Summary
Efter virusinfektion, nyre havne et relativt stort antal CD8+ T-celler og giver mulighed for at studere ikke-slimhinde TRM celler. Her beskriver vi en protokol til at isolere mus nyre lymfocytter for flow cytometri analyse.
Abstract
Væv-hjemmehørende hukommelse T-celle (TRM)er et hastigt voksende område af immunologi forskning. Isolering T-celler fra forskellige ikke-lymfoide væv er et af de vigtigste skridt til at undersøge TRMs. Der er små variationer i lymfocyt isolation protokoller for forskellige organer. Nyre er et vigtigt ikke-lymfoide organ med talrige immuncelleinfiltration især efter patogen eksponering eller autoimmun aktivering. I de seneste år, flere laboratorier, herunder vores egen er begyndt at karakterisere nyre hjemmehørende CD8+ T-celler i forskellige fysiologiske og patologiske indstillinger i både mus og menneske. På grund af den overflod af T lymfocytter, nyre repræsenterer en attraktiv model organ til at studere TRMs i ikke-slimhinde eller ikke-barriere væv. Her vil vi beskrive en protokol, der almindeligvis anvendes i TRM-fokuseredelaboratorier til at isolere CD8+ T-celler fra musenyrerne efter systemisk virusinfektion. Kort, ved hjælp af en akut lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV) infektion model i C57BL/6 mus, vi demonstrere intravaskulære CD8+ T celle mærkning, enzymatisk fordøjelse, og densitet gradient centrifugering at isolere og berige lymfocytter fra musenyrer at gøre prøverne klar til den efterfølgende flow cytometri analyse.
Introduction
Væv-hjemmehørende hukommelse (TRM)T-celler repræsenterer en af de mest rigelige T-celle populationer i voksne mennesker og inficerede mus. TRM-celler giver den første linje i immunforsvaret og er kritisk involveret i forskellige fysiologiske og patologiskeprocesser 1,2,3,4,5. Sammenligne med cirkulerende T-celler, TRM celler bære forskellige overflade markører med unikke transskriptionprogrammer 6,7,8. Udvidelse af vores viden om TRM biologi er nøglen til at forstå T celle svar, som er afgørende for den fremtidige udvikling af T-celle-baserede vacciner og immunterapier.
Ud over almindeligt delte molekylære markører for TRMs på tværs af alle ikke-lymfoide væv, akkumulere beviser tyder på, at væv-specifikke funktioner er en central del af TRM biologi9. Nyre havne mange immunceller, herunder TRM celler efter infektion og giver en stor mulighed for at studere TRM cellebiologi i en ikke-slimhindevæv. Akut LCMV (lymfocytisk choriomeningitis virus) infektion via intraperitoneal rute er en veletableret systemisk infektion model til at studere antigen-specifikke T-celle reaktioner i mus. Infektionen er normalt forsvandt i 7-10 dage i vilde type mus og efterlade et stort antal LCMV-specifikke hukommelse T-celler i en række væv, herundernyrerne 10. P14 TCR (T-celle receptor) transgene mus bære CD8+ T-celler genkende en af de immun-dominerende epitoper af LCMV præsenteret af MHC-I (klasse I større histokompatibilitet kompleks) molekyle H2-Db i C57BL/6 mus. Ved at kombinere medfødt markeret P14 T celle adoptivoverførsel og LCMV infektion i mus, CD8+ effektor og hukommelse T-celler spores, herunder TRM differentiering og homøostase.
