Summary
ウイルス感染後、腎臓は比較的多数のCD8+T 細胞を収容し、非粘膜TRM 細胞を研究する機会を提供する。ここでは、フローサイトメトリー解析のためにマウス腎臓リンパ球を単離するプロトコルについて述べた。
Abstract
組織常駐記憶T細胞(TRM)は、免疫学研究の急速に拡大する分野である。T細胞を様々な非リンパ組織から分離することは、TRMsを調査するための重要なステップの1つです。異なる臓器のリンパ球分離プロトコルにはわずかなバリエーションがあります。腎臓は、特に病原体暴露または自己免疫活性化後に多数の免疫細胞浸潤を有する必須の非リンパ器官である。近年、私たち自身を含む複数の研究室は、マウスと人間の両方で様々な生理学的および病理学的な設定で腎臓常駐CD8+ T細胞の特徴付けを開始しました。Tリンパ球の豊富さのために、腎臓は非粘膜または非バリア組織でTRMsを研究する魅力的なモデル器官を表す。ここでは、全身ウイルス感染後のマウス腎臓からCD8+ T細胞を単離するためにTRM-焦点を当てたラボで一般的に使用されるプロトコルについて説明する。簡単に言えば、C57BL/6マウスにおける急性リンパ球性絨毛髄膜炎ウイルス(LCMV)感染モデルを用いて、血管内CD8+T細胞標識、酵素消化、および密度勾配遠心分離を実証し、マウス腎臓からのリンパ球を分離および濃縮し、その後のフロー細胞量分析の準備を整える。
Introduction
組織常駐記憶(TRM)T細胞は、成人ヒトおよび感染マウスにおいて最も豊富なT細胞集団の1つを表す。TRM細胞は免疫防御の第一線を提供し、様々な生理学的および病理学的プロセス1、2、3、4、5に批判的に関与している。T細胞を循環する細胞と比較すると、TRM細胞はユニークな転写プログラム6、7、8を持つ明確な表面マーカーを運ぶ。TRM生物学に関する知識を広げ、T細胞ベースワクチンや免疫療法の将来の開発に不可欠なT細胞応答を理解する鍵です。
TRMsの一般的に共有される分子マーカーは、すべての非リンパ組織にまたがって、組織特異的な特徴がTRM生物学9の中心的な構成要素であることを示唆する証拠を蓄積する。腎臓は、感染後のTRM細胞を含む多くの免疫細胞を収容し、非粘膜組織におけるTRM細胞生物学を研究する絶好の機会を提供します。急性LCMV(リンパ球性絨毛髄膜炎ウイルス)内腹腔経路を介した感染は、マウスにおける抗原特異的T細胞応答を研究するための十分に確立された全身感染モデルである。感染は通常、野生型マウスにおいて7〜10日で解決され、腎臓10を含む様々な組織に多数のLCMV特異的記憶T細胞を残す。P14 TCR(T細胞受容体)トランスジェニックマウスは、CD8+T細胞を担持するトランスジェニックマウスは、C57BL/6マウスにおいてMHC-I(クラスI主要組織適合複合体)分子H2-Dbによって提示されたLCMVの免疫性優勢エピトープの1つを認識する。マウスにおけるコンジェニックにマークされたP14 T細胞導入およびLCMV感染を組み合わせることで、CD8+エフェクターおよびメモリT細胞が、TRM分化および恒常性を含む追跡される。
腸内上皮リンパ球(IEL)コンパートメントや唾液腺などのいくつかのバリア組織において、確立されたリンパ球分離手順は、マウスLCMVモデル11における最小限の血液媒介性T細胞汚染で高い割合のTRM細胞を生み出す。しかし、腎臓のような非バリア組織では、緻密な血管ネットワークは多数の循環CD8+T細胞を含む。成功した灌流でさえ、すべての循環CD8+ T細胞を効率的に除去できないことが十分に文書化されています。この技術的なハードルを克服するために、TRMラボ12で最も一般的に使用される技術の1つとして血管内抗体染色が確立されている。簡単に言えば、安楽死の3〜5分前に、3μg/マウス抗CD8抗体(CD8+T細胞の標識)が静脈内に送達される。無傷の血管壁は、この短期間(すなわち、3〜5分)内に抗体の急速な拡散を防止し、血管内細胞のみが標識される。標準的なリンパ球分離プロトコルに従って、血管内細胞対血管外細胞はフローサイトメトリーを使用して容易に区別することができる。
ここでは、13日前にCD45.1+P14 T細胞およびLCMV感染を受けたC57BL/6マウスを用いた腎臓CD8+T細胞の血管内標識、リンパ球分離およびフローサイトメトリー分析を行うためにTRMラボで一般的に使用される標準的なプロトコルについて説明する。同じプロトコルは、腎臓のエフェクターおよびメモリT細胞の両方を研究するために使用することができる。
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Protocol
このプロトコルに従って行われるすべての動物実験は、それぞれの機関の動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されなければなりません。ここに記載されているすべての手順は、IACUC UT健康サンアントニオによって承認されています.
