Summary
Etter virusinfeksjon, nyre havner et relativt stort antall CD8+ T celler og tilbyr en mulighet til å studere ikke-slimhinne TRM celler. Her beskriver vi en protokoll for å isolere mus nyrelymfocytter for flytcytometrianalyse.
Abstract
Tissue-resident memory T celle (TRM) er et raskt voksende felt av immunologi forskning. Isolere T-celler fra ulike ikke-lymfoide vev er en av de viktigste trinnene for å undersøke TRMs. Det er små variasjoner i lymfocyttisolasjonsprotokoller for forskjellige organer. Nyre er et viktig ikke-lymfoid organ med mange immuncelleinfiltrasjon, spesielt etter patogeneksponering eller autoimmun aktivering. I de senere årene har flere laboratorier, inkludert våre egne, begynt å karakterisere nyrebosatte CD8+ T-celler i ulike fysiologiske og patologiske innstillinger i både mus og menneske. På grunn av overflod av T-lymfocytter representerer nyre et attraktivt modellorgan for å studere TRMs i ikke-slimhinne- eller ikke-barrierevev. Her vil vi beskrive en protokoll som vanligvis brukes i TRM-fokusertelaboratorier for å isolere CD8+ T-celler fra musenyre etter systemisk virusinfeksjon. Kort, ved hjelp av en akutt lymfatisk choriomeningitt virus (LCMV) infeksjon modell i C57BL/6 mus, viser vi intravaskulær CD8+ T celle merking, enzymatisk fordøyelse, og tetthet gradient sentrifugasjon for å isolere og berike lymfocytter fra mus nyrer for å gjøre prøver klar for den påfølgende flyt cytometri analyse.
Introduction
Tissue-resident minne (TRM) T celler representerer en av de mest tallrike T cellepopulasjoner i voksne mennesker og infiserte mus. TRM-celler gir den første linjen av immunforsvar og er kritisk involvert i ulike fysiologiske og patologiske prosesser1,2,3,4,5. Sammenligner med sirkulerende T-celler, TRM celler bære distinkte overflatemarkører med unike transkripsjonsprogrammer6,7,8. Å utvide vår kunnskap om TRM biologi er nøkkelen til å forstå T celleresponser som er avgjørende for fremtidig utvikling av T-cellebaserte vaksiner og immunterapier.
I tillegg til vanlige delte molekylære markører av TRMs på tvers av alle ikke-lymfoide vev, akkumulerende bevis tyder på at vev-spesifikke funksjoner er en sentral komponent i TRM biologi9. Nyre havner mange immunceller inkludert TRM celler etter infeksjon og gir en flott mulighet til å studere TRM cellebiologi i en ikke-slimhinnevev. Akutt LCMV (lymfatisk choriomeningittvirus) infeksjon via intraperitoneal rute er en veletablert systemisk infeksjonsmodell for å studere antigenspesifikke T-celleresponser hos mus. Infeksjonen er vanligvis løst i 7-10 dager i vill type mus og la et stort antall LCMV-spesifikke minne T-celler i en rekke vev, inkludert nyre10. P14 TCR (T cellereseptor) transgene mus bærer CD8+ T-celler gjenkjenner en av de immundominerende epitopene til LCMV presentert av MHC-I (klasse I store histokompatibilitetskompleks) molekyl H2-Db i C57BL/6 mus. Ved å kombinere congenically merket P14 T celle adoptivoverføring og LCMV infeksjon hos mus, CD8+ effector og minne T celler spores, inkludert TRM differensiering og homeostase.