I nogle barriere væv, såsom intestinal intraepithelial lymfocytter (IEL) rum og spytkirtler, etablerede lymfocyt isolation procedure giver høj procentdel af TRM celler med minimal blodbårne T-celle forurening i mus LCMV model11. Men i ikke-barriere væv, såsom nyrerne, tæt vaskulære netværk indeholder et stort antal cirkulerende CD8+ T-celler. Det er blevet veldokumenteret, at selv vellykket perfusion ikke effektivt kan fjerne alle cirkulerende CD8+ T-celler. For at overvinde denne tekniske hurdle, intravaskulær antistof farvning er blevet etableret som en af de mest almindeligt anvendte teknikker i TRM labs12. Kort sagt, 3-5 minutter før aktiv dødshjælp, 3 μg/mus anti-CD8 antistof (for at mærke CD8+ T-celler) leveres intravenøst. Intakt blodkar væg forhindrer hurtig diffusion af antistoffet inden for denne korte periode (dvs. 3-5 minutter) og kun intravaskulære celler er mærket. Efter standard lymfocyt isolation protokol, intravaskulær versus ekstravaskulære celler kan let skelnes ved hjælp af flow cytometri.
Her vil vi beskrive en standardprotokol, der almindeligvis anvendes i TRM labs til at udføre intravaskulær mærkning, lymfocytisolering og flow cytometri analyse af nyre CD8+ T-celler ved hjælp af en C57BL/6 mus, der har modtaget CD45.1+ P14 T-celler og LCMV infektion 30 dage før13. Samme protokol kan bruges til at studere både effektor og hukommelse T-celler i nyrerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg, der udføres efter denne protokol, skal godkendes af den respektive institutionelle komité for dyrepleje og -anvendelse (IACUC). Alle procedurer, der er beskrevet her, er blevet godkendt af IACUC UT Health San Antonio.
1. Adoptivoverførsel af P14 T-celler til C57BL/6-modtagere og LCMV-infektion
- Brug P14 mus i alderen 6-12 uger. Sørg for, at kønnet på donor P14 TCR transgene mus skal matche køn C57BL/6 modtager mus. Ellers vil celler som mandlige T-celler, der overføres til hunmus, resultere i immunmedieret afvisning af cirkulerende donor-T-celler i omkring 12dage 14.
- Rens naive CD8+ T-celler fra milten og lymfeknuderne på en P14 TCR transgene mus ved hjælp af mus CD8+ T celle rensning kit efter producentens protokol.
- Kort, dissekere milt og lymfeknuder, mash prøverne til at generere enkelt celle suspension.
- For at berige for naive T-celler, tilsæt biotin-anti-CD44 antistof under det første antistof inkubationtrin13.
BEMÆRK: Negativ udvælgelse kommercielle kit, der anvendes i dette trin indeholder to store komponenter til to trin i inkubation (dvs. biotin-antistof blanding inkubation og streptavidin-magnetisk perle inkubation).
- Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne og injicere 1.000 til 10.000 rensede P14 T-celler i 200 μL PBS i hvert køn matchede C57BL/6-modtageren via halevenen.
BEMÆRK: Detaljeret hale vene injektion protokol er beskrevet i trin 2. - Den næste dag modtager alle C57BL/6-modtagere 2 x 105 pfu LCMV Armstrong fortyndet i 200 μL PBS via en intraperitoneal rute.
2. Intravaskulær mærkning af CD8+ T-celler
BEMÆRK: Afhængigt af forskningsinteresserne kan der vælges forskellige tidspunkter efter infektion. Et eksempel på dag 30 post infektion (dag 30 efter trin 1.4) er påvist, som ofte betragtes som en tidlig hukommelse tidspunkt for CD8 T celle respons.
- Fortyndet biotin anti-CD8α antistof til 15 μg/ml i PBS. Sørg for, at hver mus modtager 200 μL PBS indeholdende 3 μg antistof.
BEMÆRK: Biotin anti-CD8 antistof bruges her, så det vil være mere fleksibelt at designe den endelige FACS farvning panel. Fluorescerende farvestof-mærket antistof kan anvendes direkte. Det er dog vigtigt at bruge forskellige kloner af monoklonale antistoffer til intravenøs mærkning versus FACS farvning. - Korrekt varme hale vene af mus med en overhead varmelampe i 5-10 min at spile venerne.
