Summary
بعد العدوى الفيروسية, الكلى المرافئ عددا كبيرا نسبيا من CD8+ الخلايا T ويوفر فرصة لدراسة غير المخاطية Tالخلايا RM. هنا، نحن وصف بروتوكول لعزل الخلايا الليمفاوية الكلى الماوس لتحليل تدفق الخلايا.
Abstract
الأنسجة المقيمة الخلية T (TRM)هو حقل سريع التوسع من بحوث المناعة. عزل الخلايا التائية من الأنسجة غير اللمفاوية المختلفة هي واحدة من الخطوات الرئيسية للتحقيق TRMs. هناك اختلافات طفيفة في بروتوكولات عزل الخلايا الليمفاوية لمختلف الأعضاء. الكلى هو جهاز أساسي غير اللمفي مع العديد من اختراق الخلايا المناعية خاصة بعد التعرض لمسببات الأمراض أو تنشيط المناعة الذاتية. في السنوات الأخيرة، بدأت مختبرات متعددة بما في ذلك منطقتنا تميز الكلى مقيم CD8+ الخلايا التائية في مختلف الإعدادات الفسيولوجية والمرضية في كل من الماوس والإنسان. بسبب وفرة الخلايا الليمفاوية T، الكلى يمثل جهاز نموذج جذاب لدراسة TRMs في الأنسجة غير المخاطية أو غير الحاجز. هنا، سوف نصف بروتوكول يستخدم عادة في TRM-مختبرات تركز على عزل CD8+ الخلايا T من الكلى الماوس بعد العدوى الفيروسية الجهازية. باختصار، باستخدام فيروس التهاب الكورميات اللمفاوية الحاد (LCMV) نموذج العدوى في C57BL/6 الفئران، ونحن نبرهن على CD8 داخل الأوعيةالدموية + T الخلايا التسميات، والهضم الأنزيمية، وكثافة الانحدار الطرد المركزي لعزل وإثراء الخلايا الليمفاوية من الكلى الماوس لجعل العينات جاهزة لتحليل تدفق الخلايا اللاحقة.
Introduction
تمثل الخلايا التائية الخلايا النسيجية المقيمة (TRM)واحدة من أكثر الخلايا T في وفرة في الفئران البشرية المصابة والبالغة. TRM الخلايا توفير الخط الأول من الدفاع المناعي وتشارك بشكل حاسم في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية1,2,3,4,5. مقارنة مع الخلايا T المتداولة، TRM الخلايا تحمل علامات سطح متميزة مع برامج النسخ فريدة من نوعها6،7،8. توسيع معرفتنا ببيولوجيا TRM هو المفتاح لفهم استجابات الخلايا التاتية التي تعتبر ضرورية لتطوير اللقاحات و العلاج المناعي في المستقبل.
بالإضافة إلى العلامات الجزيئية المشتركة المشتركة من TRMs عبر جميع الأنسجة غير اللمفاوية ، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن السمات الخاصة بالأنسجة هي مكون مركزي من مادة البرمجة9. الكلى المرافئ العديد من الخلايا المناعية بما في ذلك خلاياجمهورية مقدونيا T بعد العدوى، ويوفر فرصة كبيرة لدراسة الخلايا TRM البيولوجيا في الأنسجة غير المخاطية. LCMV الحاد (التهاب الكورميات اللمفاوية فيروس) العدوى عن طريق الطريق intraperitoneal هو نموذج العدوى النظامية راسخة لدراسة استجابات الخلايا التائية المستضدية محددة في الفئران. وعادة ما يتم حل العدوى في 7-10 أيام في الفئران من النوع البري وترك عدد كبير من الخلايا T الذاكرة LCMV محددة في مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك الكلى10. P14 TCR (T cell receptor) الفئران المعدلة وراثيا تحمل CD8+ T الخلايا تعترف واحدة من epitopes المناعي المهيمنة من LCMV التي قدمها MHC-I (الفئة الأولى الرئيسية مجمع الهس القدرة على المنافسة) جزيء H2-Db في C57BL/6 الفئران. الجمع بين congenically P14 T نقل بالتبني الخلية وعدوى LCMV في الفئران، CD8+ effector والذاكرة الخلايا T يتم تتبعها، بما في ذلك TRM التمايز و homeostasis.
