Minsta volym förglasning av omogna felintocyter
Summary
Detta manuskript beskriver ett protokoll för minsta volym förglasning av omogna katt oocyter med laboratorietillgjorda medier på kommersiella stöd. Det täcker varje steg från oocyte isolering från ex vivo gonads till förglasning och uppvärmning.
Abstract
I vilda djur bevarande program, gamete banking är avgörande för att skydda genetiska resurser för värdefulla individer och sällsynta arter och för att främja bevarandet av biologisk mångfald. I felids, de flesta arter hotas av utrotning, och inhemska raser används som en modell för att öka effektiviteten i protokoll för germplasm bank. Bland oocyte cryopreservation tekniker, förglasning är mer och mer populärt i mänskliga och veterinära assisterad reproduktion. Cryotop förglasning, som först utvecklades för mänskliga äggceller och embryon, har visat sig vara väl lämpad för katt äggceller. Denna metod erbjuder flera fördelar, såsom genomförbarheten i fältförhållanden och hastigheten på förfarandet, vilket kan vara till hjälp när flera prover behöver bearbetas. Effektiviteten är dock starkt beroende av operatörens kompetens, och intra- och inter-laboratory standardisering behövs, samt personalutbildning. Detta protokoll beskriver minsta volym förglasning av omogna felint äggceller på ett kommersiellt stöd i ett steg för steg fält-vänlig protokoll, från äggcell samling till uppvärmning. Efter protokollet, bevarande av äggcell integritet och lönsamhet vid uppvärmningen (så hög som 90%) kan förväntas, även om det fortfarande finns utrymme för förbättringar i mognads- och embryonala utvecklingsresultat efter uppvärmningen.
Introduction
Kryobevarande har blivit ett viktigt steg i assisterad reproduktionsteknik (ARTs). Hos människor, Det tillåter bevarande av fertilitet eller uppskjutande av föräldraskap för medicinska eller personliga skäl. Hos djur är det nödvändigt att övervinna avstånd och tid i planerade parningar, särskilt hos husdjur och husdjur, eller att bevara genetiskt material av värdefulla ämnen i bevarandeprogram, särskilt i vilda utrotningshotade arter. Gamete cryopreservation är det bästa valet när de individer som ska födas upp inte har valts ännu eller för att undvika etiska frågor i samband med embryo frysning, särskilt i humanmedicin1. Spermatozoa är relativt lätt att bevara och ge tillfredsställande resultat efter upptining, men äggceller, på grund av deras strukturella egenskaper, kan vara mer komplicerat att lagra. Faktum är att den låga ytan / volym förhållandet, liksom förekomsten av zona pellucida kring ooplasma, begränsar förflyttning av cryoprotectants och vatten över cellen2. Dessutom, hos husdjur inklusive kattdjur, de kännetecknas av en lipid-rik cytoplasma, som tros göra dem mer känsliga för kryokonservering3.
De flesta felids hotas, och den inhemska katten används som en modell för att utveckla protokoll för germplasm bevarande tack vare tillgången på gonads från rutinmässiga ovariectomy. Hos vilda djur kan könsceller erhållas efter valbara operationer eller (oftare) obduktion,och omogna (germinal vesicle) könsceller kan hämtas. Hormonell stimulering som syftar till att erhålla mogna (metafas II) äggceller är inte lika vanligt som i mänskliga ARTs på grund av de etiska frågorna och art- och individspecifika svar på behandlingar4.
Därför har utvecklingen av cryopreservation strategier fokuserat på omogna könsceller, som vanligtvis kan hämtas efter den oväntade eller plötsliga död sällsynta individer. Ur biologisk synvinkel finns det vissa skillnader i kryokonservering av omogna eller mogna könsceller, var och en har sina fördelar. För det första är DNA mer skyddat i omogna äggceller, vars germinal vesikel innehåller kromosomer omgivna av ett kärnmembran, medan den meiotiska spindeln av metafas II-äggceller kan vara mer sårbara för kryoinjuries5. För det andra kan kallinducerad cytoskelettetor skador påverka spindelrotation, polar kroppsextrudering, pronuclear migration och cytokinesi, som kan ha olika effekter beroende på äggcell utvecklingsfas, påverkar meios progression eller post-befruktning händelser. Slutligen, och kanske viktigast av allt, medan mogna äggceller är redo att befruktas, är omogna könsceller beroende av stöd från de omgivande cumuluscellerna för att gå igenom nukleär och cytoplasmatisk mognad6, och detta är anledningen till att hela cumulus-okulorkomplex (COCs) kryopreserveras. Förlusten av cumulusceller och/eller förlusten av funktionell anslutning mellan gameten och de omgivande somatiska cellerna är dock förmodligen den mest skadliga effekten av kryobevarande av omogna COC.
Bland kryobevarande tekniker är förglasning en som lättare kan appliceras i fältförhållanden. Jämfört med långsam (eller kontrollerad hastighet) frysning, förglasning är snabbare och kräver inte särskild utrustning, såsom en programmerbar frys. För att uppfylla de tre grundläggande principerna för förglasning (dvs. hög viskositet, kopplad till hög kryoprotectant koncentration, små volymer och ultra-snabb temperaturminskning), flera medier och stöd särskilt har utvecklats och använts i katter för både omogna och mogna äggceller. Från och med enkla sugrör7,enheter utvecklades sedan för att nå “Minsta volym” mål. Cryoloop8, öppna dragna sugrör (OPS)9, plast rännor (modifierad halm)10 och cryotubes11 har använts, tills en effektivare enhet (dvs Cryotop) användes11, förbättra överlevnad och meiosis återupptagande. Cryotop (Supplemental Figur 1) är ett kommersiellt tillgängligt stöd som har blivit det valbara öppna systemet för förglasning. Utvecklad för förglasning av mänskliga äggceller och embryon, består den av en liten filmremsa fäst vid en hård plasthållare, skyddad av ett plaströr lock under lagring12. Tack vare dess användbarhet och den extrema minskningen av förglasningsvolymen (så lite som 0,1 μL), vilket också leder till extremt snabb kylning och uppvärmning, har detta stöd för förglasning alltmer tillämpats på flera arter, inklusive den inhemska katten, där den har använts med en mängd olika medier13,,14,15,,16,17.
Syftet med detta manuskript är att beskriva en samling-förglasning-uppvärmning protokoll, med mindre ändringar från den som ursprungligen utvecklades för mänskliga äggceller, som använder laboratorietillverkade medier och kommersiella stöd för minsta volym förglasning och kan enkelt tillämpas i fältförhållanden för kryoreservation av omogna katt-COCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oocyte cryopreservation är en avgörande bakterieplasm bevarande teknik, särskilt i taxa där många arter är utrotningshotade, såsom Felidae familj. I detta manuskript presenterades ett enkelt och fältvänligt protokoll för förglasning av omogna kattoocyter. Laboratorietillhandagivna medier, minsta volymförglaseringsstöd och utbildad personal är de viktigaste faktorerna för att denna metod ska lyckas, vilket gör det möjligt att erhålla livskraftiga äggceller konsekvent och upprepade gånger, vilket framg?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 och av Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Vi vill också tacka Dr MariaGiorgia Morselli för hennes bidrag till de experiment som härmed skildras och till bildförvärv.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility – Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
