG2+ celler (rød) in vivo. Den umærkede vaskulatur skelner ikke mellem NG2-celler (pericytter, formodede identificeret med pilespidser) og NG2-celler, der ikke er forbundet med vaskulaturen (oligodendrocytprækursorceller eller OPC'er, der formodes identificeret med pile). b) Repræsentative tofotonbilleder af mikroglia (grøn) og NG2+ celler (rød) i sammenhængende dage med billeddannelse med vaskulaturen mærket med rhodamin. Pericytter (pilespidser) er stationære, mens OPC'er er dynamiske (hvide til gule stjerner). Microglia er også dynamiske (cirkler: stiplede cirkler repræsenterer en position uden mikroglia og fyldt cirkel repræsenterer en position med en tilsvarende mikroglia). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fremkomsten af in vivo to-foton billeddannelse har åbnet muligheder for at udforske overflod af cellulære interaktioner og dynamik, der opstår i den sunde hjerne. Indledende undersøgelser fokuserede på at bruge den åbne kraniotomi tilgang til billedet neuronal dendritter af både akut og kronisk billeddannelse37,38. Dette kan også bruges til at belyse neuroimmune interaktioner i hjernen. Denne protokol beskriver en metode til pålidelig billeddannelse af fluorescerende mærkede celler (især mikroglia, den hjemmehørende immuncelle i hjernen) i længere tid på kort eller lang sigt. Brugen af farvestof-mærket vaskulære og / eller fluorescerende mærkede dendritter er detaljeret for grove eller fine kortlægning af hjernen regioner af interesse for at tillade gentagne, pålidelig billeddannelse af celler. Selv om Thy1YFP linje er foreslået til brug for fine hjerne kortlægning, alternative tilgange kunne bruge andre teknikker eller muselinjer til mærkning af udvalgte neuronale populationer såsom in utero elektroporation39,40, tidlige postnatale AAV injektioner41 eller brug af TRAP mus42. Selv om kortikal billeddannelse var i fokus i denne diskussion, kan denne tilgang tilpasses til at visualisere dybe hjernestrukturer på lang sigt samt43.

For denne protokol, kirurgi procedure på hver mus kan afsluttes i 30-60 min fra indledningen af anæstesi indtil inddrivelse fra anæstesi. Under operationen fjernes kraniet omhyggeligt og erstattes med et sterilt coverglass, som implanteres til langvarig billeddannelse efter mindst to uger. Dødelighed er yderst sjælden (mindre end 5 %) i wildtype mus, selvom mus med koagulationsproblemer, såsom P2Y12R knockout mus, viser højere dødelighed og kirurgi fiasko. Hos sådanne mus kan blødningen vare ved i længere tid, og mus kan dø inden for de første 48 timer af kraniotomien formentlig på grund af komplikationer fra indre blødninger. Mus med implanterede vinduer fra denne protokol er ikke blevet bemærket for at vise nogen tegn på infektion, og protokollen kan pålideligt bruges til at generere klare vinduer til langtidsscanning i 50-80% af mus.

Alternativ til den nuværende kroniske vindue implantation tilgang, den tynde kraniet tilgang eksisterer for at visualisere hjerneceller i den intakte hjerne gentagne gange. Flere undersøgelser har fremhævet værdien og endda prioriteringen af valget af den tynde kranietilgang over vinduesimplantatationsmetoden22,,23,24,25. Løftet om denne tilgang bør ikke ignoreres, da det, når det gøres ordentligt, modvirker flere fremtrædende begrænsninger eller ulemper ved den nuværende tilgang, herunder manglende aktivering af gliaceller, den lave omsætning af pigge, som er mere fysiologisk, og manglen på behov for brug af antiinflammatoriske midler, som også kan påvirke hjernens fysiologi. Ved udvælgelsen af en tilgang til specifikke forskningsspørgsmål bør disse alvorlige begrænsninger overvejes, før de vælger den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne protokol.