I noen barrierevev, som intestinal intraepithelial lymfocytter (IEL) rom og spyttkjertler, etablerte lymfocytt isolasjon prosedyre gir høy prosentandel av TRM celler med minimal blodbåren T celleforurensning i mus LCMV modell11. Men i ikke-barriere vev, som nyrene, inneholder tett vaskulært nettverk et stort antall sirkulerende CD8+ T-celler. Det har blitt godt dokumentert at selv vellykket perfusjon ikke effektivt kan fjerne alle sirkulerende CD8+ T-celler. For å overvinne denne tekniske hindringen, intravaskulær antistoff farging har blitt etablert som en av de mest brukte teknikker i TRM laboratorier12. Kort sagt, 3-5 minutter før eutanasi, leveres 3 μg/mus anti-CD8 antistoff (for å merke CD8+ T-celler) intravenøst. Intakt blodkarvegg forhindrer rask diffusjon av antistoffet innen denne korte tidsperioden (det vil at 3-5 minutter) og bare intravaskulære celler er merket. Etter standard lymfocytt isolasjonsprotokoll, intravaskulær versus ekstravaskulære celler kan lett skilles ved hjelp av flytcytometri.
Her vil vi beskrive en standardprotokoll som vanligvis brukes i TRM-laboratorier for å utføre intravaskulær merking, lymfocyttisolering og strømningscytometrianalyse av nyre-CD8+ T-celler ved hjelp av en C57BL/6-mus som har mottatt CD45.1+ P14 T-celler og LCMV-infeksjon 30 dager før13. Samme protokoll kan brukes til å studere både effector og minne T-celler i nyrene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk utført etter denne protokollen må godkjennes av den respektive institusjonelle dyreomsorgs- og brukskomiteen (IACUC). Alle prosedyrer som er beskrevet her har blitt godkjent av IACUC UT Health San Antonio.
1. Adoptivoverføring av P14 T-celler til C57BL/6-mottakere og LCMV-infeksjon
- Bruk P14-mus ved 6-12 ukers alder. Sørg for at kjønnet til donor P14 TCR transgen mus skal samsvare med kjønnet til C57BL/6 mottakermus. Ellers vil celler som mannlige T-celler som overføres til kvinnelige mus føre til immunmediert avvisning av sirkulerende donor T-celler på rundt 12 dager14.
- Rens naive CD8+ T-celler fra milten og lymfeknuter av en P14 TCR transgen mus ved hjelp av musen CD8+ T celle rensing kit etter produsentens protokoll.
- Kort sagt, dissekere milt og lymfeknuter, mos prøvene for å generere encelledepensjon.
- For å berike for naive T-celler, tilsett biotin-anti-CD44 antistoff under det første antistoffinkubasjonstrinn13.
MERK: Negativt utvalg kommersielt sett som brukes i dette trinnet inneholder to hovedkomponenter for to trinn av inkubasjon (det vil si biotin-antistoffblanding inkubasjon og streptavidin-magnetisk perleinkubasjon).
- Bruk et hemocytometer til å telle cellene og injisere 1000 til 10 000 rensede P14 T-celler i 200 μL PBS i hvert kjønn matchet C57BL/6 mottaker via halevenen.
MERK: Detaljert injeksjonsprotokoll for halevene er beskrevet i trinn 2. - Neste dag mottar alle C57BL/6-mottakere 2 x 105 pfu LCMV Armstrong fortynnet i 200 μL PBS via en intraperitoneal rute.
2. Intravaskulær merking av CD8+ T-celler
MERK: Avhengig av forskningsinteressene kan ulike tidspunkter velges etter infeksjon. Et eksempel på dag 30 post infeksjon (dag 30 etter trinn 1.4) er demonstrert, som ofte betraktes som et tidlig minne tidspunkt for CD8 T cellerespons.
- Fortynn biotin anti-CD8α antistoff til 15 μg/ml i PBS. Sørg for at hver mus får 200 μL PBS som inneholder 3 μg antistoff.
MERK: Biotin anti-CD8 antistoff brukes her slik at det vil være mer fleksibelt å designe det endelige FACS-fargepanelet. Fluorescerende fargestoff-merket antistoff kan brukes direkte. Det er imidlertid viktig å bruke forskjellige kloner av monoklonale antistoffer for intravenøs merking versus FACS-farging. - Varm halevenen til mus riktig med en overhead varmelampe i 5-10 min for å utvide venene.