1. C57BL/6レシピエントおよびLCMV感染へのP14 T細胞の養子転移
- P14マウスを6-12週齢で使用する。ドナーP14 TCRトランスジェニックマウスの性別がC57BL/6レシピエントマウスの性別と一致する必要があることを確認してください。さもなければ、雌マウスに移る雄T細胞のような細胞は、14日目頃に循環ドナーT細胞の免疫媒介拒絶をもたらす。
- メーカーのプロトコルに従ってマウスCD8+ T細胞精製キットを使用して、P14 TCRトランスジェニックマウスの脾臓およびリンパ節からナイーブCD8+ T細胞を精製します。
- 簡単に言えば、脾臓およびリンパ節を解剖し、サンプルをつぶして単一細胞懸濁液を生成する。
- ナイーブT細胞を濃縮するために、第1の抗体インキュベーションステップ13の間にビオチン抗CD44抗体を添加する。
注:このステップで使用されるネガティブセレクション用の市販キットには、インキュベーションの2つのステップ(すなわち、ビオチン抗体混合物インキュベーションおよびストレプトアビジン-磁気ビーズインキュベーション)のための2つの主要な成分が含まれています。
- ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、200 μLのPBSで1,000~10,000個の精製P14 T細胞を尾静脈を介してC57BL/6レシピエントと一致させた各性別に注入します。
注: 詳細な尾静脈注入プロトコルは、ステップ 2 で説明されています。 - 翌日、すべてのC57BL/6レシピエントは、腹腔内経路を介して200 μLのPBSで希釈された2 x 105 pfu LCMVアームストロングを受け取ります。
2.CD8+ T細胞の血管内標識
注:研究の趣味に応じて、感染後に異なるポイントを選択できます。30日目の感染後の例(ステップ1.4の後の30日目)が実証され、これはしばしばCD8 T細胞応答の早期記憶時間ポイントと考えられる。
- PBSで15μg/mLに対するビオチン抗CD8α抗体を希釈。各マウスが3μg抗体を含むPBSを200μL受け取ることを確認します。
注:ビオチン抗CD8抗体は、最終的なFACS染色パネルを設計するためにより柔軟になるように、ここで使用されています。蛍光色素標識抗体は直接使用することができる。しかし、静脈内標識とFACS染色に対してモノクローナル抗体の異なるクローンを使用することが重要です。 - 頭上のヒートランプでマウスの尾静脈を5〜10分間適切に加熱し、静脈を拡張します。
注:動物の過熱を防ぐために、特別な注意が必要です。マウスが動き回るのを止めた場合は、熱を弱めるか、ヒートランプを取り外します。 - 200 μLの希釈済み抗CD8α抗体ミックスを100 Uインスリン注射器(28G)に引き込み、ピストンを上下に動かして気泡を取り除きます。針と注射器の間に150°の角度を作成するために針を曲げ、ベベルアップして、針は静脈に平行になります。
- 適切なサイズのげっ歯類の拘束剤でマウスを拘束し、静脈がはっきりと見えるように70%エタノールで尾をスプレーします。
注: 拘束の期間は最小限に抑えてください。 - 非支配的な手の親指と中指で遠位端の尾を保持します。針が挿入される場所の下に人差し指を置きます。
- シリンジを支配的な手で持ち、心臓の方向に向かって平行に静脈に針を挿入します。
注:正しく配置すると、針は静脈に滑らかに移動する必要があります。 - 200μLの抗CD8α抗体を尾静脈を介してゆっくりと注入する。
注:抵抗がある場合や尾の針の上に白い領域が見られる場合、針は静脈の内側にありません。最初のインジェクションは、尾の先端近くで開始します。必要に応じて、後の注射のために尾の底に向かって前進します。 - 針を外し、出血が止まるまで静かに圧縮を施します。
- マウスをケージに戻し、3~5分後にマウスを安楽死させる。
注:マウスはイオブルランチャンバーを介して安楽死させ、その後に子宮頸部脱臼を行う必要があります。CO2吸入などの他の方法は、最大5分を要し、静脈内抗体標識時間の不必要な変動を導入する可能性があります。 - はさみを使って腎臓を解剖し、腎臓全体をマイクロ遠心分離チューブの1.5 mLに移し、さらに処理するまでサンプルを氷の上に残します。
注:無傷の腎臓全体は、その後の処理と消化の前に数時間氷の上に安全に保存することができます。
3. 腎臓の酵素消化
- 各マウスに3mLの消化液(RPMI/2%FCS/1 mg/mlコラゲターゼB)を含む6ウェルプレートを準備し、氷の上に保存します。
