Summary
Bu protokol, floresan aktive hücre sıralama (FACS) için osteosit hazırlığına ek olarak, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve yeşil floresan proteinini hücre sindirimi ve fraksiyonasyonu yoluyla eksprese eden osteositlerin izolasyonunu açıklar.
Abstract
Bir zamanlar mekanik yüklemeyi algılamanın sahne arkası işlevi göz önüne alındığında kemiğin pasif bir sakini olduğu düşünülen osteosit, şimdi spot ışığına çıkarılmıştır ve hücre dışı matrisi aktif olarak modifiye etmek ve uzak bölgelere mesaj gönderen lakunokanaliküler sistemle endokrin bir organ oluşturmak gibi birçok önemli fonksiyona sahip olduğu gösterilmiştir. Osteositi in vitro olarak primer osteositlerin izole edilmesinden osteosit benzeri hücre hatlarına kadar test etmeyi mümkün kılan yöntemler sayesinde, osteositler şimdi yankılanan bir ilgi ve yapı ve işlev hakkında bilgi artışı yaşamaktadır. Osteosit biyolojisinin birçok yönü ve diğer moleküler bileşenlerle etkileşimi henüz keşfedilmemiştir. Bu protokolde, osteositlerdeki yeşil floresan proteinini eksprese eden dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositlerin hücre fraksiyonasyonu yoluyla ve daha sonra FACS ile primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi yoluyla etkili izolasyonunu ayrıntılı olarak açıklayacağız.
Introduction
Osteositler, salgılanan matriks1'e gömülmüş osteoblastik progenitörlerden terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Kemik hücresi popülasyonları arasında en bol ve en uzun yaşayan hücrelerdir. Lakunalar içinde bulunurlar ve kanalikül adı verilen kanallar boyunca uzanan dendritlerle karakteristik bir yıldız morfolojisine sahiptirler ve çevrelerindeki çevre ve kemik yüzeyi2 ile geniş bir iletişim ve metabolik değişim ağı oluştururlar. Osteositler hem osteoblastların hem de osteoklastların kemik yeniden şekillenmesindeki rollerini koreografi yaparlar, mekanik yükleme3'e adaptasyon sağlayan birincil mekanosensoriyel hücrelerdir, fosfat homeostazı4 ve kemik matriks mineralizasyonundarol alırlar 5 ve lakunokanaliküler sistemle birlikte uzak dokuları işaret eden endokrin bir organ görevi görürler6.
Osteositler, erişilebilirliği sınırlayan ve izolasyonlarını zorlaştıran, böylece in vitro araştırmayı engelleyen mineralize bir matris içinde yer almaktadır. İlk izolasyon yöntemlerinden biri, daha sonra PHEX'in kuş varyantı olarak bilinen osteosit spesifik bir monoklonal antikor (OB7.3)7 kullanarak tavuk kalvarisinden izole osteositleri tanımlamıştır (X kromozomundaki Endopeptidazlara homoloji ile PHosfat düzenleyici gen)8. Diğer araştırmacılar, osteosit saflığının yaklaşık% 70 olduğu bildirilen osteosit bakımından zengin fraksiyonlar elde etmek için sıçan9 veya fare10 uzun kemiklerinin sıralı sindirimini kullandılar9. Bu prosedürün sınırlamaları, osteositlerin yanı sıra diğer hücre tipleriyle kontamine olmuş kültürlerin optimal olmayan saflığını ve osteositlerin bölünme yeteneğini kaybettiği için osteositlerin kültürdeki diğer hücreler tarafından potansiyel olarak büyüyebileceğini içerir. Bu zorluklar uzun vadeli kültürlerin kullanılabilirliğini kısıtlamaktadır.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı osteosit hücre hatları geliştirilmiştir. MLO-Y4 hücre hattı11 ve MLO-A5 hücre hattı12, özellikle erken evre osteositlerin incelenmesi için yararlı olan en yaygın olarak çalışılan hücre hatlarıdır; Bununla birlikte, her ikisi de olgun osteosit belirteçleri olan düşük sklerostin ve FGF2313 seviyelerini ifade ettikleri için olgun osteosit sinyallemesini incelemek için daha az faydalıdırlar. IDG-SW314 ve Ocy45415 dahil olmak üzere diğer hücre hatları, yüksek seviyelerde sklerostin ve FGF23 eksprese eder ve geç osteosit evresinin incelenmesinde yararlıdır. Hücre hatlarının yararlı araştırma araçları olduğu kanıtlanmıştır; Bununla birlikte, birincil hücrenin biyolojisini tam olarak temsil etmedikleri için sınırlama olmaksızın gelmezler. Farklı hücre hatları, osteosit olgunluk spektrumunun farklı gelişim aşamalarını temsil eder ve hücre hatları, primer osteositlerin heterojenliğini temsil edemez16,17.