MERK: Det må være ekstra forsiktig for å unngå overoppheting av dyrene. Reduser varmen eller fjern varmelampen hvis musene stoppet for å bevege seg rundt. - Trekk 200 μL forhåndsfortynnet anti-CD8α antistoffblanding i en 100 E insulinsprøyte (28G) og fjern eventuelle luftbobler ved å flytte stempelet opp og ned. Bøy nålen for å skape en 150° vinkel mellom nålen og sprøyten, skråkant opp, slik at nålen vil være parallelt med venen.
- Hold musen med et gnagerehold av passende størrelse og spray halen med 70% etanol for å gjøre venen tydelig synlig.
MERK: Varigheten av sikkerhetsgrensen skal holdes på et minimum. - Hold halen på den distale enden med tommel og midtre fingre på den ikke-dominerende hånden. Plasser pekefingeren under stedet der nålen skal settes inn.
- Hold sprøyten med den dominerende hånden og sett nålen inn i venen parallelt mot hjertets retning.
MERK: Når du plasserer riktig, skal kanylen bevege seg jevnt inn i venen. - Injiser sakte 200 μL anti-CD8α antistoff via halevenen.
MERK: Hvis det er motstand eller et hvitt område er sett over nålen på halen, er kanylen ikke inne i venen. Start den første injeksjonen nær spissen av halen. Om nødvendig, gå fremover mot bunnen av halen for påfølgende injeksjoner. - Fjern nålen og påfør forsiktig kompresjonen til blødningen stopper.
- Returner musen til buret, og euthanize musen etter 3-5 min.
MERK: Musene skal eutaniseres via isoflurankammer etterfulgt av cervikal forvridning. Andre metoder, for eksempel CO 2-innånding, vil ta opptil 5 min og kan introdusere unødvendig variasjon av intravenøs antistoffmerkingstid. - Dissekere nyrene ved hjelp av saks, overfør hele nyren til 1,5 ml mikrocentrifugerør og la prøvene stå på is til videre behandling.
MERK: Intakt hele nyren kan oppbevares trygt på is i noen timer før etterfølgende behandling og fordøyelse.
3. Enzymatisk fordøyelse av nyrene
- Forbered 6 brønnplater som inneholder 3ml av fordøyelsesoppløsningen (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Kollagenase B) for hver mus, oppbevares på is.
MERK: Lagerkollagen B oppløsning ved høyere konsentrasjon (f.eks. 20x) kan tilberedes og lagres ved eller under -20 °C. Arbeidsløsningen skal tilberedes friskt. Se tabell 1 for oppskrifter for all løsning/buffer som brukes i gjeldende protokoll. - Tilsett 300 μL fordøyelsesløsning i 1,5 ml mikrocentrifuge prøverør og hakke nyreprøvene med en rett vårsakse.
MERK: Nyrevevet skal hakkes i like deler med størrelser som ikke er større enn 1,5 mm i diameter. Ingen halshugging trinn er nødvendig. - Overfør hakket nyreprøver til 6 brønnplater som inneholder fordøyelsesløsningen
MERK: 6 brønnplater brukes kun til enkelhets skyld når det er flere prøver som skal behandles. - Inkuber prøvene ved 37 °C med skånsom gynge (rundt 60 o/min) i 45 min.
- Etter fordøyelsen mos vevet med stempelflensen på en 3 ml sprøyte rett inne i parabolen, og overfør til 15 ml koniske rør.
MERK: Vanligvis er filtrering gjennom en cellesil ikke nødvendig på dette trinnet fordi tetthet gradient sentrifugering utføres ved siden av rense levende lymfocytter. - Spinn ned prøvene ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Resuspend pellet i 3 ml RPMI/10% FCS.
4. Tetthet gradient sentrifugasjon for å berike lymfocytter fra fordøyd nyre
- Spinn ned prøven ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern den supernaturlige og gjenoppliv cellepelleten med 5 ml 44 % Percoll/RPMI-blanding (44 % Percoll + 56 % RPMI uten FBS).