注:より高濃度(例えば、20倍)でのストックコラゲナーゼB溶液は、-20°C以下で調製し、保存することができます。 作業ソリューションは、新鮮な準備をする必要があります。現在のプロトコルで使用されるすべてのソリューション/バッファのレシピについては 、表 1 を参照してください。 - 1.5 mLマイクロ遠心分離酵素サンプルチューブに300μLの消化液を加え、まっすぐなスプリングハサミで腎臓サンプルをミンチします。
注:腎臓組織は、直径1.5mm以下のサイズの部分にミンチする必要があります。カプセル化解除の手順は必要ありません。 - ひき肉の腎臓サンプルを消化液を含む6つのウェルプレートに移す
注:6ウェルプレートは、処理する複数のサンプルがある場合にのみ便宜のために使用されます。 - 37°Cでサンプルを穏やかな揺れ(約60rpm)で45分間インキュベートします。
- 消化後、3 mLシリンジのプランジャーフランジを皿の中に直接つぶし、15 mL円錐形のチューブに移します。
注:通常、細胞ストレーナーを通してろ過は、密度勾配遠心分離が生きたリンパ球を精製するために次に行われるので、このステップでは必要ありません。 - 4 °Cで5分間500 x g でサンプルをスピンダウンします。
- ペレットをRPMI/10%FCSの3mLで再懸濁します。
4. 消化された腎臓からリンパ球を豊かにする密度勾配遠心分離
- サンプルを500 x g で5分間4°Cで5分間回転させます。
- 上清を取り除き、44%パーコール/RPMIミックスの5 mL(44%パーコール+FBSなしのRPMI)で細胞ペレットを再懸濁します。
- 3 mL の 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) を含む 3 mL ピペットの先端を各チューブの底部に直接入れ、溶液をゆっくりと放出して、重い溶液 (67% Percoll/PBS) が底部に明確な層を形成し、軽い溶液 (44% Percoll/RPMI) が上げられるようにします。一緒に、カクテルレイヤーが形成されます。
注:ベンダーから新たに到着した密度勾配媒体の場合は、ボトルに無菌10x PBSの1/10ボリュームを追加し、よく混ぜてPBSバランス密度勾配媒体を100%溶液と考えてください。 - 低加速器とブレーキ設定で室温で20分間、900 x g でサンプルを回転させます。
注: アクセルとブレーキの設定が付いた遠心分離機(1~9スケール(1は最小、9は最大値)の場合は、アクセルに6、ブレーキに4を使用してください。 - 慎重に層を乱すことなく遠心分離機からチューブを削除します。
注:明確なリンパ球層は、ピンク色のRPMI層と無色のPBS層の間で識別されます。 - リンパ球層に触れることなく、移管ピペットで上層を除去します。
- リンパ球層を新しい15 mLチューブに移し、チューブをPBS/5%FCSで満たし、チューブを4〜6倍ゆっくりと反転して混合し、十分な混合を確保します。
注:このステップは、残留パーコールを洗い流すために重要です。 - 4 °Cで5分間500 x g でサンプルをスピンダウンします。
- 上清を取り除き、完全なRPMI培地の500 μLで細胞ペレットを再中断します。細胞はフローサイトメトリー染色の準備ができている。
5. フローサイトメトリー染色と分析
注:Tリンパ球の標準的なフローサイトメトリー染色プロトコルに従ってください。
- 各FACS染色のために約1 x 106 細胞を取ります。
注: FACS 染色には U-底 96 ウェル プレートを使用します。ただし、サンプル数が限られている場合は、5 mL FACSチューブも使用できます。 - 4°Cで5分間500 x g で細胞をスピンダウンします。 上清を捨てます。
- 2.4G2 FcRブロッカー(FcRとのFACS抗体の相互作用を遮断する抗CD16/32モノクローナル抗体)の10 μg/mLを含むFACSバッファの50 μLの各サンプルを再中断します。氷の上で15分間インキュベートします。
- さらに遠心分離を行うことなく、各サンプルに50 μLの表面染色抗体混合物を加え、最終的な染色量が100 μL/各サンプルになるようにします。暗闇の中で30分間氷の上でインキュベートします。
注:抗体混合物に蛍光標識ストレプトアビジン(2 μg/mLまたはメーカーの推奨に従う)を含み、CD8α+血管内CD8+T細胞を標識し、蛍光標識された抗CD8β抗体を使用してすべてのCD8 T細胞に標識します。抗体混合物は、FACSバッファーに所望の量の関心のある抗体を加えることによって作られる。 - PBSでサンプルを2回洗います。洗浄ごとに、96ウェルプレートのウェルに冷たいPBSを充填し、500 x g で4°Cで5分間回転させ、上清を捨てます。