Primer osteositlerin saf kültürlerini elde etmek için araştırmacılar, osteositlerde yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu yönlendirmek için 8-kb dmp1 promotörünün kullanıldığı cre fare modelinden yararlandılar18,19. Paic ve ark.19 tarafından çift transgenik fareler (pOB-Col 2.3- GFP-camgöbeği ve DMP1-GFP-topaz) ve Nakashima ve ark.20 tarafından dmp1-topaz transgenik fareler osteosit popülasyonları elde etmek için kullanılmıştır. Primer osteositlerin kültürlerini elde etmek için GFP'yi ifade eden osteositlerin sıralı sindirim ve FACS'sini kullandılar19,20. TdDomates proteinini aktive eden 10 kb dmp1 muhabir fare Ai9'daki cre yönünün, osteositlerde, osteoblastlarda, kaslarda ve kemik iliğindeki hücrelerde mevcut olduğu gösterilmiştir. 8-kb dmp1 promotörü aynı ekspresyon modeline sahipti, ancak osteoblastların ve kemik iliği hücrelerinin sadece bir kısmı proteini ifade etti, bu da 8-kb dmp1 promotörünün daha spesifik21 olduğunu gösteriyor. Buna rağmen, 8-kb dmp1 promotörü kullanılarak elde edilen sonuçlar dikkatle yorumlanmalı ve elde edilen popülasyonun yeterince yüksek saflıkta olmasını sağlamak için osteosit ve osteoblasta özgü belirteçler kullanılarak gen ekspresyon profilleri rutin olarak gerçekleştirilmelidir.
Osteoklast belirteçleri OSCAR ve Dcstamp, hematopoetik tükenmemiş ve tükenmiş osteosit popülasyonlarında bulundu, bu bulgu yazarları 8-kb dmp1-topaz yenidoğan kalvarisinin fraksiyonasyonundan ve GFP ayıklamasından elde edilen sindirimlerin hematopoetik hücrelerle kontamine olduğu sonucuna götürdü. GFP-pozitif hematopoetik hücreler GFP-pozitif mezenkimal hücrelerden (osteositler)22 oldukça düşük GFP yoğunluğuna sahip olduklarından, GFP sıralama kapısının sıkılaştırılmasıyla hematopoetik hücrelerle kontaminasyon azaltılabilirdi.
Osteositleri in vitro olarak incelemek için kullanılan yöntemler, osteosit biyolojisi hakkındaki son zamanlardaki bilgi zenginliğine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, osteosit izolasyonu, düşük hücre verimi ile emek yoğun ve uzun süren bir prosedür olmaya devam etmektedir. Kollajenaz ve EDTA kullanılarak sıklıkla fraksiyon 823'e kadar tarif edilen kemik sindirim yöntemi, osteosit canlılığının vergilendirildiği birkaç saat sürer. Araştırmacılar, hücre sıralaması 20 için fraksiyonlar (2\u20125) kullandıklarını bildirmişlerdir ve osteositlerle ilişkili genlerin osteoblastlarınkilere karşı ekspresyon profilinin, saf osteosit popülasyonlarının izole edilmesinin başarısını doğruladığını göstermiştir20. Bu makalede, fraksiyon elde etme sürecini (2\u20125) açıklayacağız ve her fraksiyondaki osteositlerin geri dönüşünü belirlemek için fraksiyon 1 ila 8 ile başlayan her fraksiyondan osteositlerin verimini karşılaştırıyoruz. Ayrıca, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve kollajenaz ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanılarak kalvaryal sindirimin yanı sıra FACS için hücrelerin hazırlanmasını da tanımladık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri ve hayvan bakımı, Tohoku Üniversitesi kural ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Yenidoğan dmp1-topaz fare calvaria'nın diseksiyonu
- Bu protokol için, C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J farelerinin 6\u20127 günlük yavrularını kullanın. Fareleri% 5 izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın ve daha sonra yavruları% 70 etanol'e aktarın.