- Sett spissen av en 3 ml pipette som inneholder 3 ml 67% Percoll / PBS (67% Percoll + 33% PBS) direkte til bunnen av hvert rør, og sakte slipper løsningen slik at den tunge løsningen (67% Percoll / PBS) danner et tydelig lag nederst og lysløsningen (44% Percoll / RPMI) er hevet opp. Sammen vil cocktaillag dannes.
MERK: For nyankomne tetthetsgradientmedium fra leverandøren legger du til 1/10-volum steril 10x PBS på flasken, bland godt og vurder PBS-balansert tetthetsgradientmedium som 100 % løsning. - Spinn prøvene på 900 x g i 20 min ved romtemperatur med redusert akselerator og bremseinnstilling.
MERK: For sentrifuger med akselerator- og bremseinnstillinger (på en 1-9-skala (1 betyr minimum og 9 betyr maksimum)), bruk 6 for akselerator og 4 for brems. - Fjern forsiktig rørene fra sentrifugen uten å forstyrre lagene;
MERK: Et klart lymfocyttlag er identifisert mellom rosa RPMI-lag i farger og fargeløst PBS-lag. - Fjern det øverste laget med en overføringpipette uten å berøre lymfocyttlaget.
- Overfør lymfocyttlaget til et nytt 15 ml rør, fyll røret med PBS/5% FCS og bland ved å invertere røret 4-6x sakte for å sikre tilstrekkelig blanding.
MERK: Dette trinnet er viktig for å vaske ut eventuelle gjenværende Percoll. - Spinn ned prøvene ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og suspender cellepelleten igjen med 500 μL komplett RPMI-medium. Cellene er klare for strømningscytometrifarging.
5. Flytcytometri farging og analyse
MERK: Følg standard strømningscytometrifargingsprotokoll for T-lymfocytter.
- Ta rundt 1 x 106 celler for hver FACS farging.
MERK: Bruk en U-bunn 96 brønnplate for FACS-farging. Men hvis bare et begrenset antall prøver er involvert, kan 5 ml FACS-rør også brukes. - Spinn ned cellene ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Kast det overnaturlige.
- Bruk hver prøve i 50 μL FACS-buffer som inneholder 10 μg/ml 2,4 G2 FcR-blokkering (et anti-CD16/32 monoklonalt antistoff for å blokkere samspillet mellom det tilsatt FACS-antistoffet med FcR). Inkuber på is i 15 min.
- Uten ytterligere sentrifugering, tilsett 50 μL overflatefarging antistoffblanding for hver prøve, slik at det endelige fargevolumet er 100 μL / hver prøve. Inkuber på is i 30 min i mørket.
MERK: Inkluder fluorescerende merket streptavidin (2 μg/ml eller følg produsentens anbefaling) i antistoffblandingen for å merke CD8α+ intravaskulære CD8+ T-celler og bruk fluorescerende merket anti-CD8β antistoff for å merke alle CD8 T-celler. Antistoffblandingen er laget ved å legge til ønskede mengder interesserte antistoffer i FACS-bufferen. - Vask prøvene med PBS to ganger. For hver vask, fyll brønnene på 96 brønnplate med kald PBS, spinn på 500 x g i 5 min ved 4 °C og kast det overnaturlige.
- Resuspend cellene i 100 μL/ brønn av fortynnet levende / død fargestoff. Inkuber på is i 30 min i mørket.
MERK: Selv med tetthet gradient medium spinn, enzymatisk fordøyelse trinn ofte induserer betydelig celledød i vev-resident T-celler på grunn av ARTC2.2/P2RX7 signalering15. Farging av levende/dødsfarge anbefales på det sterkeste før fiksering. Anti-ARTC2 nanobody kan administreres i musene før eutanasi for å forhindre celleisolasjonsindusert celledød. - Vask prøvene med FACS-buffer to ganger. For hver vask fyller du brønnene på 96-brønnsplaten med kald FACS-buffer, spinner ved 500 x g i 5 min ved 4 °C og kast det overnaturlige.