في بعض الأنسجة الحاجز، مثل الغدد الليمفاوية داخل الأمعاء (IEL) مقصورات الغدد اللعابية، أنشئت عملية عزل الخلايا الليمفاوية تسفر عن نسبة عالية من خلايا TRM مع الحد الأدنى من التلوث الخلايا T المنقولة بالدم في نموذج LCMV الماوس11. ومع ذلك، في الأنسجة غير الحاجز، مثل الكلى، شبكة الأوعية الدموية الكثيفة يحتوي على عدد كبير من الخلايا CD8+ T تعميم. وقد تم توثيقها جيدا أنه حتى perfusion ناجحة لا يمكن أن إزالة بكفاءة جميع تعميم CD8+ الخلايا T. للتغلب على هذه العقبة التقنية ، تم تأسيس تلطيخ الأجسام المضادة داخل الأوعية كواحد من التقنيات الأكثر استخدامًا في TRM مختبرات12. وباختصار، قبل 3-5 دقائق من القتل الرحيم، يتم تسليم 3 ميكروغرام/فأرة مضادة للأجسام المضادة CD8 (لتسمية CD8+ T cells) عن طريق الوريد. جدار الأوعية الدموية سليمة يمنع الانتشار السريع للجسم المضاد في غضون هذه الفترة القصيرة من الزمن (أي 3-5 دقائق) ويتم تسمية الخلايا داخل الأوعية فقط. بعد بروتوكول عزل الخلايا الليمفاوية القياسية، يمكن تمييز الخلايا داخل الأوعية مقابل الخلايا الإكستائية بسهولة باستخدام عملية استئصال الخلايا المتدفقة.
هنا، سوف نصف بروتوكول قياسي يستخدم عادة في مختبراتT RM لأداء وضع العلامات داخل الأوعية الدموية، والعزل اللمفاوي وتحليل تدفق الخلايا الخلوية CD8+ الخلايا التائية باستخدام C57BL/6 الماوس الذي تلقى CD45.1+ P14 الخلايا T و LCMV العدوى قبل 30 يوما13. ويمكن استخدام نفس البروتوكول لدراسة كل من الخلايا التي تؤثر على الجسم والذاكرة T في الكلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن تتم الموافقة على جميع التجارب الحيوانية التي يتم إجراؤها بعد هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامها المؤسسية المعنية (IACUC). وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات المذكورة هنا من قبل IACUC UT الصحة سان انطونيو.
1. نقل بالتبني من الخلايا T P14 إلى C57BL/6 المتلقين و LCMV العدوى
- استخدام الفئران P14 في 6-12 أسابيع من العمر. تأكد من أن جنس الماوس المحورة وراثيا P14 P14 يجب أن تتطابق مع جنس الفئران المتلقي C57BL/6. خلاف ذلك، فإن خلايا مثل الخلايا التائية الذكور نقل إلى الفئران الإناث سيؤدي إلى رفض بالمناعة بوساطة من الخلايا التائية المانحة المتداولة في حوالي 12 يوما14.
- تنقية سذج CD8+ الخلايا التائية من الطحال والغدد الليمفاوية من الماوس P14 TCR تحويلية باستخدام ماوس CD8+ T خلية T مجموعة تنقية بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
- بإيجاز، تشريح الطحال والغدد الليمفاوية، الهريس العينات لتوليد تعليق خلية واحدة.
- لإثراء للخلايا التائية الساذجة، إضافة البيوتين المضادة لـ CD44 المضادة خلال أول عملية حضانة الأجسام المضادةالخطوة 13.
ملاحظة: مجموعة الاختيارات التجارية السلبية المستخدمة في هذه الخطوة تحتوي على عنصرين رئيسيين لخطوتين من الحضانة (أي، حضانة خليط الكائنات المضادة biotin و حضانة حبة streptavidin المغناطيسي).
- استخدام مقياس الهيموسيتات لحساب الخلايا وحقن 1000 إلى 10000 الخلايا المنقاة P14 T في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل الجنس مطابقة C57BL/6 المتلقي عبر الوريد الذيل.