- 希釈された生死色の100 μL/ウェルで細胞を再懸濁します。暗闇の中で30分間氷の上でインキュベートします。
注:密度勾配媒体スピンを有しても、酵素消化ステップは、ARTC2.2/P2RX7シグナル15による組織居住T細胞において有意な細胞死を引き起こすことがよくあります。生死性染料染色は、固定前に強くお勧めします。抗ARTC2 nanobodyは、細胞単離による細胞死を防ぐために安楽死の前にマウスに管理することができる。 - FACS バッファを使用してサンプルを 2 回洗浄します。洗浄ごとに、96ウェルプレートのウェルに冷たいFACSバッファーを充填し、500 x g で4°Cで5分間回転し、上清を捨てます。
- 細胞を100 μL/ウェル固定バッファーに再懸濁します。37°Cで10分間インキュベートします。
注:固定バッファーは、2%ホルムアルデヒドの最終濃度にPBSでホルムアルデヒドを希釈することによって作られました。 - FACS バッファを使用してサンプルを 2 回洗浄します。洗浄ごとに、96ウェルプレートのウェルに冷たいFACSバッファーを充填し、500 x g で4°Cで5分間回転し、上清を捨てます。
- 250 μL/well FACS バッファでセルを再サスペンドします。プレートを密封し、4°Cで保管し、FACS分析まで光から保護します。
注: FACS 解析の前に、70 μM ナイロン メッシュを使用してサンプルをフィルター処理し、FACS マシンを詰まらせる可能性のあるセル クラスタを削除します。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルはフローチャートに要約されています (図 1A)。30日目のLCMV感染後、CD8+T細胞の血管内標識を行った。5分後、動物の両方の腎臓を解剖し、みじん切りにし、コラゲターゼ消化を行った。リンパ球はパーコール遠心分離を介して消化されたサンプルからさらに精製し、フローサイトメトリーによって分析した。図1Bに示すように、密度遠心分離媒介リンパ球濃縮後も、最終製品において非リンパ球の大部分を見るのは非常に一般的であった。しかし、生きたリンパ球でギートした後、CD8+Tリンパ球を同定することは容易であった。血管内対血管外CD8+T細胞を区別することができた。CD8+T細胞上のCD8αおよびCD8βの高相関発現パターンにより、血管内CD8+T細胞がCD8α-CD8βFACSプロファイル上に対角線パターンを示すことが期待される。予想通り、血管外CD8+T細胞のみが効率的にTRM表現型を獲得し、CD69のアップレギュレーションやLy6Cのダウンレギュレーション(図1B)など)。我々の実験では、コンジェニックマーカーCD45.1を有するドナーP14 T細胞に関心を持った。同じプロトコルを使用して、内因性宿主由来CD8+T細胞も同様に検査することができる。感染したマウスとは対照的に、SPF施設に収容された若いナイーブマウスから分離されたCD8+T細胞の大半は、i.v.CD8α抗体で標識され、したがって、血管内区画に属していた(図1C)。
図1:代表的な結果。
(A) プロトコルのフローチャート。(B)30日目の感染後に、腎臓リンパ球をフローサイトメトリーで分析した。代表的な FACS プロファイルと格言戦略が示されています。この数値は、親の集団におけるゲートサブセットの割合を示します。(C)ナイーブマウスから単離された腎臓CD8+T 細胞の代表的なFACSプロファイル。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | レシピ | メモ |
| 100% パーコール | パーコル9巻+10xPBS1巻 | |
| 44% パーコール/RPMI | 44% 100% パーコールの Vol + 56% Vol 血清フリー RPMI | 100%パーコールから新鮮に作られました |
| 67% パーコル/PBS | 100%パーコールの67%Vol + 33%Vol PBS | 100%パーコールから新鮮に作られました |
| 消化バッファー | RPMI + 2% FCS + 1mg/ml コラゲターゼ B | コラゲエーゼストックから生み出した |
| PBS/5% FCS洗浄バッファー | PBS + 5% FCS | |
| FACS バッファ | PBS + 2% FCS + 0.02% NaN3 | 4°Cで保存 |
| 固定バッファ | PBS + 2% ホルムアルデヒド | RTに保存され、光から保護 |