- Resuspend cellene i 100 μL / brønn festebuffer. Inkuber ved 37 °C i 10 min.
MERK: Festebufferen er laget ferskt ved å fortynne formaldehyd med PBS til en endelig konsentrasjon på 2 % formaldehyd. - Vask prøvene med FACS-buffer to ganger. For hver vask, fyll brønnene på 96 brønnplate med kald FACS buffer, spinn på 500 x g i 5 min ved 4 ° C og kast supernatanten.
- Resuspend cellene i 250 μL / brønn FACS buffer. Forsegle platen, oppbevar ved 4 °C og beskytt mot lys til FACS-analyse.
MERK: Før FACS-analyse må du filtrere prøvene gjennom et 70 μM nylonnett for å fjerne mulige celleklynger som kan tette FACS-maskinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som er beskrevet her, oppsummeres i et flytskjema (figur 1A). På dag 30 post LCMV infeksjon, utførte vi intravaskulær merking av CD8+ T-celler. 5 minutter senere ble begge nyrene av dyret dissekert, hakket og utsatt for kollagen fordøyelse. Lymfocytter ble ytterligere renset fra de fordøyde prøvene via Percoll-sentrifugering og analysert ved strømningscytometri. Som vist i figur 1B, selv etter tetthet sentrifugasjon-mediert lymfocytt berikelse, var det svært vanlig å se en stor del av ikke-lymfocytter i sluttproduktet. Men etter gating på levende lymfocytter, var det lett å identifisere CD8+ T lymfocytter. Vi kunne skille intravaskulær vs ekstravaskulære CD8+ T-celler. På grunn av svært korrelativt uttrykksmønster av CD8α og CD8β på CD8+ T-celler, forventes det at intravaskulære CD8+ T-celler viser et diagonalt mønster på CD8α-CD8β FACS-profil. Som forventet kjøpte bare ekstravaskulær CD8+ T-celle effektivt TRM fenotyper, for eksempel oppregulering av CD69 og nedregulering av Ly6C (figur 1B). I våre eksperimenter var vi interessert i donor P14 T celler med kongen markør CD45.1. Ved hjelp av samme protokoll kan endogene vertavledede CD8+ T-celler også undersøkes. I motsetning til infiserte mus ble de aller fleste CD8+ T-celler isolert fra unge naive mus plassert i SPF-anlegget merket med i.v. CD8α antistoff, og tilhørte derfor det intravaskulære rommet (figur 1C).
Figur 1: Representative resultater.
(A) Flytskjema av protokollen. (B)På dag 30 post infeksjon ble nyrelymfocytter analysert ved strømningscytometri. Representative FACS-profiler og gatingstrategi vises. Tallene indikerer prosentandelen av inngjerdede undergrupper i foreldrebefolkningen. (C) Representativ FACS profil av nyre CD8+ T celler isolert fra en naiv mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Oppskrift | Merk |
| 100% Percoll | 9 volumer Percoll + 1 volum på 10xPBS | |
| 44 % Percoll/RPMI | 44% Vol av 100% Percoll + 56% Vol serumfri RPMI | Laget friskt fra 100% Percoll |
| 67 % percoll/PBS | 67% Vol av 100% Percoll + 33% Vol PBS | Laget friskt fra 100% Percoll |
| Fordøyelsesbuffer | RPMI + 2% FCS + 1mg/ml kollagenase B | Laget fersk av collagenase lager |
| PBS/5% FCS vaskebuffer | PBS + 5% FCS | |
| FACS-buffer | PBS + 2% FCS + 0,02% NaN3 | Lagret ved 4 °C |
| Feste buffer | PBS + 2% formaldehyd | Lagret ved RT og beskyttet mot lys |
Tabell 1: Liste over oppskrifter for all løsning og buffer som brukes i gjeldende protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som vevsspesifikk immunitet er et raskt voksende forskningsområde, akkumulerende bevis tyder på at immunceller, spesielt lymfocytter befolkningen kan identifiseres i nesten alle organer i voksne mennesker eller infiserte eller immuniserte mus. LCMV mus infeksjon modell er en veletablert modell for å studere antigen-spesifikk T celle respons, effektor og minne T celle differensiering inkludert TRM biologi på tvers av flere vev. Her beskrev vi en protokoll for å analysere CD8+ T-celler i nyrene. Denne protokollen er i stor grad tilpasset fra publikasjoner fokusert på TRM12. Antagelig på grunn av høyt nivå P2RX7 uttrykk og enzymatisk fordøyelse indusertcelledød 15,lymfocytter utbytte fra dagens protokoll er best egnet for umiddelbar fenotypisk analyse. Men med etablert protokoll for å hemme P2RX7 indusertcelledød 16,er det tenkelig at den nåværende protokollen lett kan endres (f.eks. med tillegg av inhibitorer for å blokkere P2RX7-signalering) for å øke celleoverlevelse og være egnet for andre langsiktige funksjonelle analyser. Riktige kontrollgrupper bør inkluderes for å sikre at P2RX7-hemmere ikke forstyrrer interesserte funksjonelle analyser.