ملاحظة: بروتوكول حقن الوريد الذيل مفصل هو موضح في الخطوة 2. - في اليوم التالي، يحصل جميع متلقي C57BL/6 على 2 × 105 pfu LCMV Armstrong مخففة في 200 ميكرولتر من PBS عبر مسار داخل الصفاق.
2. وضع العلامات داخل الأوعية الدموية من CD8+ الخلايا T
ملاحظة: اعتمادا على الاهتمامات البحثية، يمكن اختيار نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى. مثال عن يوم 30 بعد الإصابة (يوم 30 بعد الخطوة 1.4) هو موضّى، والذي غالباً ما يعتبر نقطة وقت ذاكرة مبكرة لاستجابة خلية T CD8.
- تخفيف البيوتين المضادة للأجسام المضادة CD8α إلى 15 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. تأكد من تلقي كل فأر 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 3 ميكروغرام الأجسام المضادة.
ملاحظة: يتم استخدام الأجسام المضادة لـ CD8 من البيوتين هنا بحيث تكون أكثر مرونة لتصميم لوحة تلطيخ FACS النهائية. يمكن استخدام الأجسام المضادة ذات التسمية الفلورية المسماة بالصبغة مباشرة. ومع ذلك، من المهم استخدام استنساخ مختلفة من الأجسام المضادة أحادية النسيلة لوضع العلامات عن طريق الوريد مقابل تلطيخ FACS. - تسخين صحيح الوريد الذيل من الفئران مع مصباح الحرارة العلوي لمدة 5-10 دقيقة لتمدد الأوردة.
ملاحظة: يجب توخي المزيد من الحذر لمنع ارتفاع درجة حرارة الحيوانات. قلل الحرارة أو قم بإزالة مصباح الحرارة إذا توقفت الفئران عن التحرك. - ارسم 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لـ CD8α المُسبقة في حقنة الأنسولين 100 U (28G) وأزل أي فقاعات هوائية بتحريك المكبس لأعلى ولللأسفل. ثني الإبرة لخلق زاوية 150 درجة بين الإبرة والمحاقن، شطب، لذلك فإن الإبرة ستكون موازية للواريد.
- كبح جماح الماوس مع تقييد القوارض من الحجم المناسب ورش الذيل مع الإيثانول 70٪ لجعل الوريد مرئية بوضوح.
ملاحظة: يجب أن تبقى مدة التقييد عند الحد الأدنى. - عقد الذيل في نهاية القاصي مع الإبهام والأصابع الوسطى من اليد غير المهيمنة. ضع السبابة أسفل الموقع الذي سيتم إدخال الإبرة فيه.
- أمسك المحاقن باليد المهيمنة وأدخل الإبرة في الوريد بالتوازي نحو اتجاه القلب.
ملاحظة: عند وضع بشكل صحيح، يجب أن تتحرك الإبرة بسلاسة في الوريد. - تحقن ببطء 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD8α عبر الوريد الذيل.
ملاحظة: إذا كانت هناك مقاومة أو منطقة بيضاء ينظر فوق الإبرة على الذيل، الإبرة ليست داخل الوريد. بدء الحقن الأولي على مقربة من غيض من الذيل. عند الضرورة, المضي قدما نحو الجزء السفلي من الذيل للحقن اللاحقة. - اخلع الإبرة وطبق الضغط بلطف حتى يتوقف النزيف.
- العودة إلى قفص الماوس ، والقتل الرحيم الماوس بعد 3-5 دقيقة.
ملاحظة: يجب أن يتم قتل الفئران عن طريق غرفة isoflurane تليها خلع عنق الرحم. طرق أخرى، مثل CO2 استنشاق سوف يستغرق ما يصل إلى 5 دقائق، وقد إدخال الاختلاف لا لزوم لها من الوقت وضع العلامات الأجسام المضادة في الوريد. - تشريح الكلى باستخدام مقص، ونقل الكلية كلها إلى 1.5 مل من أنابيب microcentrifuge وترك العينات على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
ملاحظة: يمكن تخزين الكلى الكاملة سليمة بأمان على الجليد لبضع ساعات قبل المعالجة اللاحقة والهضم.