- Ötanazi yapılan yavruyu tedavi edilmemiş bir kültür kabına aktarın.
- Makas ve cımbız kullanarak, kafatasının tabanındaki cildi tutun ve bir kesi yapın.
- İlk insizyonu başlangıç noktası olarak kullanarak, kafatasının her iki lateral tarafını kulakların önünde kesin, cildi çıkarın ve kalvariyi açığa çıkarın.
- Kafayı burun köprüsünden tutun ve lambdoid sütür boyunca kalvariyi kesin. Parietal kemiklerin yanal kenarları boyunca kesin ve ön kısmı içerecek şekilde genişletin.
- Kalvariyi altta yatan beyin dokusundan ayırın.
NOT: Minimal yumuşak doku ekine sahip temiz bir kemikli kalvari sağlamak için kemiğin derinliklerine kesilmemelidir; referans olarak, kemiğin altındaki makasın gölgesini görebilmelidir. - Kalvariyi fosfat tamponlu saline aktarın (protokol boyunca PBS, pH 7.4). İçbükey kısmın yukarı baktığından emin olun.
2. Yenidoğan fare kalvarisinin fraksiyonasyonu
- 5 mL 2 mg/mL kollajenaz çözeltisi içeren 50 mL'lik bir konik tüpe 5 kalvariye kadar aktarın. Kullanımdan hemen önce hazırlanan taze kollajenaz çözeltisini kullanın.
- Taze bir kollajenaz çözeltisi hazırlamak için, 2 mg / mL'de izolasyon tamponuna (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl2, 1 mg / mL sığır serum albümini (BSA), 5 mg / mL glikoz ve 25 mM HEPES) kollajenaz tozu ekleyin. Kollajenaz tozunu manyetik bir karıştırıcı üzerinde çözün.
- Kollajenaz çözeltisini 0,22 μm'lik steril bir filtre ünitesinden 50 mL'lik bir tüpe çalıştırın ve protokol boyunca buz üzerinde tutun.
- Kesir 1'i elde etmek için kalvariyi 37 ° C'de 20 dakika boyunca 300 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- Fraksiyon 1'in sindirimini atın, kalvariyi 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve yıkamayı atın.
- PBS'de 1 mg/mL BSA içeren 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 15 dakika boyunca 37 °C'de PH 7.4 içeren 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içindeki kalvariyi inkübe edin.
- Sindirimi 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın. Kalvariyi 5 mL PBS ile yıkayın ve yıkama solüsyonunu sindirime ekleyin.
NOT: Sindirimin toplanması ve yıkanmasının her noktasında, hücreleri kemikten ayırmak ve çiftleri ve hücre agregalarını önlemek için kemikleri çözeltilerinde pipetleyin. - Fraksiyon 2'yi elde etmek için, sindirimi 5 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı atın, peleti% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 IU / mL penisilin G ve 100 μg / mL streptomisin içeren 8 mL α-Minimum Esansiyel Ortamda (MEM) tekrar askıya alın. 10 cm'lik bir kültür kabına tohumlayın. Fraksiyon 2'yi 37 ° C'de% 5 CO2 altında inkübe edin.
- Kalvariyi 37 ° C'de 5 mL kollajenaz çözeltisi içinde 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Kesir 3'ü toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 3'ü 37 °C'de %5 CO2 altında inkübe edin.