BEMÆRK: Der skal være ekstra forsigtighed for at undgå overophedning af dyrene. Reducer varmen eller fjern varmelampen, hvis musene stoppede for at bevæge sig rundt. - Tegn 200 μL prediluteret anti-CD8α antistofblanding i en 100 U-insulinsprøjte (28G), og fjern eventuelle luftbobler ved at flytte stemplet op og ned. Bøj nålen for at skabe en 150° vinkel mellem nålen og sprøjten, facet op, så nålen vil være parallel med venen.
- Begrænse musen med en gnaver fastholdende af passende størrelse og spray halen med 70% ethanol for at gøre venen klart synlig.
BEMÆRK: Fastholdelsesanordningens varighed skal holdes på et minimum. - Hold halen i den distale ende med tommelfinger og midterste fingre af den ikke-dominerende hånd. Placer pegefingeren under det sted, hvor nålen skal indsættes.
- Hold sprøjten med den dominerende hånd og sæt nålen ind i venen parallelt mod hjertets retning.
BEMÆRK: Når nålen anbringes korrekt, skal den bevæge sig jævnt ind i venen. - Injicer langsomt 200 μL anti-CD8α antistof via hale venen.
BEMÆRK: Hvis der er modstand, eller der ses et hvidt område over nålen på halen, er nålen ikke inde i venen. Start den første injektion tæt på spidsen af halen. Når det er nødvendigt, gå fremad mod bunden af halen for efterfølgende injektioner. - Fjern nålen og påfør forsigtigt kompression, indtil blødningen stopper.
- Returner musen til buret, og aflive musen efter 3-5 min.
BEMÆRK: Musene skal aflives via isofluranekammeret efterfulgt af cervikal dislokation. Andre metoder, såsom CO2 indånding vil tage op til 5 min og kan indføre unødvendig variation af intravenøs antistof mærkning tid. - Dissekere nyrerne ved hjælp af en saks, overføre hele nyrerne til 1,5 ml mikrocentrifugerør og lade prøverne blive på is indtil videre behandling.
BEMÆRK: Intakt hele nyre kan opbevares sikkert på is i et par timer før efterfølgende behandling og fordøjelse.
3. Enzymatisk fordøjelse af nyrerne
- Der tilberedes 6 brøndplader, der indeholder 3 ml fordøjelsesopløsning (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Collagenase B) for hver mus, opbevares på is.
BEMÆRK: Stock collagenase B-opløsning ved højere koncentration (f.eks. 20x) kan tilberedes og opbevares ved eller under -20°C. Arbejdsløsningen skal tilberedes på en frisk måde. Se tabel 1 for opskrifterne på alle løsninger/buffere, der bruges i den aktuelle protokol. - Der tilsættes 300 μL fordøjelsesopløsning i de 1,5 ml mikrocentrifugeprøverør, og nyreprøverne hakkes af med en lige fjedersaks.
BEMÆRK: Nyrevævet skal hakkes i lige stykker med størrelser, der ikke er større end 1,5 mm i diametre. Der kræves ingen decapsulationstrin. - Overfør de hakkede nyreprøver til 6 brøndplader, der indeholder fordøjelsesopløsningen
BEMÆRK: 6 brøndplader anvendes kun for nemheds skyld, når der er flere prøver, der skal behandles. - Prøverne inkuberes ved 37 °C med skånsom rokkende (ca. 60 omdr./min.) i 45 min.
- Efter fordøjelsen, mos vævet med stemplet flange af en 3 ml sprøjte direkte inde i skålen, og overføres til 15 ml koniske rør.
BEMÆRK: Normalt filtrering gennem en celle si er ikke påkrævet på dette trin, fordi densitet gradient centrifugering udføres ved siden af rense levende lymfocytter. - Prøverne drejes ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Opsaltning af pellet i 3 ml RPMI/10% FCS.
4. Densitet gradient centrifugering til at berige lymfocytter fra den fordøjede nyre
- Prøven drejes ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspend cell pellet med 5 ml af 44% Percoll / RPMI mix (44% Percoll + 56% RPMI uden FBS).
- Sæt spidsen af en 3 ml pipette indeholdende 3 ml på 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) direkte til bunden af hvert rør, og slip langsomt opløsningen, så den tunge opløsning (67% Percoll/PBS) danner et særskilt lag i bunden, og den lette opløsning (44% Percoll/RPMI) hæves. Sammen vil cocktail lag danne.
BEMÆRK: For nyligt ankomne tæthedsgradientmedium fra sælgeren tilsættes 1/10 volumen steril 10x PBS til flasken, bland godt og overvej pbs-balanceret gradient medium som 100% opløsning. - Drej prøverne ved 900 x g i 20 minutter ved stuetemperatur med reduceret accelerator og bremseindstilling.
BEMÆRK: For centrifuger med speeder- og bremseindstillinger (på 1-9 skala (1 betyder minimum og 9 betyder maksimum)), skal du bruge 6 til speeder og 4 til bremse. - Fjern forsigtigt rørene fra centrifugen uden at forstyrre lagene;
BEMÆRK: En klar lymfocyt lag er identificeret mellem pink farve RPMI lag og farveløs PBS lag. - Fjern det øverste lag med en overførselspipette uden at røre ved lymfocytlaget.
- Lymfocytlaget overføres til et nyt 15 ml rør, fyld røret med PBS/5% FCS og bland ved at vende røret 4-6x langsomt for at sikre tilstrækkelig blanding.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt at vaske eventuelle resterende Percoll. - Prøverne drejes ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten, og genspjærk cellepellet med 500 μL komplet RPMI-medium. Cellerne er klar til flow cytometri farvning.
5. Flow cytometri farvning og analyse
BEMÆRK: Følg standardflow cytometri farvning protokol for T lymfocytter.
- Tag omkring 1 x 106 celler for hver FACS farvning.
BEMÆRK: Brug en U-bund 96 brøndplade til FACS-farvning. Hvis der kun er tale om et begrænset antal prøver, kan der dog også anvendes 5 ml FACS-rør. - Cellerne drejes ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Hver prøve opsaltes igen i 50 μL FACS-buffer, der indeholder 10 μg/ml 2,4 G2 FcR-blokker (et anti-CD16/32 monoklonalt antistof for at blokere interaktionen mellem tilsat FACS-antistof med FcR). Inkuber på is i 15 min.
- Uden yderligere centrifugering tilsættes 50 μL overfladefarvningsantistofblanding for hver prøve, således at det endelige farvningsvolumen er 100 μL/hver prøve. Inkuber på is i 30 minutter i mørke.
BEMÆRK: Medtag fluorescerende mærket streptavidin (2 μg/ml eller følg producentens anbefaling) i antistofblandingen for at mærke CD8α+ intravaskulære CD8+ T-celler, og brug fluorescerende mærket anti-CD8β antistof til at mærke alle CD8 T-celler. Antistofblandingen foretages ved at tilsætte de ønskede mængder interesserede antistoffer i FACS-bufferen. - Prøverne vaskes to gange med PBS. For hver vask fyldes brøndene på 96 brøndpladen med kold PBS, drejes ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C og supernatanten kasseres.
- Cellerne opspærses igen i 100 μL/brønd af fortyndet levende/dødsfarvestof. Inkuber på is i 30 minutter i mørke.
BEMÆRK: Selv med densitet gradient medium spin, enzymatisk fordøjelse trin ofte inducerer betydelig celledød i væv-hjemmehørende T-celler på grund af ARTC2.2/P2RX7 signalering15. Levende/ død farvefarvning anbefales stærkt før fiksering. Anti-ARTC2 nanostof kan administreres i mus før aktiv dødshjælp for at forhindre celle isolation-induceret celledød. - Prøverne vaskes to gange med FACS-buffer. For hver vask fyldes brøndene på 96-brøndpladen med kold FACS-buffer, drejes ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C og supernatanten kasseres.
- Opslænke cellerne i 100 μL/brøndbindende buffer. Inkuberes ved 37 °C i 10 min.
BEMÆRK: Fiksebuffen laves frisk ved at fortynde formaldehyd med PBS til en endelig koncentration på 2% formaldehyd. - Prøverne vaskes to gange med FACS-buffer. For hver vask fyldes brøndene på 96 brøndpladen med kold FACS-buffer, drejes ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C og supernatanten kasseres.
- Resuspend cellerne i 250 μL /well FACS buffer. Pladen forsegles, opbevares ved 4 °C og beskyttes mod lys indtil FACS-analysen.
BEMÆRK: Før FACS-analysen filtreres prøverne gennem et 70 μM nylonnet for at fjerne eventuelle celleklynger, der kan blokere FACS-maskinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol, der er beskrevet her, er opsummeret i et rutediagram (Figur 1A). På dag 30 post LCMV infektion, vi udførte intravaskulær mærkning af CD8+ T-celler. 5 minutter senere, begge nyrer af dyret blev dissekeret, hakket og udsat for kollagenase fordøjelsen. Lymfocytter blev yderligere renset fra de fordøjede prøver via Percoll centrifugering og analyseret af flow cytometri. Som vist i figur 1Bvar det også efter centrifugeringsmedieret lymfocytberigelse , selv efter massen i centrifugeringsmediet lymfocyt berigelse meget almindeligt at se en stor del af ikke-lymfocytter i slutproduktet. Men efter gating på levende lymfocytter, var det let at identificere CD8+ T lymfocytter. Vi kunne skelne intravaskulær vs ekstravaskulære CD8+ T-celler. På grund af det meget korrelerende udtryksmønster af CD8α og CD8β på CD8+ T-celler forventes det, at intravaskulære CD8+ T-celler udviser et diagonalt mønster på CD8α-CD8β FACS-profilen. Som forventet kun ekstravaskulær CD8+ T-celle effektivt erhvervet TRM fænotyper, såsom opregulering af CD69 og nedregulering af Ly6C (Figur 1B). I vores eksperimenter var vi interesseret i donor P14 T-celler med medfødt markør CD45.1. Ved hjælp af den samme protokol, endogene vært afledt CD8+ T-celler kan undersøges så godt. I modsætning til inficerede mus blev langt størstedelen af CD8+ T-celler, der var isoleret fra unge naive mus i SPF-anlægget, mærket med i.v. CD8α antistof og tilhørte derfor det intravaskulære rum (Figur 1C).
Figur 1: Repræsentative resultater.
(A) Protokollens rutediagram. (B) På dag 30 efter infektion, nyre lymfocytter blev analyseret ved flow cytometri. Repræsentative FACS-profiler og gating-strategi vises. Tallene angiver procentdelen af indhegnede undersæt i deres forældrepopulation. c) Repræsentativ FACS-profil for nyre-CD8+ T-celler, der er isoleret fra en naiv mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Opskrift | Bemærk |
| 100% Percoll | 9 bind percoll + 1 volumen af 10xPBS | |
| 44% Percoll/RPMI | 44% Vol. af 100% Percoll + 56% Vol serumfri RPMI | Frisk fra 100% Percoll |
| 67% Percoll/PBS | 67% Vol. af 100% Percoll + 33% Vol PBS | Frisk fra 100% Percoll |
| Fordøjelsesbuffer | RPMI + 2% FCS + 1 mg/ml kollagenase B | Lavet frisk fra kollagenase lager |
| PBS/5% FCS vaskebuffer | PBS + 5% FCS | |
| FACS-buffer | PBS + 2% FCS + 0,02% NaN3 | Opbevares ved 4°C |
| Fastgør buffer | PBS + 2% formaldehyd | Opbevares i RT og beskyttet mod lys |
Tabel 1: Liste over opskrifter på alle løsninger og buffere, der bruges i den aktuelle protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som vævsspecifik immunitet er et hurtigt voksende forskningsområde, tyder akkumulerende beviser på, at immunceller, især lymfocytter befolkning kan identificeres i næsten alle organer i voksne mennesker eller inficerede eller immuniserede mus. LCMV mus infektion model er en veletableret model til at studere antigen-specifikke T-celle respons, effektor og hukommelse T celle differentiering herunder TRM biologi på tværs af flere væv. Her beskrev vi en protokol til at analysere CD8+ T-celler i nyrerne. Denne protokol er i vid udstrækning tilpasset fra publikationer med fokus på TRM12. Formentlig på grund af højt niveau P2RX7 udtryk og enzymatisk fordøjelse induceret celledød15,lymfocytter udbytte fra den nuværende protokol er bedst egnet til øjeblikkelig fænocypic analyse. Men med etableret protokol til at hæmme P2RX7 induceret celledød16,er det tænkeligt, at den nuværende protokol let kan ændres (f.eks med tilsætning af inhibitorer til at blokere P2RX7 signalering) for at øge cellens overlevelse og være egnet til andre langsigtede funktionelle analyser. Der bør medtages passende kontrolgrupper for at sikre, at P2RX7-hæmmere ikke forstyrrer interesserede funktionelle analyser.