Appellen af denne fremgangsmåde er imidlertid firedoblet. For det første, kraniel vindue implantation tilgang er attraktiv på grund af den lethed beherskelse af denne procedure i forhold til den tynde kraniet procedure. Passende kranium udtynding kan ikke altid beherskes af eksperimentatorer og hvis ikke gjort godt kan resultere i glia aktivering begrænse sin appel. For det andet giver denne kraniel vinduesimplantatation tilgang kraftfuld dybde klarhed af hjernens strukturer som hjernen er afbildet gennem et optisk klart vindue. Vinduet til rådighed for billeddannelse er også normalt meget større end den, der anvendes i den tynde kraniet tilgang giver adgang til en større mængde væv til analyse. For det tredje, ligesom dybde klarhed, denne fremgangsmåde giver mulighed for en ensartet klarhed gennem vinduet, da glasset coverslip er ensartet tynd og klar. Dette letter sammenligninger mellem sessioner og mellem dyr. Særlig ekspertise er nødvendig for den tynde kraniet teknik for at sikre jævn klarhed på tværs af vinduet under gentagne sessioner og mellem dyr. Endelig giver denne tilgang stor fleksibilitet i hyppigheden af billedbehandling fra timer, dage til uger til måneder og endda år. For den tynde kraniet tilgang, højst fem gentagelser er blevet foreslået24.

Fremtidige anvendelser af denne tilgang er mange. For det første kan applikationer omfatte belysning af nye neuro-glio-vaskulære interaktioner i hjernen i både normal fysiologi og patologi. For det andet, selv om hjemmehørende celler diskuteres i denne procedure, kan tilgangen bruges til at studere dynamikken og interaktionerne i infiltrerende immunceller, som det sker, f.eks. Endelig er denne tilgang hovedsagelig blevet drøftet i forbindelse med strukturelle undersøgelser af hjerneceller. Men med fremkomsten af funktionelle billeddannelse fx ved hjælp af calcium44,,45,46 ellerspænding imaging teknikker47,48, denne fremgangsmåde kan bruges til funktionel billeddannelse over tid i sundhed og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer af Eyo lab for at diskutere de ideer, der præsenteres i dette manuskript. Vi takker Dr. Justin Rustenhoven fra Kipnis Lab på University of Virginia for gave NG2DsRed mus33. Dette arbejde er støttet af midler fra National Institute of Neurological Disorders and Stroke af National Institute of Health til U.B.E (K22 NS104392).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass (3mm) Warner Instruments 64-0726
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) Amazon https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System Dental Health Products, Inc 910860-1
Dental Drill Osada: www.osadausa.edu EXL-M40
Drill Bit Fine Science Tools #19008-07
Eye Ointment Henry Schien 1338333
iBond Total Etch (Primer glue) Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) 66040094
Rhodamine B Millipore Sigma 81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue) Top Dent (Ivoclar Vivadent) #595956
Wahl Brav Mini+ Amazon https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
  2. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  3. Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
  4. Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
  5. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
  6. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  7. Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
  8. Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
  9. Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
  10. Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
  11. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  12. Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
  13. Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
  14. Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
  15. Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
  16. Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
  17. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  18. Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
  19. Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
  20. Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
  21. Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
  22. Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
  23. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
  24. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  25. Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  26. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  27. Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
  28. Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
  29. Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  30. Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
  31. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  32. Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
  33. Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
  34. Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
  35. Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
  36. Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
  37. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  38. Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
  39. Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
  40. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
  41. Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
  42. Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
  43. Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
  44. Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
  45. Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
  46. Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
  47. Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
  48. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).

Tags

Immunologi og infektion microglia neuroimmune billeddannelse to-foton vaskulatur dendritter NG2 celler
Præcis brain mapping til at udføre gentagne In Vivo Imaging af Neuro-Immune Dynamics i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bisht, K., Sharma, K., Eyo, U. B.… More

Bisht, K., Sharma, K., Eyo, U. B. Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice. J. Vis. Exp. (162), e61454, doi:10.3791/61454 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter