Summary
Detta protokoll beskriver dissektion av neonatal dmp1-topaz muscalvaria och isolering av osteocyter som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet genom cellsmältning och fraktionering, förutom osteocytberedning för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
Abstract
Osteocyten, som en gång ansågs vara en passiv bosatt i benet med tanke på backstage-funktionen att känna av mekanisk belastning, kommer nu till rampljuset och har visat sig ha flera huvudfunktioner som att aktivt modifiera den extracellulära matrisen och bilda ett endokrint organ med lacunocanalicular systemet som omsluter det och skickar meddelanden till avlägsna platser. Tack vare de metoder som gjorde det möjligt att testa osteocyten in vitro från att isolera primära osteocyter till ostocytliknande cellinjer, upplever osteocyter nu ett rungande intresse och en ökning av kunskap om struktur och funktion. Många aspekter av osteocytbiologin och interaktionen med andra molekylära komponenter är ännu inte upptäckta. I detta protokoll beskriver vi i detalj den effektiva isoleringen av primära osteocyter från dmp1-topas neonatal muscalvaria, som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet i osteocyter, genom cellfraktionering och därefter förvärvar kulturer av primära osteocyter genom FACS.
Introduction
Osteocyter är terminalt differentierade celler från osteoblastiska föregångare som blev inbäddade i deras utsöndrade matris1. De är de vanligaste och längst levande cellerna bland bencellspopulationer. De bor inom lacunae och har en karakteristisk stellatmorfologi med dendriter som sträcker sig genom kanaler som kallas canaliculi och bildar ett omfattande nätverk av kommunikation och metaboliskt utbyte med sin omgivande miljö och benytan2. Osteocyter koreograferar både osteoblaster och osteoklaster roller i benombyggnad, de är de primära mekanosensoriska cellerna som ger anpassning till mekanisk belastning3, är involverade i fosfathomeostas4 och benmatrismineralisering5, och tillsammans med lacunocanalicular systemet fungerar de som ett endokrint organ som signalerar avlägsna vävnader6.
Osteocyter ligger inom en mineraliserad matris, vilket begränsar tillgängligheten och gör deras isolering utmanande, vilket hindrar in vitro-undersökning. En av de första isoleringsmetoderna beskrev isolerade osteocyter från kycklingkalvaria med användning av en osteocytspecifik monoklonal antikropp (OB7.3)7 som senare blev känd för att vara den aviära varianten av PHEX (PHosphate-reglerande gen med homologi till endopeptidaser på X-kromosomen)8. Andra forskare använde sekventiell nedbrytning av råtta 9 eller mus 10 långa ben för att erhålla osteocytrika fraktioner där osteocyterrenhet rapporterades vara cirka70%9. Begränsningar av denna procedur inkluderar den suboptimala renheten hos kulturer som är förorenade med andra celltyper förutom osteocyter och att osteocyter potentiellt kan övervuxna av andra celler i odling eftersom osteocyter har förlorat förmågan att dela sig. Dessa utmaningar begränsar användbarheten av långsiktiga kulturer.
För att övervinna dessa begränsningar utvecklades olika osteocytcellinjer. MLO-Y4-cellinjen11 och MLO-A5-cellinjen12 är särskilt de mest studerade cellinjerna som är användbara för studier av osteocyter i tidigt stadium; De är dock mindre användbara för att studera mogen osteocytsignalering eftersom de uttrycker låga nivåer av sklerostin och FGF2313, som båda är mogna osteocytmarkörer. Andra cellinjer, inklusive IDG-SW3 14 och Ocy45415, uttrycker höga nivåer av sklerostin och FGF23 och är användbara för att studera det sena arostocytstadiet. Cellinjer visar sig vara användbara forskningsverktyg; Ändå kommer de inte utan begränsningar eftersom de inte helt representerar biologin hos den primära cellen. Olika cellinjer representerar olika utvecklingsstadier av osteocytmognadsspektrumet, och cellinjer representerar inte heterogeniteten hos primära osteocyter16,17.
För att erhålla rena kulturer av primära osteocyter utnyttjade forskare cre-musmodellen där 8-kb dmp1-promotorn används för att driva grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck i osteocyter18,19. Dubbla transgena möss (pOB-Col 2.3- GFP-cyan och DMP1-GFP-topas) av Paic et al.19 och dmp1-topaz transgena möss av Nakashima et al.20 har använts för att erhålla osteocytpopulationer. I vilken de använde sekventiell matsmältning och FACS av osteocyter som uttrycker GFP för att förvärva kulturer av primära osteocyter19,20. Riktningen för cre i 10-kb dmp1-reportermusen Ai9, som aktiverar tdTomato-proteinet, visade sig vara närvarande i osteocyter, osteoblaster, muskler och celler i benmärgen. 8-kb dmp1-promotorn hade samma uttrycksmönster, men endast en andel osteoblaster och benmärgsceller uttryckte proteinet, vilket indikerar att 8-kb dmp1-promotorn är mer specifik21. Trots detta bör resultat som erhållits med hjälp av 8-kb dmp1-promotorn tolkas med försiktighet, och genuttrycksprofiler bör rutinmässigt utföras med användning av osteocyt kontra osteoblastspecifika markörer för att säkerställa att den erhållna populationen är av tillräckligt hög renhet.
Osteoklastmarkörer OSCAR och Dcstamp hittades i hematopoetiska icke-utarmade kontra utarmade osteocytpopulationer, detta fynd ledde författarna till slutsatsen att smälter erhållna från fraktionering av 8-kb dmp1-topaz neonatal calvaria och GFP-sortering är förorenade med hematopoetiska celler. Kontaminering med hematopoetiska celler kunde ha mildrats genom att dra åt GFP-sorteringsporten eftersom GFP-positiva hematopoetiska celler hade en rimligt lägre GFP-intensitet än GFP-positiva mesenkymala celler (osteocyter)22.
Metoderna för att studera osteocyter in vitro har bidragit till den senaste tidens mängd information om osteocytbiologi. Osteocytisolering är emellertid fortfarande ett arbetsintensivt och långvarigt förfarande med låga cellutbyten. Den beskrivna metoden för benförtunning med användning av kollagenas och EDTA, ofta upp till fraktion 823, tar flera timmar där osteocytlivskraften beskattas. Forskare har rapporterat att man använder fraktioner (2\u20125) för cellsortering 20, och har visat att uttrycksprofilen för gener associerade med osteocyter kontra osteoblaster bekräftar framgången med att isolera rena arostocytpopulationer20. I den här artikeln beskriver vi processen för att erhålla fraktioner (2-125), och vi jämför utbytet av osteocyter från varje fraktion som börjar med fraktion 1 till 8 för att bestämma återkomsten av osteocyter i varje fraktion. Vi beskriver också dissektion av nyfödd dmp1-topas muscalvaria och calvarial digestion med användning av kollagenas och etylendiamintetraättiksyra (EDTA), samt beredning av celler för FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök och djurvård utfördes i enlighet med Tohoku University regler och förordningar.
1. Dissektion av nyfödda dmp1-topas muscalvaria
- För detta protokoll, använd 6\u20127 dagar gamla ungar av C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J möss. Avliva möss med 5% isofluran inhalation och överför sedan ungarna till 70% etanol.
- Överför den avlivade valpen till en obehandlad odlingsrätt.
- Använd sax och pincett, ta tag i huden vid basen av skallen och gör ett snitt.
- Använd det första snittet som utgångspunkt, skär på båda sidosidorna av skallen framför öronen, ta bort huden och exponera calvaria.
- Håll huvudet från näsbryggan och skär calvaria längs lambdoidsuturen. Skär längs sidokanterna på parietalbenen och förläng den för att inkludera den främre delen.
- Separera calvaria från den underliggande hjärnvävnaden.
OBS: För att säkerställa en ren benig calvaria med minimal mjukvävnadsfäste skär inte djupt in i benet; Som referens bör man kunna se saxens skugga under benet. - Överför calvaria till fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4 genom hela protokollet). Se till att den konkava delen är vänd uppåt.
2. Fraktionering av nyfödd muskalvaria
- Överför upp till 5 calvariae till ett 50 ml koniskt rör innehållande 5 ml 2 mg/ml kollagenaslösning. Använd färsk kollagenaslösning beredd strax före användning.
- För att bereda en färsk kollagenaslösning, tillsätt kollagenaspulver till isoleringsbufferten (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 5 mg/ml glukos och 25 mM HEPES) vid2mg/ml. Lös upp kollagenaspulvret på en magnetomrörare.
- Kör kollagenaslösningen genom en 0,22 μm steril filterenhet i ett 50 ml rör och håll den på is under hela protokollet.
- Inkubera calvaria vid 37 °C i 20 minuter i en shaker vid 300 rpm så att fraktion 1 erhålls.
- Kassera uppslutningen av fraktion 1, tvätta calvaria med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och kassera tvätten.
- Inkubera calvaria i 5 ml 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) innehållande 1 mg/ml BSA i PBS, PH 7,4 vid 37 °C i 15 minuter i en shaker vid 300 rpm.
- Samla upp uppslutningen i ett 50 ml koniskt rör. Tvätta calvaria med 5 ml PBS och tillsätt tvättlösningen till matsmältningen.
OBS: Vid varje punkt för uppsamling av röta och tvättning, pipettera benen i deras lösning för att lossa cellerna från benet och för att förhindra dubbletter och cellaggregat. - För att erhålla fraktion 2, centrifugera uppslutningen vid 300 x g vid 4 °C i 5 minuter. Kassera supernatanten, suspendera pelleten igen i 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 IE / ml penicillin G och 100 μg / ml streptomycin. Frö på en 10 cm kulturfat. Inkubera fraktion 2 vid 37 °C under 5 %CO2.
- Inkubera calvaria i 5 ml kollagenaslösning vid 37 °C i 20 minuter i en shaker vid 300 rpm.
- Om du vill samla in bråk 3 upprepar du steg 2.5\u20122.6. Inkubera fraktion 3 vid 37 °C under 5 %CO2.
OBS: Vid denna tidpunkt kommer benen att bli mindre, och de kommer att reduceras till fragment. För att säkerställa att inga ben av misstag sugs in i smältorna, vilket leder till cellförlust i processen, använd en liten spetspipett för att samla upp smältorna (1000-00 μL pipettspetsar). - Inkubera calvaria i 5 ml kollagenaslösning vid 37 °C i 20 minuter i en shaker vid 300 rpm.
- Om du vill samla in bråktal 4 upprepar du steg 2.5\u20122.6. Inkubera fraktion 4 vid 37 °C under 5 %CO2.
- Inkubera calvaria i 5 ml 5 mM EDTA innehållande 1 mg/ml BSA i PBS (pH 7,4) vid 37 °C i 15 minuter i en shaker vid 300 rpm.
- Om du vill samla in bråktal 5 upprepar du steg 2.5\u20122.6. Inkubera fraktion 5 vid 37 °C under 5 %CO2. Osteocyter kan förberedas för sortering samma dag eller odlas upp till 24 h före sortering.
3. Beredning av osteocyter för fluorescensaktiverad cellsortering
- Aspirera mediet i varje cellfraktion och tvätta försiktigt med 10 ml PBS två gånger.
- Tillsätt 5 ml 0,5% trypsin-EDTA i PBS och inkubera cellerna i 5 minuter vid 37 ° C. Tillsätt 5 ml 10% FBS α-MEM och pipett för att lossa cellerna försiktigt. Kombinera cellerna i varje fraktion genom att sikta genom en 40 μm cellsil till ett 50 ml koniskt centrifugrör.
- Tvätta cellerna med 10 ml PBS och samla genom siktning genom en 40 μm cellsil i ett 50 ml koniskt centrifugrör. Centrifugera cellerna vid 300 x g vid 4 °C i 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 10% FBS α-MEM till pelleten. Justera cellkoncentrationen till cirka 1 x 107 celler/ml.
- Filtrera cellerna i ett 35 μm nylonnättäckt rör. Cellerna är nu redo för FACS.
- För detta protokoll, använd ett munstycke på 100 μm. Uppsamlingsvätskan ska bestå av 10% FBS α-MEM. Håll provet sorterat under omrörning och vid 4 °C under hela sorteringen om möjligt.
- Före sorteringen optimerar du grinden för att ta bort artefakter och celler genom att justera SSC-området (Side Scatter) och FSC-området (Forward Scatter). Eliminera dubbletter genom att justera SSC-bredd vs SSC-höjd och FSC-area vs FSC-bredd. GFP-negativa osteocyter bör användas som en kontroll för att justera parametrarna för sorteringsinstrumentet.
- När cellinsamlingen är klar centrifugeras cellerna vid 300 x g vid 4 °C i 10 minuter. Tvätta celler med PBS. Centrifugera cellerna vid 300 x g vid 4 °C i 5 minuter.
- Återsuspendera cellerna och justera antalet efter önskemål med 10% FBS α-MEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med detta protokoll är att demonstrera processen för att erhålla kulturer av primära osteocyter från dmp1-topas neonatal muscalvaria genom en fraktioneringsprocess med användning av kollagenas för att bryta ner kollagenmatrisen och EDTA för kalciumkelering, varefter celler förbereds för FACS för att separera osteocyter från andra cellpopulationer.
Metoder för att erhålla primära osteocyter från neonatal muscalvaria beskriver ofta användningen av fraktioner (1\u20128) för sortering23. För att testa effektiviteten av denna metod jämförde vi utbytet av osteocyter erhållna från en dmp1-topas muscalvaria, med början från fraktionerna 1 till 8. Fraktionerna 1\u20128 sorterades separat för att bestämma procentandelen och utbytet av osteocyter från varje fraktion. Efter sorteringen odlade vi osteocyter i 24 timmar på en 96-brunnsplatta för att jämföra densiteten hos de sådda cellerna. Tätheten av osteocyter i fraktionerna 2\u20125 visar sig vara högre än för fraktion 1, och osteocytdensiteten börjar minska anmärkningsvärt i fraktionerna 6, 7 och 8 (figur 1A).
Även om procentandelen osteocyt erhållen bland alla fraktioner inte är statistiskt signifikant (figur 1B), skiljer sig tätheten av osteocyter dramatiskt. Forskare20 har rapporterat användningen av fraktioner 2-5 för att isolera osteocyter via FACS, och vi visar i figur 1 att användning av fraktioner 2-5 optimerar processen för att erhålla osteocyter och minskar tiden för sorten.
Figur 2 visar antalet celler och grindstrategi som praktiserades för att isolera GFP-positiva från GFP-negativa celler där celler erhållna genom fraktionering av GFP-negativ muscalvaria användes som kontroll. Osteocyter erhållna genom denna metod analyserades för genuttryck av Dmp1 och SOST, vilka är kända osteocytmarkörer. Dmp1- och SOST-mRNA-uttryck är högre i osteocyter jämfört med försorteringsfraktion 2, vilket är känt som en hög osteoblastfraktion (figur 3A). Figur 3B visar morfologin hos en GFP-positiv osteocyt som behåller en stellatform med dendriter som sträcker sig från cellkroppen odlad i 24 timmar på en plastodlingsskål efter sortering.
Figur 1: Effektivitet av osteocytfraktionering. (A) Mikroskopiska bilder av tätheten av osteocyter från fraktionerna 1\u20128 sådda på en 96-brunnsplatta fångad efter 24 timmar av det slaget. Fraktionerna 2\u20125 har högre celldensitet än fraktionerna 1 och 6\u20128. Skalstapel = 100 μm. (B) Procentandel osteocyter erhållna från fraktionerna 1\u20128 mätt med flödescytometerprogramvaran. Resultaten härleds från tre separata representativa experiment. Data presenteras som ett medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Isolering av GFP-positiva osteocyter via fluorescensaktiverad cellsortering. Den övre panelen representerar celler isolerade från GFP-negativ C57Bl/6J kullmatcalvaria som GFP-tröskelkontroll. Den nedre panelen representerar antalet celler och grindkontroll som praktiseras för att isolera GFP-positiva osteocyter från GFP-negativa celler i fraktion 2 erhållen från dmp1-topazmuskalvaria. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Karakterisering av osteocyter efter sortering. (A) Relativt mRNA-uttryck av Dmp1 och SOST av fraktion 2-celler odlade i 24 timmar och osteocyter odlade i 24 timmar efter sortering. Data presenteras som ett medelvärde ± standardavvikelse. Statistiska skillnader upptäcktes med hjälp av Students t-test: * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Mikroskopisk bild av en osteocyt som håller kvar dendriter som sträcker sig utåt från cellkroppen odlad i 24 timmar efter sortering. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den första isolerade osteocyten var från en kycklingcalvaria7 isolerad med användning av (OB7.3) eller den avianta varianten av PHEX; Denna metod begränsas dock av tillgången på fungerande antikroppar, eftersom osteocytspecifika antikroppar som också är speciespecifika måste tillverkas. Forskare använde en annan modifiering av den sekventiella enzymatiska processen för att erhålla osteocyter från mus och råtta långa ben; Den rapporterade renheten hos dessa kulturer fastställdes till cirka 70 %9. Utvecklingen av cre-musmodellen möjliggjorde tekniska osteocyter, som uttrycker GFP på deras yta. Denna musmodell, tillsammans med FACS, användes för att erhålla rena kulturer av primära osteocyter20.
Vi utelämnar användningen av fraktionerna 1 och fraktionerna 6\u20128 eftersom små mängder osteocyter lossnar i dessa fraktioner. Användning av fraktioner 2\u20125 ger bästa möjliga utbyte av osteocyter under kortast möjliga bearbetningstid; Detta begränsar hanteringstiden för osteocyter och arbetar för att förhindra celldöd eller en eventuell förändring i cellsignalering som ett resultat av den stress cellen utsätts för under fraktionering. Vi odlar också osteocyter för 24 h försortering, vilket som standard utesluter icke-vidhäftande suspensionsceller (hematopoetiska celler) under sorteringsberedning. Detta minimerar kontaminering av hematopoetiska celler som uttrycker GFP22. Arbetsflödet som tillhandahålls i detta protokoll utnyttjar tidigare publicerade metoder23 och förkortar tiden av det slag som möjliggör en effektiv och snabb osteocytåterhämtning med minimal kontaminering.
Kritiska steg i protokollet inkluderar att få en ren benig calvaria och trimma mjukvävnad från hjärnan eller bindväv fäst vid benet för att begränsa kontaminering av vidhäftande celler (fibroblast och neurala celler). Dessutom är pipettering av cellerna under steg som inkluderar att erhålla och tvätta smälterna avgörande, eftersom cellaggregat och dubbletter läses som avfall under sortering och kommer att bidra till ett lågt utbyte av osteocyter.
Osteocyter kan sorteras utan tidigare kultur. Detta innebär emellertid att ett högre antal celler måste sorteras, vilket ökar tiden för sorten och ökar risken för hematopoetisk kontaminering. Detta kan mildras genom att applicera hematopoetisk cellutarmning försortering. Detta är dock beskattande och rekommenderas inte för rutinmässig och satslaboratorieanalys22. Problem kan uppstå vid sortering på grund av närvaron av stora cellaggregat och dubbletter som täpper till vätskeflödet i sorteringsmaskinen. I vårt protokoll har detta inte varit ett problem, men detta kan lösas genom att minska FBS-innehållet i sorteringsbufferten (mindre än 10%).
Detta protokoll kommer inte utan begränsningar. Denna metod använder musosteocyter, som inte helt liknar mänskliga osteocyter. Detta begränsar utvidgningen av resultaten som erhållits genom att studera murina osteocyter till meningsfulla kliniska resultat. Protokoll för isolering av mänskliga osteocyter har beskrivits24, och forskare uppmuntras att använda de cellarter som bäst tjänar sina mål. Som med andra protokoll är kvantiteterna osteocyter erhållna med hjälp av detta protokoll begränsade, och ett stort antal möss krävs för storskalig analys, men genom att minska den tid som behövs för beredning och sortering av osteocyter kan högre mängder celler förvärvas inom en enda tidsram.
Osteocyter erhållna genom denna process kan användas för vidare odling och samodling, genuttrycksanalys, nedströmsanalys av substrataktivering / hämning, molekylär sondering och färgningsapplikationer. Primära celler kan också användas för att konstruera en 3D-arostocytmatrismodell som liknar den ursprungliga osteocytiska miljön för studier av mekanotransduktion och mekanosensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett JSPS KAKENHI-bidrag från Japan Society for the Promotion of Science (nr 19K10397 till H.K. och nr 18K09862 till I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
- Bonewald, L. F.
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
- Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
- Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
- Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
- Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
- Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
- Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
- Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
- Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
- Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
- Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
- Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).