3. الهضم الانزيمية للكلى
- إعداد 6 لوحات جيدا تحتوي على 3mL من محلول الهضم (RPMI /2٪ FCS/1 ملغ /مل Collagenase B) لكل فأرة، وتخزينها على الجليد.
ملاحظة: يمكن إعداد محلول الكولاجين B عند التركيز العالي (على سبيل المثال، 20x) وتخزينه عند أو أقل من -20 درجة مئوية. وينبغي إعداد حل العمل من جديد. الرجاء مراجعة الجدول 1 للحصول على وصفات لجميع الحل/المخزن المؤقت المستخدمة في البروتوكول الحالي. - إضافة 300 μL من حل الهضم في أنابيب العينة microcentuguge 1.5 مل و mince عينات الكلى مع مقص الربيع على التوالي.
ملاحظة: يجب أن يتم مفر أنسجة الكلى إلى قطع حتى مع أحجام لا يزيد عن 1.5 ملم في أقطار. لا يلزم أي خطوة قطع. - نقل عينات الكلى المفرومة إلى 6 صحون من الآبار تحتوي على حل الهضم
ملاحظة: يتم استخدام 6 ألواح من الآبار من أجل الراحة فقط عندما تكون هناك عينات متعددة يجب معالجتها. - احتضان العينات في 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف (حوالي 60 دورة في الدقيقة) لمدة 45 دقيقة.
- بعد الهضم، هرس الأنسجة مع شفة المكبس من حقنة 3 مل مباشرة داخل الطبق، ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 مل.
ملاحظة: عادة ما يكون الترشيح من خلال مصفاة الخلايا غير مطلوب في هذه الخطوة لأن الطارد المركزي للتدرج الكثافة يتم تنفيذه بجوار تنقية الخلايا اللمفاوية الحية. - تدور أسفل العينات في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- Resuspend بيليه في 3 مل من دورة في الدقيقة 10/10 في FCS.
4. كثافة الطرد المركزي التدرج لإثراء الخلايا الليمفاوية من الكلى المهضمة
- تدور أسفل العينة في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- إزالة supernatant وإعادة فرض بيليه الخلية مع 5 مل من 44٪ Percoll / خلطة RPMI (44٪ Percoll + 56٪ دورة في الدقيقة دون FBS).
- وضع غيض من ماصة 3 مل تحتوي على 3 مل من 67 ٪ Percoll / برنامج تلفزيوني (67 ٪ Percoll + 33 ٪ PBS) مباشرة إلى أسفل كل أنبوب ، والإفراج ببطء الحل بحيث حل الثقيلة (67 ٪ Percoll / برنامج تلفزيوني) يشكل طبقة متميزة في الجزء السفلي والحل الخفيفة (44 ٪ Percoll / RPMI) هو رفع. معا، سوف تشكل طبقات كوكتيل.
ملاحظة: بالنسبة للتدرج الكثافة التي وصلت حديثا من البائع، إضافة 1/10 حجم من 10X معقم PBS إلى زجاجة، اخلط جيدا والنظر في معامل التدرج معامل متوازن 100٪ حل. - تدور العينات في 900 س ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع انخفاض المسرع وإعداد الفرامل.
ملاحظة: بالنسبة للطاردات المركزية التي لديها إعدادات المسرع والفرامل (على مقياس 1-9 (1 يعني الحد الأدنى و9 يعني الحد الأقصى))، استخدم 6 للمسرّع و4 للمكابح. - إزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي دون إزعاج الطبقات؛
ملاحظة: يتم تحديد طبقة الخلايا اللمفاوية واضحة بين طبقة 1111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111. - إزالة الطبقة العليا مع ماصة نقل دون لمس طبقة اللمفاويات.
- نقل طبقة اللمفاويات إلى أنبوب جديد 15 مل، وملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني /5٪ FCS ومزيج عن طريق عكس أنبوب 4-6x ببطء لضمان خلط كافية.
ملاحظة: هذه الخطوة مهم لغسل أي Percoll المتبقية. - تدور أسفل العينات في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 500 μL من كامل متوسطة RPMI. الخلايا جاهزة للانطلاق في التلطخ للخلايا.
