Summary
바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8+ T 세포를 수용하고 비 점막 TRM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
조직-주민 기억 T 세포 (TRM)는면역학 연구의 급속하게 확장 분야입니다. 다양한 비 림프구 조직에서 T 세포를 격리하는 것은 TRMs를 조사하는 주요 단계 중 하나입니다. 다른 장기에 대한 림프구 절연 프로토콜에는 약간의 변화가 있습니다. 신장은 병원체 노출 또는 자가 면역 활성화 후에 특히 수많은 면역 세포 침투를 가진 필수적인 비 림프구 기관입니다. 최근 몇 년 동안, 우리 자신의 여러 실험실은 마우스와 인간 모두에서 다양한 생리 및 병리학 적 설정에서 신장 거주자 CD8+ T 세포를 특성화하기 시작했다. T 림프구의 풍부로 인해 신장은 비 점막 또는 비 장벽 조직에서 TRMs를 연구하는 매력적인 모델 기관을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 전신 바이러스성 감염 다음 마우스 신장에서 CD8+ T 세포를 격리하기 위하여 TRM집중한 실험실에서 일반적으로 이용되는 프로토콜을 설명할 것입니다. 간략하게, C57BL/6 마우스에서 급성 림프구성 초리오메닌염 바이러스(LCMV) 감염 모델을 사용하여, 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하기 위해 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하는 진래성 CD8+ T 세포 라벨링, 밀도 그라데이션 원심을 시연하여 후속 사이클분석을 위한 시료를 준비하고 있다.
Introduction
조직-상주 기억(TRM)T 세포는 성인 인간 및 감염된 마우스에서 가장 풍부한 T 세포 집단 중 하나를 나타낸다. TRM 세포는 면역 방어의 첫 번째 라인을 제공하고 다양한 생리학적 및 병리학적과정에 비판적으로관여1,2,3,4,5. 순환 T 세포와 비교하여 TRM 세포는 고유한 전사 프로그램6,7,8을가진 뚜렷한 표면마커를운반한다. TRM 생물학에 대한 지식을 확장하는 것은 T 세포 기반 백신 및 면역 요법의 미래 발달에 필수적인 T 세포 반응을 이해하는 열쇠입니다.
모든 비 림프구 조직에 걸쳐 TRMs의일반적으로 공유 분자 마커 이외에, 축적 증거는 조직 특정 특징이 TRM 생물학9의중앙 구성 요소임을 시사한다. 신장은 감염 후에 TRM 세포를 포함하여 많은 면역 세포를 항구하고 비 점막 조직에서 TRM 세포 생물학을 공부하는 좋은 기회를 제공합니다. 급성 LCMV(림프구성 초뇌염 바이러스) 감염은 관면 경로를 통한 잘 확립된 조직 감염 모델로 마우스에서 항원 특이적 T 세포 반응을 연구한다. 감염은 일반적으로 야생 형 마우스에서 7-10 일 이내에 해결되고 신장10을포함한 다양한 조직에서 많은 수의 LCMV 특이적 메모리 T 세포를 남깁니다. P14 TCR(T 세포 수용체) 형질전환 마우스는 C57BL/6 마우스에서 MHC-I(클래스 I 주요 조직적합성 복합체) 분자 H2-Db에 의해 제시된 LCMV의 면역 지배적 인 에피토프 중 하나를 인식CD8+ T 세포를 운반한다. 쥐에서 친자적으로 표시된 P14 T 세포 입양 전달 및 LCMV 감염을 결합하면 CD8+ 이펙터 및 메모리 T 세포가 TRM 분화 및 항상성을 포함하여 추적됩니다.
장 내 상피 림프구(IEL) 구획 및 침샘과 같은 일부 장벽 조직에서는, 확립된 림프구 절연 절차는 마우스 LCMV모델(11)에서혈액 매개 T 세포 오염을 최소화한 TRM 세포의 높은 비율을 산출한다. 그러나 신장과 같은 비장벽 조직에서 조밀한 혈관 망에는 많은 수의 순환 CD8+ T 세포가 포함되어 있습니다. 성공적인 관류조차도 모든 순환 CD8+ T 세포를 효율적으로 제거할 수 없다는 것이 잘 문서화되어 있습니다. 이러한 기술적 장애물을 극복하기 위해, 내트라바스 항체 염색은 TRM 실험실(12)에서가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나로 확립되었다. 잠시, 안락사 전에 3-5 분, 3 μg /마우스 안티 CD8 항체 (CD8+ T 세포를 레이블) 정맥으로 전달된다. 그대로 혈관 벽은 시간의 이 짧은 기간 (즉, 3-5 분) 안에 항체의 급속한 확산을 방지하고 단지 내트라바스 내 세포가 표지됩니다. 표준 림프구 절연 프로토콜에 따라, 비대 혈관 세포대 는 유동 세포 세포를 사용하여 쉽게 구별될 수 있다.