Nyre CD8+ TRM celler er i vid udstrækning genereret som reaktion på infektion eller miljømæssige antigener. Vi har brug intravaskulær mærkning protokol til direkte at analysere nyre CD8+ T-celler isoleret fra 5-6-ugergamle naive C57BL/6 mus. I overensstemmelse medoffentliggjorte resultater 17er der næsten ingen ekstravaskulære CD8+ T-celler i disse "rene" mus (Figur 1C). En elegant undersøgelse har vist, at størstedelen af hukommelsen CD8+ T-celler identificeret i ikke-lymfoide væv er TRM10. I modsætning hertil, ved hjælp af en lignende infektion system, vi ofte opdage en betydelig population af CD69- celler (sandsynligvis repræsenterer TEM-celler eller CD69- TRM celler) selv i det ekstravaskulære rum. Uoverensstemmelsen kan skyldes de faktiske omstændigheder, at 1) forskellige teknikker anvendes, dvs mikroskop vs flow cytometri; 2) tidlig vs sen hukommelse tidspunkter er fokuseret og 3) CD69 er ikke en perfekt markør til at identificere TRM. Enzymatisk fordøjelse og flow cytometri vil betydeligt undervurdere det samlede antal TRM-celler. Men som en bekvem og ikke-arbejdskrævende protokol, er det stadig almindeligt accepteret i de fleste TRM undersøgelser.
Guldstandarden til endeligt at identificere TRM-celler er at udføre parabiose eksperiment. Selv om protokollen beskrevet her giver en bekvem måde at identificere nyre-hjemmehørende T-celler, resultaterne fra denne protokol kun bevise, at på det tidspunkt, hvor musene er aflivet, T-cellerne er bosat uden for blodkarrene i nyrerne. Denne protokol alene giver ingen oplysninger om T-cellernes migrationshistorie.
Ud over infektioner, enhver nyre rettet mod immunrespons, herunder autoimmune reaktioner kan fremkalde differentiering af en betydelig delmængde af nyre-hjemmehørende T-celler kan studeres ved hjælp af en lignende protokol. Yderligere, som beskrevet før12, denne protokol kan let ændres til at bruge anti-CD45 antistof (at mærke alle hæmatopoietiske celler) til at studere andre nyre-hjemmehørende immunceller. Sammen viste vi en forholdsvis bekvem måde at isolere og analysere CD8+ T-celler fra nyrerne, som kan tilpasses til forskellige modeller, herunder infektion og autoimmunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante finansielle oplysninger.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af NIH tilskud AI125701 og AI139721, Cancer Research Institute CLIP program og American Cancer Society tilskud RSG-18-222-01-LIB til N.Z. Vi takker Karla Gorena og Sebastian Montagnino fra Flow Cytometri Facility. Data genereret i Flow Cytometri Shared Resource Facility blev støttet af University of Texas Health Science Center i San Antonio (UTHSCSA), NIH/ NCI tilskud P30 CA054174-20 (Klinisk og Translationel Research Center [CTRC] på UTHSCSA), og UL1 TR001120 (Klinisk og Translationel Science Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