5. تدفق التلطين القياسات اللوترية وتحليل
ملاحظة: يرجى اتباع معيار تدفق قياس القياسات الخلايا بروتوكول لالمفاوية T.
- تأخذ حوالي 1 × 106 خلايا لكل تلطيخ FACS.
ملاحظة: استخدام لوحة U-أسفل 96 جيدا لتلوين FACS. ومع ذلك، إذا كان هناك عدد محدود من العينات التي تنطوي على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم 5 مل أنابيب FACS. - تدور أسفل الخلايا في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل المُندفع.
- Resuspend كل عينة في 50 ميكرولتر من FACS العازلة التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من 2.4G2 FcR مانع (مضاد CD16/32 أحادية النسيلة لمنع التفاعل بين الأجسام المضادة FACS المضافة مع FcR). احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- دون مزيد من الطرد المركزي، إضافة 50 ميكرولتر من سطح تلطيخ خليط الأجسام المضادة لكل عينة بحيث حجم تلطيخ النهائي هو 100 ميكرولتر / كل عينة. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
ملاحظة: تضمين streptavidin المسمى الفلورسنت (2 ميكروغرام / مل أو اتبع توصية الشركة المصنعة) في خليط الأجسام المضادة لتسمية CD8α+ الخلايا CD8+ T 6 و استخدام الفلورسنت المسمى المضادة لـ CD8β لتسمية جميع الخلايا T CD8. يتم إجراء خليط الأجسام المضادة عن طريق إضافة كميات المطلوب من الأجسام المضادة المهتمة في المخزن المؤقت FACS. - غسل العينات مع برنامج تلفزيوني مرتين. لكل غسل، وملء آبار 96 لوحة جيدا مع برنامج تلفزيوني الباردة، تدور في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من افرحة.
- إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر /بئر من صبغة حية/ موت مخففة. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
ملاحظة: حتى مع كثافة تدرج متوسط تدور، خطوة الهضم الأنزيمية غالبا ما يؤدي إلى موت الخلايا كبيرة في الأنسجة المقيم الخلايا التائية بسبب ARTC2.2/P2RX7 إشارة15. ينصح بشدة تلوين صبغة حية / الموت قبل التثبيت. يمكن إدارة الأجسام النانوية المضادة لـ ARTC2 في الفئران قبل القتل الرحيم لمنع موت الخلايا الناجم عن عزل الخلايا. - اغسل العينات بمخزن FACS مرتين. لكل غسل، وملء آبار 96-جيدا لوحة مع عازلة FACS الباردة، تدور في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من افرحة.
- Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر / جيدا تحديد العازلة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: يتم إصلاح المخزن المؤقت حديثًا عن طريق تخفيف الفورمالديهايد مع برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي بنسبة 2٪ فورمالديهايد. - اغسل العينات بمخزن FACS مرتين. لكل غسل، ملء آبار 96 لوحة جيدا مع عازلة FACS الباردة، تدور في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من افرحة.
- إعادة تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر / جيدا FACS العازلة. ختم لوحة، وتخزينها في 4 درجة مئوية وحماية من الضوء حتى تحليل FACS.