NOT: Bu noktada kemikler küçülecek ve parçalara ayrılacaktır. Hiçbir kemiğin yanlışlıkla sindirimlere aspire edilmemesini ve bu da süreçte hücre kaybına yol açmamasını sağlamak için, özetleri toplamak için küçük bir uç pipeti kullanın (1000\u2012200 μL pipet uçları). - Kalvariyi 37 ° C'de 5 mL kollajenaz çözeltisi içinde 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Kesir 4'ü toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 4'ü 37 °C'de %5 CO2 altında inkübe edin.
- Kalvariyi, PBS'de (pH 7.4) 1 mg/mL BSA içeren 5 mL 5 mM EDTA'da, 37 °C'de 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Kesir 5'i toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 5'i 37 °C'de %5 CO2 altında inkübe edin. Osteositler aynı gün sıralama için hazırlanabilir veya sıralamadan önce 24 saate kadar kültürlenebilir.
3. Floresan aktive hücre sıralaması için osteositlerin hazırlanması
- Her hücre fraksiyonunun ortamını aspire edin ve iki kez 10 mL PBS ile nazikçe yıkayın.
- PBS'ye 5 mL% 0.5 Tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri nazikçe ayırmak için 5 mL% 10 FBS α-MEM ve pipet ekleyin. Her fraksiyondaki hücreleri, 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne eleyerek birleştirin.
- Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne elenerek toplayın. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı aspire edin ve pelete% 10 FBS α-MEM ekleyin. Hücre konsantrasyonunu yaklaşık 1 x 107 hücre/mL'ye ayarlayın.
- Hücreleri 35 μm naylon ağ kapaklı bir tüpte filtreleyin. Hücreler artık FACS için hazırdır.
- Bu protokol için 100 μm boyutunda bir nozul kullanın. Toplama sıvısı %10 FBS α-MEM'den oluşmalıdır. Numuneyi karıştırma sırasında ve mümkünse sıralama boyunca 4 °C'de tutun.
- Sıralamadan önce, yan saçılma (SSC) alanını ve ileri saçılma (FSC) alanını ayarlayarak yapıları ve hücreleri kaldırmak için geçidi en iyi duruma getirin. SSC genişliğini SSC-Yüksekliğine ve FSC alanını FSC-genişliğine göre ayarlayarak çiftleri ortadan kaldırın. GFP-negatif osteositler, sıralama cihazının parametrelerini ayarlamak için bir kontrol olarak kullanılmalıdır.
- Hücre toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj edin. PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
- Hücreleri yeniden askıya alın ve %10 FBS α-MEM kullanarak sayıyı istediğiniz gibi ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün amacı, kalsiyum şelasyonu için kollajen matriksini ve EDTA'yı parçalamak için kollajenaz kullanan bir fraksiyonasyon işlemi yoluyla dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi sürecini göstermektir, bundan sonra hücreler FACS'ın osteositleri diğer hücre popülasyonlarından ayırması için hazırlanır.
Yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositler elde etme yöntemleri genellikle23'ü sıralamak için fraksiyonların (1\u20128) kullanımını tanımlar. Bu yöntemin etkinliğini test etmek için, 1 ila 8 fraksiyonlarından başlayarak bir dmp1-topaz fare kalvarisinden elde edilen osteositlerin verimini karşılaştırdık. Fraksiyonlar 1\u20128, her fraksiyondan osteositlerin yüzdesini ve verimini belirlemek için ayrı ayrı sıralandı. Sıralamadan sonra, tohumlanan hücrelerin yoğunluğunu karşılaştırmak için osteositleri 96 delikli bir plaka üzerinde 24 saat boyunca kültürledik. Fraksiyon 2\u20125'teki osteositlerin yoğunluğunun fraksiyon 1'den daha yüksek olduğu gösterilmiştir ve osteosit yoğunluğu fraksiyon 6, 7 ve 8'de belirgin bir şekilde azalmaya başlar (Şekil 1A).
Tüm fraksiyonlar arasında elde edilen osteosit yüzdesi istatistiksel olarak anlamlı olmasa da (Şekil 1B), osteositlerin yoğunluğu önemli ölçüde farklılık göstermektedir. Araştırmacılar20 , FACS yoluyla osteositleri izole etmek için fraksiyon 2\u20125 kullanımını bildirmişlerdir ve Şekil 1'de fraksiyonların 2\u20125 kullanılmasının osteosit elde etme sürecini optimize ettiğini ve türün süresini azalttığını gösteriyoruz.
Şekil 2 , GFP-negatif fare kalvarisinin fraksiyonasyonu yoluyla elde edilen hücrelerin kontrol olarak kullanıldığı GFP-pozitif hücreleri GFP-negatif hücrelerden izole etmek için uygulanan hücre sayısını ve geçit stratejisini göstermektedir. Bu yöntemle elde edilen osteositler, osteosit belirteçleri olarak bilinen Dmp1 ve SOST'un gen ekspresyonu için analiz edildi. Dmp1 ve SOST mRNA ekspresyonları, osteositlerde, yüksek osteoblast fraksiyonu olarak bilinen ön sıralama fraksiyonu 2 ile karşılaştırıldığında daha yüksektir (Şekil 3A). Şekil 3B , GFP-pozitif bir osteositin morfolojisini, plastik bir kültür kabı post sortunda 24 saat boyunca kültürlenen hücre gövdesinden uzanan dendritlerle yıldız şeklini koruduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Osteosit fraksiyonasyonunun etkinliği. (A) 1\u20128 fraksiyonlarından osteositlerin yoğunluğunun mikroskobik görüntüleri, türün 24 saatinden sonra yakalanan 96 delikli bir plaka üzerine tohumlanır. Kesirler 2\u20125, kesirler 1 ve 6\u20128'den daha yüksek hücre yoğunluğuna sahiptir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Akış sitometre yazılımı tarafından ölçülen 1\u20128 fraksiyonlarından elde edilen osteositlerin yüzdesi. Sonuçlar üç ayrı temsili deneyden elde edilmiştir. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GFP-pozitif osteositlerin floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama yoluyla izolasyonu. Üst panel, GFP eşik kontrolü olarak GFP-negatif C57Bl / 6J çöp arkadaşı kalvaryasından izole edilen hücreleri temsil eder. Alt panel, dmp1-topaz fare kalvarisinden elde edilen fraksiyon 2'de GFP-pozitif osteositleri GFP-negatif hücrelerden izole etmek için uygulanan hücre sayısını ve geçit kontrolünü temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Osteosit karakterizasyonu sonrası sıralama. (A) 24 saat boyunca kültürlenmiş fraksiyon 2 hücrelerinin Dmp1 ve SOST'unun göreceli mRNA ekspresyonu ve 24 saat sonrası sıralama için kültürlenmiş osteositler. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. İstatistiksel farklılıklar Student t-testi kullanılarak saptandı: * p < 0.05, **p < 0.01. (B) 24 saat sonra kültürlenmiş hücre gövdesinden dışarıya doğru uzanan dendritleri tutan bir osteositin mikroskobik görüntüsü. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlk izole osteosit, (OB7.3) veya PHEX'in kuş düşmanı varyantı kullanılarak izole edilen bir tavuk calvaria 7'dendi; Bununla birlikte, bu yöntem, uygulanabilir antikorların mevcudiyeti ile sınırlıdır, çünkü aynı zamanda türe özgü olan osteosit spesifik antikorların üretilmesi gerekir. Araştırmacılar, fare ve sıçan uzun kemiklerinden osteositler elde etmek için sıralı enzimatik işlemin farklı bir modifikasyonunu kullandılar; Bu kültürlerin bildirilen saflığı yaklaşık% 70 olarak belirlenmiştir9. Cre fare modelinin geliştirilmesi, yüzeylerinde GFP'yi ifade eden mühendislik osteositlerine izin verdi. Bu fare modeli, FACS ile birlikte, primer osteositlerin saf kültürlerini elde etmek için kullanıldı20.
Fraksiyon 1 ve fraksiyon 6\u20128 kullanımını atlıyoruz, çünkü bu fraksiyonlarda az miktarda osteosit çıkıyor. 2\u20125 fraksiyonlarının kullanılması, en kısa işlem süresi boyunca osteositlerin mümkün olan en iyi verimini verir; Bu, osteositlerin kullanım süresini sınırlar ve hücre ölümünü veya hücrenin fraksiyonasyon sırasında maruz kaldığı stresin bir sonucu olarak hücre sinyalizasyonunda olası bir değişikliği önlemeye yönelik çalışır. Ayrıca, 24 saat ön sıralama için osteositleri kültürlüyoruz, bu da varsayılan olarak, sıralama hazırlığı sırasında yapışkan olmayan süspansiyon hücrelerini (hematopoetik hücreler) hariç tutuyor. Bu, GFP22'yi eksprese eden hematopoetik hücreler tarafından kontaminasyonu en aza indirir. Bu protokolde sağlanan iş akışı, daha önce yayınlanmış yöntem23'ten yararlanır ve minimum kontaminasyonla verimli ve hızlı bir osteosit iyileşmesine izin veren sıralama süresini kısaltır.
Protokoldeki kritik adımlar, temiz bir kemikli kalvari elde etmeyi ve yapışkan hücrelerin (fibroblast ve sinir hücreleri) kontaminasyonunu sınırlamak için beyinden veya kemiğe bağlı bağ dokusundan yumuşak dokunun kesilmesini içerir. Ayrıca, sindirimin elde edilmesini ve yıkanmasını içeren adımlar sırasında hücrelerin pipetlenmesi çok önemlidir, çünkü hücre agregaları ve çiftleri sıralama sırasında atık olarak okunur ve düşük osteosit verimine katkıda bulunur.
Osteositler önceden kültür olmadan sıralanabilir. Bununla birlikte, bu, daha fazla sayıda hücrenin sıralanması gerektiği, türün süresini arttırdığı ve hematopoetik kontaminasyon olasılığını arttırdığı anlamına gelir. Bu, hematopoetik hücre tükenmesi ön sıralaması uygulanarak hafifletilebilir. Bununla birlikte, bu vergilendiricidir ve rutin ve toplu laboratuvar analizleri için önerilmez22. Büyük hücre agregalarının varlığı ve ayıklama makinesinin sıvı akışını tıkayan çiftlerin varlığı nedeniyle sıralama sırasında sorun ortaya çıkabilir. Protokolümüzde bu bir sorun olmamıştır, ancak bu, sıralama arabelleğinin FBS içeriğini azaltarak (% 10'dan az) çözülebilir.
Bu protokol sınırlama olmaksızın gelmez. Bu yöntem, insan osteositlerine tamamen benzemeyen fare osteositlerini kullanır. Bu, murin osteositlerinin incelenmesiyle elde edilen sonuçların anlamlı klinik sonuçlara genişletilmesini kısıtlar. İnsan osteositlerinin izolasyonu için protokollertanımlanmıştır 24 ve araştırmacılar hedeflerine en iyi hizmet eden hücre türlerini kullanmaya teşvik edilmektedir. Diğer protokollerde olduğu gibi, bu protokol kullanılarak elde edilen osteosit miktarları sınırlıdır ve büyük ölçekli analiz için çok sayıda fare gereklidir, ancak osteositlerin hazırlanması ve sıralanması için gereken süreyi azaltarak, tek bir zaman diliminde daha yüksek miktarlarda hücre elde edilebilir.
Bu işlemle elde edilen osteositler, daha ileri kültür ve ko-kültür, gen ekspresyon analizi, substrat aktivasyonu / inhibisyonunun aşağı akış analizi, moleküler problama ve boyama uygulamaları için kullanılabilir. Birincil hücreler, mekanotransdüksiyon ve mekanosensing çalışması için doğal osteositik ortama benzeyen bir 3D osteosit matris modeli oluşturmak için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği'nden bir JSPS KAKENHI hibesi ile desteklenmiştir (No. 19K10397'den H.K.'ye ve No. 18K09862'den I.M.'ye).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
- Bonewald, L. F.
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
- Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
- Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
- Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
- Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
- Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
- Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
- Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
- Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
- Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
- Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
- Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).