Nyre CD8+ TRM celler er i stor grad generert som svar på infeksjon eller miljøantigener. Vi har brukt intravaskulær merkingsprotokoll for å analysere nyre CD8+ T-celler isolert fra 5-6 uker gamle naive C57BL/6 mus. I samsvar med publiserte resultater17, er det nesten ingen ekstravaskulære CD8+ T-celler i disse "rene" musene (figur 1C). En elegant studie har vist at flertallet av minne CD8+ T-celler identifisert i ikke-lymfoid vev er TRM10. I motsetning, ved hjelp av et lignende infeksjonssystem, oppdager vi ofte en betydelig populasjon av CD69- celler (mest sannsynlig representerer TEM-celler eller CD69- TRM-celler) selv i det ekstravaskulære rommet. Avviket kan skyldes fakta om at 1) ulike teknikker brukes, det vil si mikroskop vs strømningscytometri; 2) tidlig vs sen minne tidspunkter er fokusert og 3) CD69 er ikke en perfekt markør for å identifisere TRM. Enzymatisk fordøyelse og strømningscytometri vil betydelig undervurdere det totale antall TRM-celler. Men som en praktisk og ikke-arbeidskrevende protokoll, er det fortsatt vanlig akseptert i de fleste TRM-studier.
Gullstandarden for å definitivt identifisere TRM-celler er å utføre parabiosis eksperiment. Selv om protokollen som er beskrevet her gir en praktisk måte å identifisere nyre-resident T-celler, viser resultatene fra denne protokollen bare at på den tiden da musene er eutanisert, bor T-cellene utenfor blodårene i nyrene. Denne protokollen alene gir ingen informasjon om migrerende historie T-celler.
I tillegg til infeksjoner kan eventuelle nyremålrett rettet mot immunresponser, inkludert autoimmune responser indusere differensiering av en betydelig undergruppe av nyre-resident T-celler kan studeres ved hjelp av en lignende protokoll. Videre, som beskrevet før12,kan denne protokollen enkelt endres for å bruke anti-CD45 antistoff (for å merke alle hematopoetiske celler) for å studere andre nyre-resident immunceller. Sammen demonstrerte vi en relativt praktisk måte å isolere og analysere CD8+ T-celler fra nyrene, som kan tilpasses ulike modeller, inkludert infeksjon og autoimmunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante økonomiske avsløringer.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av NIH tilskudd AI125701 og AI139721, Cancer Research Institute CLIP program og American Cancer Society gi RSG-18-222-01-LIB til N.Z. Vi takker Karla Gorena og Sebastian Montagnino fra Flow Cytometry Facility. Data generert i Flow Cytometry Shared Resource Facility ble støttet av University of Texas Health Science Center i San Antonio (UTHSCSA), NIH/NCI-stipend P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] ved UTHSCSA) og UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