表1:現在のプロトコルで使用されるすべてのソリューションとバッファのレシピのリスト。
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Discussion
組織特異的免疫は急速に拡大する研究領域であるため、証拠を蓄積すると、免疫細胞、特にリンパ球集団は、成人ヒトまたは感染または免疫マウスのほぼすべての器官で同定できることを示唆している。LCMVマウス感染モデルは、複数の組織にわたるTRM 生物学を含む抗原特異的T細胞応答、エフェクターおよびメモリT細胞分化を研究するための確立されたモデルである。ここでは、腎臓におけるCD8+T 細胞を解析するプロトコルについて説明した。このプロトコルは、主に TRM12に焦点を当てた出版物から適用されます。高レベルのP2RX7発現および酵素消化誘導細胞死15に起因すると考えられるが、現在のプロトコルからのリンパ球収量は、即時表現型分析に最も適している。しかし、P2RX7誘導細胞死16を阻害するプロトコルを確立すると、現在のプロトコルを容易に改変できること(例えば、P2RX7シグナルを遮断する阻害剤を添加して)細胞の生存を増加させ、他の長期機能アッセイに適していると考えられる。P2RX7阻害剤が関心のある機能アッセイに干渉しないように、適切な対照群を含める必要があります。
腎臓CD8+ TRM細胞は、主に感染または環境抗原に応答して生成される。5-6週齢のナイーブC57BL/6マウスから分離した腎臓CD8+T細胞を直接分析するために血管内標識プロトコルを使用しています。公表された結果17と一致して、これらの「クリーン」マウスにほとんど血管外CD8+T細胞がない(図1C)。エレガントな研究では、非リンパ組織で同定されたメモリCD8+ T細胞の大部分がTRM10であることを実証しました。対照的に、同様の感染系を使用して、我々はしばしば、血管外コンパートメント内であっても、CD69-細胞(最も可能性の高いTEM細胞またはCD69- TRM細胞を表す)の有意な集団を検出する。不一致は、1)異なる技術、すなわち顕微鏡対フローサイトメトリーが使用されている事実に起因する可能性があります。2)早期と遅延メモリの時間ポイントが焦点を当てており、3)CD69はTRMを識別するのに最適なマーカーではありません。酵素消化およびフローサイトメトリーは、TRM細胞の総数を有意に過小評価する。しかし、便利で非労働集約的なプロトコルとして、ほとんどのTRM研究では依然として一般的に受け入れられています。
TRM細胞を明確に同定するゴールドスタンダードは、パラバイオシス実験を行うことである。ここで説明するプロトコルは、腎臓に居住するT細胞を同定する便利な方法を提供するが、このプロトコルからの結果は、マウスが安楽死させた時点で、T細胞が腎臓の血管の外に存在していることを証明するだけである。このプロトコルだけでは、T細胞の移動履歴に関する情報は提供されません。
感染症に加えて、自己免疫応答を含む免疫応答を標的とする腎臓は、同様のプロトコルを使用して腎臓居住T細胞の有意なサブセットの分化を誘導し得る。また、12の前に説明したように、このプロトコルは、他の腎臓居住免疫細胞を研究するために抗CD45抗体(すべての造血細胞にラベルを付けるために)を使用するように容易に変更することができる。一緒に、我々は、感染および自己免疫を含む様々なモデルに適応することができる腎臓からCD8+ T細胞を分離し、分析するための比較的便利な方法を実証した。
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Disclosures
著者らは関連する財務上の開示を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、NIHがAI125701およびAI139721、がん研究所CLIPプログラム、米国癌学会がRSG-18-222-01-LIBをN.Zに付与することを支援しています。フローサイトメトリー施設のカーラ・ゴレナとセバスチャン・モンタニーノに感謝します。フローサイトメトリー共有資源施設で生成されたデータは、テキサス大学サンアントニオ保健科学センター(UTHSCSA)、NIH/NCI助成金P30 CA054174-20(UTHSCSAの臨床およびトランスレーショナル研究センター[CTRC])、およびUL1 TR001120(臨床および翻訳科学賞)によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
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