여기서, 우리는13일전에 CD45.1+ P14 T 세포 및 LCMV 감염을 받은 C57BL/6 마우스를 사용하여 신장 CD8+ T 세포의 신장CD8+ T 세포의 내트라바스 내 라벨링, 림프구 절연 및 유동 세포 측정 분석을 수행하기 위해 TRM 실험실에서 일반적으로 사용되는 표준 프로토콜을 설명할 것이다. 동일한 프로토콜은 신장에 있는 이펙터 및 메모리 T 세포를 둘 다 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 따라 수행된 모든 동물 실험은 각 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 합니다. 여기에 설명 된 모든 절차는 IACUC UT 건강 샌 안토니오에 의해 승인되었습니다.
1. P14 T 세포의 채택 전달 C57BL/6 받는 사람 및 LCMV 감염
- 6-12 주에 P14 마우스를 사용 하십시오. 기증자 P14 TCR 형질전환 마우스의 성별이 C57BL/6 받는 쥐의 성별과 일치해야 하는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 암컷 마우스로 옮겨지는 남성 T 세포와 같은 세포는 12일 경에 순환하는 기증자 T 세포의 면역 매개 거부를 초래할 것이다14.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 마우스 CD8+ T 세포 정화 키트를 사용하여 P14 TCR 형질형 마우스의 비장 및 림프절에서 순진한 CD8+ T 세포를 정화합니다.
- 간략하게 비장과 림프절을 해부하고 샘플을 으깨서 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
- 순진한 T 세포를 농축하려면, 제1 항체 인큐베이션단계(13)에서비오틴 항 CD44 항체를 첨가한다.
참고: 이 단계에서 사용되는 음의 선택 상용 키트에는 두 단계의 인큐베이션(즉, 비오틴 항체 혼합물 인큐베이션 및 스트렙타비딘 자성 비드 인큐베이션)에 대한 두 가지 주요 성분이 포함되어 있습니다.
- 혈혈계를 사용하여 세포를 계산하고 200 μL에 1,000 ~10,000개의 정제된 P14 T 세포를 꼬리 정맥을 통해 각 성일치 C57BL/6 수신자에게 주입한다.
참고: 상세한 꼬리 정맥 주입 프로토콜은 2단계에서 설명됩니다. - 다음 날, 모든 C57BL/6 수신자는 복막 경로를 통해 PBS의 200 μL에서 희석된 2 x 105 pfu LCMV 암스트롱을 받습니다.
2. CD8+ T 셀의 내트라바스큘러 라벨링
참고: 연구 관심사에 따라 감염 후 다른 시간 점을 선택할 수 있습니다. 일 30 포스트 감염의 예 (단계 후 30 단계 1.4) 종종 CD8 T 세포 응답에 대한 초기 메모리 시간 지점으로 간주됩니다.
- PBS에서 비오틴 항 CD8α 항체를 15 μg/mL로 희석시다. 각 마우스가 3μg 항체를 포함하는 PBS의 200 μL을 수신하도록 합니다.
참고: 비오틴 안티 CD8 항체는 최종 FACS 염색 패널을 설계하는 것이 더 유연할 수 있도록 여기에 사용됩니다. 형광염표지 항체는 직접 사용될 수 있다. 그러나, FACS 염색 대 정맥 라벨링에 대 한 단일 클론 항체의 다른 클론을 사용 하 여 중요 하다. - 마우스의 꼬리 정맥을 5-10분 동안 오버 헤드 열램프로 가열하여 정맥을 팽창시킵니다.
참고: 동물과과열을 방지하기 위해 각별한 주의를 기울여야 합니다. 마우스가 움직이지 않으면 열을 줄이거나 열램프를 제거합니다. - 100 U 인슐린 주사기(28G)에 미리 희석된 안티 CD8α 항체 혼합물의 200 μL을 끌어내고 피스톤을 위아래로 이동하여 기포를 제거합니다. 바늘을 구부려 바늘과 주사기 사이에 150° 각도를 만들고, 벨위로, 그래서 바늘은 정맥과 평행할 것입니다.
- 적절한 크기의 설치류 억제제로 마우스를 억제하고 70%에탄올로 꼬리를 스프레이하여 정맥을 명확하게 볼 수 있도록 합니다.
참고: 구속 기간은 최소한으로 유지되어야 합니다. - 지배적이지 않은 손의 엄지와 가운데 손가락으로 말단 끝에 꼬리를 잡습니다. 바늘이 삽입될 사이트 아래에 검지 손가락을 놓습니다.
- 주사기를 지배적인 손으로 잡고 바늘을 정맥에 넣고 심장의 방향을 향해 평행하게 삽입합니다.
참고: 올바르게 배치할 때 바늘은 정맥으로 원활하게 이동해야 합니다. - 꼬리 정맥을 통해 200 μL의 항 CD8α 항체를 천천히 주입하십시오.
참고: 꼬리에 바늘 위에 저항 또는 백색 영역이 보이는 경우, 바늘은 정맥 안쪽에 있지 않습니다. 꼬리 끝 부분에 가까운 초기 주입을 시작합니다. 필요한 경우, 후속 주사에 대 한 꼬리의 바닥을 향해 앞으로 이동. - 바늘을 제거하고 출혈이 멈출 때까지 압축을 부드럽게 적용합니다.
- 마우스를 케이지로 되돌리고 3-5분 후에 마우스를 안락사시하십시오.
참고: 마우스는 자궁 경부 탈구 다음에 이소플루란 챔버를 통해 안락사되어야 합니다. CO2 흡입과 같은 다른 방법은 최대 5분이 소요되며 정맥 내 항체 라벨링 시간의 불필요한 변화를 유발할 수 있다. - 가위를 사용하여 신장을 해부하고, 신장 전체를 미세 원심 분리 튜브의 1.5 mL로 옮기고 추가 처리가 될 때까지 샘플을 얼음 위에 둡니다.
참고: 손상되지 않은 전체 신장은 후속 처리 및 소화 전에 몇 시간 동안 얼음에 안전하게 보관할 수 있습니다.
3. 신장의 효소 소화
- 각 마우스에 3mL의 소화용액(RPMI/2% FCS/1 mg/ml 콜라게나아제 B)을 함유한 6개의 웰 플레이트를 준비하여 얼음 위에 보관합니다.
참고: 주식 콜라게나아제 B 용액이 농도가 높은(예: 20x)에서 -20°C 이하로 제조 및 보관할 수 있습니다. 작업 솔루션은 신선하게 준비해야 합니다. 현재 프로토콜에 사용되는 모든 솔루션/버퍼에 대한 레시피에 대한 표 1을 참조하십시오. - 1.5mL 마이크로센심분리기 샘플 튜브에 300 μL의 소화 용액을 추가하고 신장 샘플을 직선 스프링 가위로 다진다.
참고: 신장 조직은 직경이 1.5mm 이하의 크기로 균일한 조각으로 잘라야 합니다. 캡슐화 단계가 필요하지 않습니다. - 다진 신장 샘플을 소화 용액을 함유한 6개의 웰 플레이트로 이송
참고: 6개의 웰 플레이트는 처리해야 할 샘플이 여러 개 있을 때만 편의를 위해 사용됩니다. - 37°C에서 부드러운 흔들림(약 60rpm)으로 샘플을 45분 동안 배양합니다.
- 소화 후, 접시 내부에 직접 3mL 주사기의 플런저 플랜지로 조직을 으깨고 15mL 원문 튜브로 옮김합니다.
참고: 밀도 그라데이션 원심분리가 살아있는 림프구를 정화하기 위해 옆에서 수행되기 때문에 일반적으로 세포 스트레이너를 통한 여과는 이 단계에서 필요하지 않습니다. - 4°C에서 5분 동안 500 x g의 샘플을 회전시.
- RPMI/10% FCS의 3mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
4. 소화된 신장에서 림프구를 풍부하게 하기 위한 밀도 그라데이션 원심분리
- 4°C에서 5분 동안 500 x g의 샘플을 회전시.
- 상체를 제거하고 44 % Percoll / RPMI 믹스 (44 % Percoll + 56 % FBS없이 RPMI)의 5 mL로 셀 펠릿을 다시 중단하십시오.
- 각 튜브의 바닥에 67% Percoll/PBS(67% Percoll + 33% PBS)의 3mL을 함유한 3mL 파이펫의 끝을 넣고, 무거운 용액(67% Percoll/PBS)이 바닥에 뚜렷한 층을 형성하고 광용액(Percoll/RPMI)이 상승하도록 솔루션을 천천히 방출한다. 함께 칵테일 레이어가 형성됩니다.
참고: 공급업체에서 새로 도착한 밀도 그라데이션 배지의 경우 1/10 부피의 멸균 10x PBS를 병에 넣고 잘 섞고 PBS 균형 밀도 그라데이션 배지를 100% 솔루션으로 고려하십시오. - 가속기와 브레이크 설정을 줄인 실온에서 20분 동안 900 x g로 샘플을 회전시.
참고: 가속기 및 브레이크 설정이 있는 원심분리기의 경우(1-9스케일(최소 1회, 최대 9회)에 가속기용 6개, 브레이크에 4를 사용하십시오. - 조심스럽게 층을 방해하지 않고 원심분리기에서 튜브를 제거;
참고: 분홍색 색상 RPMI 층과 무색 PBS 층 사이에 명확한 림프구 층이 식별됩니다. - 림프구 층을 만지지 않고 이송 파이펫으로 위쪽 레이어를 제거합니다.
- 림프구 층을 새로운 15mL 튜브로 옮기고, 튜브를 PBS/5% FCS로 채우고 튜브를 4-6x 천천히 반전시켜 충분한 혼합을 보장합니다.
참고: 이 단계는 잔류 퍼콜을 씻어내는 것이 중요합니다. - 4°C에서 5분 동안 500 x g의 샘플을 회전시.
- 상체를 제거하고 완전한 RPMI 배지의 500 μL로 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 세포는 유동 세포측정 얼룩에 대한 준비가되어 있습니다.
5. 유동 세포측정물 염색 및 분석
참고: T 림프구에 대한 표준 흐름 세포측정 염색 프로토콜을 따르십시오.
- 각 FACS 염색에 대해 약 1 x 106 셀을 복용하십시오.
참고: FACS 염색에 U-바닥 96 웰 플레이트를 사용합니다. 그러나 제한된 수의 샘플만 있으면 5mL FACS 튜브도 사용할 수 있습니다. - 4°C에서 5분 동안 500 x g의 셀을 회전시. 상부체를 폐기합니다.
- 2.4G2 FcR 차단제의 10 μg/mL을 포함하는 FACS 버퍼의 50 μL에서 각 샘플을 재연 (FCR과 추가 된 FACS 항체 사이의 상호 작용을 차단하는 안티 CD16/32 단일 클론 항체). 15분 동안 얼음에 배양합니다.
- 추가 원심 분리없이, 최종 염색 부피가 100 μL / 각 샘플되도록 각 샘플에 대한 표면 염색 항체 혼합물의 50 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양.
참고: CD8α+ 내트라바스 CD8+ T 세포를 라벨로 표시하고 모든 CD8 T 세포에 라벨을 붙이는 형광 성 연쇄상 구균(2 μg/mL 또는 제조업체의 권장 사항을 따르십시오)을 포함합니다. 항체 혼합물은 FACS 버퍼에 원하는 양의 관심 있는 항체를 첨가하여 만들어집니다. - PBS로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 차가운 PBS와 96 웰 플레이트의 우물을 채우고, 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 회전하고 상수판을 폐기하십시오.
- 희석 된 라이브 / 죽음의 염료의 100 μL / 웰에서 세포를 다시 중단합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양.
참고: 밀도 그라데이션 배지 스핀이 있더라도 효소 소화 단계는 ARTC2.2/P2RX7 신호15로인해 조직 거주자 T 세포에서 중요한 세포 사멸을 유도합니다. 라이브/데스 염료 염색은 고정 하기 전에 적극 권장 합니다. 항-ARTC2 nanobody 세포 격리 유도 세포 죽음을 방지 하기 위해 안락사 전에 마우스로 관리 될 수 있습니다. - FACS 버퍼로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 차가운 FACS 버퍼와 96 웰 플레이트의 우물을 채우고, 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 회전하고 상체를 폐기하십시오.
- 100 μL/웰 고정 버퍼에서 셀을 다시 일시 중지합니다. 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
참고: 고정 버퍼는 PBS로 포름알데히드를 2% 포름알데히드의 최종 농도로 희석하여 신선하게 만들어집니다. - FACS 버퍼로 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척에 대해, 차가운 FACS 버퍼와 96 웰 플레이트의 우물을 채우고, 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 회전하고 상체를 폐기하십시오.
- 250 μL/잘 FACS 버퍼에서 셀을 다시 중단합니다. 플레이트를 밀봉하고 4°C에 보관하고 FACS 분석까지 빛으로부터 보호하십시오.
참고: FACS 분석 전에 70 μM 나일론 메시를 통해 샘플을 필터링하여 FACS 기계를 막을 수 있는 가능한 셀 클러스터를 제거합니다.
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Representative Results
여기에 설명된 프로토콜은 플로우차트(그림 1A)로요약되어 있습니다. 30 일째LCMV 감염, 우리는 CD8+ T 세포의 내트라바스큘러 라벨링을 수행했습니다. 5분 후, 동물의 두 신장은 해부되고, 다진 후 콜라게나아제 소화를 당했습니다. 림프구는 Percoll 원심분리를 통해 소화된 시료로부터 더 정제되었고 유동 세포측정에 의해 분석되었다. 도 1B에도시된 바와 같이, 밀도 원심분리-매개 림프구 농축 후에도 최종 제품에서 비 림프구의 상당 부분을 보는 것이 매우 일반적이었다. 그러나, 살아있는 림프구에 게이팅 후, CD8+ T 림프구를 쉽게 식별 할 수 있었다. 우리는 항암 CD8+ T 세포를 구별 할 수 있습니다. CD8+ T 세포에 CD8α 및 CD8β의 높은 상관발식 패턴으로 인해, CD8α-CD8β FACS 프로파일에 대각선 패턴을 나타낼 것으로 예상된다. 예상대로, 만 사치CD8+ T 셀은 효율적으로 CD69의 강화 조절 및 Ly6C(그림 1B)의조절과 같은 TRM 표현형을 획득했다. 우리의 실험에서, 우리는 친근한 마커 CD45.1을 가진 기증자 P14 T 세포에 관심이 있었습니다. 동일한 프로토콜을 사용하여 내인성 숙주 유래 CD8+ T 세포도 검사할 수 있다. 감염된 마우스와 는 달리, SPF 시설에 수용된 젊은 순진한 마우스로부터 분리된CD8+ T 세포의 대다수는 i.v. CD8α 항체로 표지되었고, 따라서, 내트라바산 구획(도1C)에속했다.
그림 1: 대표적인 결과.
(A)프로토콜의 순서도. (B)30일째 감염 후, 신장 림프구는 혈류 세포측정에 의해 분석되었다. 대표적인 FACS 프로필 과 게이팅 전략이 표시됩니다. 숫자는 부모 집단의 게이트 하위 집합의 백분율을 나타냅니다. (C)naïve 마우스로부터 분리 된 신장 CD8+ T 세포의 대표적인 FACS 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 제조 법 | 참고 |
| 100% 퍼콜 | 퍼콜 9권 + 10xPBS 1부 | |
| 44% 퍼콜/RPMI | 44% 100% 퍼콜 + 56% Vol 세럼 무료 RPMI | 100% 퍼콜에서 신선하게 제작 |
| 67% 퍼콜/PBS | 67% 100% 퍼콜 + 33% Vol PBS | 100% 퍼콜에서 신선하게 제작 |
| 소화 버퍼 | RPMI + 2% FCS + 1mg/ml 콜라게나아제 B | 콜라게나제 육수로 신선하게 만든 |
| PBS/5% FCS 세척 버퍼 | PBS + 5% FCS | |
| FACS 버퍼 | PBS + 2% FCS + 0.02% NaN3 | 4°C에 보관 |
| 버퍼 고정 | PBS + 2% 포름알데히드 | RT에 저장되고 빛으로부터 보호 |
표 1: 현재 프로토콜에 사용되는 모든 솔루션 및 버퍼에 대한 레시피 목록입니다.
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Discussion
조직 특정 면역은 연구의 급속한 확장 영역으로, 축적 증거는 면역 세포, 특히 림프구 인구성인 인간 또는 감염 또는 예방 접종 마우스에 거의 모든 기관에서 식별 될 수 있음을 시사한다. LCMV 마우스 감염 모델은 여러 조직에 걸쳐 TRM 생물학을 포함하는 항원 특이적 T 세포 반응, 이펙터 및 메모리 T 세포 분화를 연구하는 잘 확립된 모델이다. 여기서, 우리는 신장에 있는 CD8+ T 세포를 분석하는 프로토콜을 기술했습니다. 이 프로토콜은 TRM12에초점을 맞춘 출판물에서 크게 조정됩니다. 아마도 높은 수준의 P2RX7 발현 및 효소 소화 유도 세포사멸(15)으로인해, 전류 프로토콜로부터 림프구 수율은 즉각적인 표현성 분석에 가장 적합하다. 그러나, P2RX7 유도세포사멸을억제하는 확립된 프로토콜을 통해, 현재 의정서가 쉽게 변형될 수 있다고 생각할 수 있다(예를 들어, P2RX7 시그널링을 차단하는 억제제를 첨가하여) 세포 생존을 증가시키고 다른 장기 기능적 분석법에 적합하다. P2RX7 억제제가 관심 있는 기능적 저심을 방해하지 않도록 적절한 대조군을 포함시켜야 합니다.
신장 CD8+ TRM 세포는 감염 또는 환경 항원에 반응하여 크게 생성됩니다. 우리는 5-6 주 된 순진한 C57BL/6 마우스에서 분리 된 신장 CD8+ T 세포를 직접 분석하기 위해 인트라바스큘러 라벨링 프로토콜을 사용합니다. 발표된결과(17)와일치하여, 이러한 "깨끗한" 마우스에 거의 사치스러운CD8+ T 세포가 없다(도1C). 우아한 연구는 비 림프구 조직에서 확인 된 메모리 CD8+ T 세포의 대부분은 TRM10것을입증했다. 대조적으로, 유사한 감염 시스템을 사용하여, 우리는 종종 CD69의 중요한 인구를검출합니다 - 세포 (대부분 TEM 세포 또는 CD69- TRM 세포를 나타냅니다) 심지어 화반 구획에서. 불일치는 1) 상이한 기술이 사용되는 사실, 즉, 현미경 대 유동 세포측정법 으로 인해 발생할 수 있습니다. 2) 초기 대 늦은 메모리 시간 포인트는 초점을 맞추고 3) CD69TRM을식별 하는 완벽 한 마커. 효소 소화 및 유동 세포측정은 TRM 세포의 총 수를 크게 과소 평가합니다. 그러나, 편리하고 비 노동 집약적인 프로토콜로, 그것은 아직도 대부분의 TRM 연구 결과에서 일반적으로 받아들여집니다.
TRM 세포를 확실하게 식별하는 금 본위제는 파라바이오시스 실험을 수행하는 것입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 신장 거주자 T 세포를 확인하는 편리한 방법을 제공하지만, 이 프로토콜의 결과는 마우스가 안락사될 때, T 세포가 신장에 있는 혈관 외부에 거주하고 있다는 것을 증명합니다. 이 프로토콜만으로는 T 셀의 마이그레이션 기록에 대한 정보를 제공하지 않습니다.
감염 이외에, 자가면역 반응을 포함하는 임의의 신장 표적화 면역 반응은 유사한 프로토콜을 사용하여 연구될 수 있다 신장 거주자 T 세포의 중요한 부분 집합의 분화를 유도할 수 있다. 또한,12이전에설명된 바와 같이, 이 프로토콜은 다른 신장 거주자 면역 세포를 연구하기 위해 항 CD45 항체(모든 조혈 세포를 라벨)를 사용하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 함께, 우리는 감염 및 자기 면역을 포함하여 다양한 모델에 적응할 수 있는 신장에서 CD8+ T 세포를 분리하고 분석하는 비교적 편리한 방법을 보여주었습니다.
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Disclosures
저자는 관련 재무 공시가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 AI125701 및 AI139721, 암 연구소 클립 프로그램 및 미국 암 학회는 N.Z에 RSG-18-222-01-LIB를 부여하여 지원됩니다. 플로우 세포측정 시설에서 카를라 고레나와 세바스찬 몬타그니노에게 감사드립니다. 플로우 세포측정 공유 자원 시설에서 생성된 데이터는 샌안토니오 텍사스 대학교 건강 과학 센터(UTHSCSA), NIH/NCI 보조금 P30 CA054174-20(UTHSCSA의 임상 및 번역 연구 센터 [CTRC] 및 UL1 TR001120(임상 및 번역 과학 상)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
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