ملاحظة: قبل تحليل FACS، قم بتصفية العينات من خلال شبكة نايلون 70 ميكرومتر لإزالة مجموعات الخلايا المحتملة التي قد تسد جهاز FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكول الموضح هنا ملخص في مخطط تدفقي (الشكل 1A). في اليوم 30 بعد عدوى LCMV، قمنا بالوسم داخل الأوعية الدموية من الخلايا CD8+ T. بعد 5 دقائق ، تم تشريح كليتي الحيوان ، وتم سلخه ، وإخضاعه لعملية الهضم الكولاجينية. تم تنقية الخلايا الليمفاوية من العينات المهضومة عبر الطرد المركزي Percoll وتحليلها عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة. كما هو مبين في الشكل 1B، حتى بعد كثافة الطارد المركزي التخصيب اللمفاوي بوساطة ، كان من الشائع جدا أن نرى جزءا كبيرا من الخلايا غير اللمفاوية في المنتج النهائي. ومع ذلك، بعد الغاء على الخلايا الليمفاوية الحية، كان من السهل تحديد CD8+ الخلايا الليمفاوية T. يمكننا التمييز بين الأوعية الدموية مقابلCD8 + T. بسبب نمط التعبير المترابط للغاية من CD8α و CD8β على CD8+ الخلايا T، فمن المتوقع أنCD8 + T الخلايا داخل الأوعية تظهر نمط قطري على ملف CD8α-CD8β FACS. كما هو متوقع، فقط البذخ CD8+ T الخلية المكتسبة بكفاءة TRM الظاهريات، مثل upregulation من CD69 و downregulation من Ly6C(الشكل 1B). في تجاربنا، كنا مهتمين في الخلايا T P14 المانحة مع علامة مُنْكِنِة CD45.1. باستخدام نفس البروتوكول، يمكن فحص مضيف مشتقة الذاتية CD8+ الخلايا T كذلك. وعلى النقيض من الفئران المصابة، فإن الغالبية العظمى من خلايا CD8+ T المعزولة عن الفئران الساذجة الصغيرة الموجودة في مرفق SPF كانت تحمل اسم الأجسام المضادة CD8α، وبالتالي، تنتمي إلى المقصورة داخل الأوعية الدموية(الشكل 1C).
الشكل 1: النتائج التمثيلية.
(A)مخطط انسيابي للبروتوكول. (ب) في اليوم 30 بعد العدوى ، تم تحليل الخلايا الليمفاوية الكلى عن طريق تدفق الخلايا. يتم عرض ملفات تعريف FACS التمثيلية واستراتيجية البوابات. وتشير الأرقام إلى النسبة المئوية للمجموعات الفرعية المبوبة بين سكانها من الوالدين. (C) ممثل FACS الملف الشخصي للكلى CD8+ الخلايا T معزولة عن الماوس ساذج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكاشف | وصفه | ملاحظه |
| 100٪ بيركول | 9 مجلدات من بيركول + 1 حجم من 10xPBS | |
| 44٪ Percoll / RPMI | 44٪ فول من 100٪ Percoll + 56٪ فول مصل مجاني RPMI | مصنوعة طازجة من 100٪ Percoll |
| 67٪ بيركول/بي بي إس | 67٪ فول من 100٪ Percoll + 33٪ وحدة PBS | مصنوعة طازجة من 100٪ Percoll |
| هضم العازلة | دورة في الدقيقة + 2٪ FCS + 1mg /مل كولاجين B | مصنوعة طازجة من مخزون الكولاجيناز |
| PBS/5٪ FCS غسل العازلة | برنامج تلفزيوني + 5٪ FCS | |
| مخزن FACS المؤقت | برنامج تلفزيوني + 2٪ FCS + 0.02٪ NaN3 | مخزنة عند 4 درجة مئوية |
| إصلاح المخزن المؤقت | PBS + 2٪ الفورمالديهايد | تخزين في RT وحمايتها من الضوء |
الجدول 1: قائمة وصفات لجميع الحل والمخزنة المستخدمة في البروتوكول الحالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وبما أن مناعة الأنسجة المحددة هي مجال سريع التوسع في البحث، فإن تراكم الأدلة يشير إلى أن الخلايا المناعية، وخاصة الخلايا اللمفاوية يمكن تحديدها في جميع الأعضاء تقريبًا في الفئران البشرية أو المصابة أو المحصنة. LCMV نموذج عدوى الماوس هو نموذج راسخ لدراسة مستضدية محددة الخلية استجابة، والمفَرِّر والذاكرة T الخلية تمايز بما في ذلك علم الأحياءT RM عبر أنسجة متعددة. هنا، وصفنا بروتوكول لتحليل CD8+ الخلايا التائية في الكلى. هذا البروتوكول مقتبس إلى حد كبير من المنشورات التي تركز على TRM12. ويفترض بسبب ارتفاع مستوى P2RX7 التعبير والهضم الأنزيمي الناجم موت الخلايا15, الخلايا الليمفاوية العائد من البروتوكول الحالي هو الأنسب لتحليل الظاهري الفوري. ومع ذلك، مع بروتوكول المنشأة لمنع وفاة الخلايا الناجمة عن P2RX716،فمن المتصور أن البروتوكول الحالي يمكن تعديلها بسهولة (على سبيل المثال، مع إضافة مثبطات لمنع إشارات P2RX7) لزيادة بقاء الخلية وتكون مناسبة لغيرها من الدامس الوظيفية على المدى الطويل. وينبغي أن تدرج مجموعات التحكم المناسبة لضمان أن مثبطات P2RX7 لا تتداخل مع اختبار وظيفية المهتمة.
يتم توليد خلايا CD8+ TRM إلى حد كبير استجابة للعدوى أو المستضدات البيئية. لدينا استخدام بروتوكول وضع العلامات داخل الأوعية لتحليل مباشرة CD8 الكلى الخلايا T+ عزل من 5-6 أسابيع من الفئران الساذجة C57BL/6. بما يتفق مع النتائج المنشورة17، هناك تقريبا لا يوجد إسراف CD8+ الخلايا T في هذه الفئران "نظيفة" (الشكل 1C). وقد أظهرت دراسة أنيقة أن غالبية الذاكرة CD8+ الخلايا T التي حددت في الأنسجة غير اللمفاوية هي TRM10. في المقابل، باستخدام نظام عدوى مماثلة، ونحن غالبا ما تكشف عن عدد كبير من السكان CD69- الخلايا (على الأرجح تمثل الخلايا TEM أو خلايا CD69- TRM) حتى في المقصورة البذخ. قد يكون التباين بسبب الحقائق التي 1) وتستخدم تقنيات مختلفة، أي، المجهر مقابل تدفق القياسات؛ 2) في وقت مبكر مقابل نقاط الذاكرة في وقت متأخر وتركز و 3) CD69 ليست علامة مثالية لتحديدT RM. سوف الهضم الانزيمية وتدفق cytometry بشكل ملحوظ أقل من تقدير العدد الإجمالي للخلاياT RM. ومع ذلك، فإنه، بوصفه بروتوكولاً مريحاً وغير كثيف العمالة، لا يزال مقبولاً بشكل شائع في معظم دراساتجمهورية مقدونيا ت.
المعيار الذهبي لتحديد خلاياT RM بشكل نهائي هو إجراء تجربة الباربيسيس. على الرغم من أن البروتوكول الموصوف هنا يوفر طريقة مريحة لتحديد الخلايا التائية المقيمة في الكلى ، إلا أن نتائج هذا البروتوكول تثبت فقط أنه في الوقت الذي يتم فيه القتل الرحيم للفئران ، فإن الخلايا التائية تقيم خارج الأوعية الدموية في الكلى. لا يوفر هذا البروتوكول وحده أي معلومات حول تاريخ المهاجرة الخلايا التائية.
بالإضافة إلى العدوى، يمكن دراسة أي كلية تستهدف الاستجابات المناعية، بما في ذلك استجابات المناعة الذاتية التمايز من مجموعة فرعية كبيرة من الخلايا التائية المقيمة في الكلى باستخدام بروتوكول مماثل. علاوة على ذلك ، كما هو موضح قبل12، يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لاستخدام الأجسام المضادة لـ CD45 (لتسمية جميع الخلايا ال دموي) لدراسة الخلايا المناعية الأخرى المقيمة في الكلى. معا، أظهرنا طريقة مريحة نسبيا لعزل وتحليل CD8 الخلايا Tمن الكلى، والتي يمكن تكييفها مع نماذج مختلفة بما في ذلك العدوى و المناعة الذاتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يملك أصحاب البلاغ إقرارات مالية ذات صلة.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح AI125701 وAI139721، وبرنامج معهد أبحاث السرطان كليب وجمعية السرطان الأمريكية منحة RSG-222-01-LIB إلى N.Z. نشكر كارلا جورينا وسيباستيان مونتانينو من مرفق تدفق الدراجات. تم دعم البيانات التي تم إنشاؤها في مرفق الموارد المشتركة للتدفق من قبل مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو (UTHSCSA) ، ومنحة المعاهد القومية للصحة / NCI P30 CA054174-20 (مركز البحوث السريرية والترجمة [CTRC] في UTHSCSA) ، وUL1 TR001120 (جائزة العلوم السريرية والترجمة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
