Summary
病毒感染后，肾脏含有相对大量的CD8+T 细胞，并提供一个机会来研究非粘膜TRM 细胞。在这里，我们描述了一个方案，分离小鼠肾淋巴细胞流动细胞学分析。
Abstract
组织驻留记忆T细胞（TRM）是免疫学研究领域的一个迅速扩展的领域。将T细胞从各种非淋巴组织中隔离是研究T RM s的关键步骤之一。不同器官的淋巴细胞分离方案有轻微的变异。肾脏是一种重要的非淋巴器官，具有许多免疫细胞渗透，尤其是在病原体暴露或自身免疫激活之后。近年来，包括我们自己的实验室已经开始在小鼠和人类的各种生理和病理环境中对肾脏居民CD8+T 细胞进行特征化。由于T淋巴细胞的丰富，肾脏是一个有吸引力的模型器官，研究TRM在非粘膜或非屏障组织。在这里，我们将描述一个协议，常用在TRM为重点的实验室，以分离CD8+T 细胞从小鼠肾脏后，全身病毒感染。简单地说，在C57BL/6小鼠中，使用急性淋巴细胞性胆囊炎病毒（LCMV）感染模型，我们演示血管内CD8+T 细胞标记、酶消化和密度梯度离心，以分离和丰富小鼠肾脏中的淋巴细胞，使样本为随后的流动囊细胞分析做好准备。
Introduction
组织居民记忆 （TRM） T 细胞是成年人类和受感染小鼠中最丰富的 T 细胞群之一.TRM细胞提供免疫防御的第一线，并严重参与各种生理和病理过程1，2，3，4，5。与循环T细胞相比，TRM细胞携带独特的表面标记与独特的转录程序6，7，8。扩大我们对TRM生物学的了解是了解T细胞反应的关键，而T细胞反应对于T细胞疫苗和免疫疗法的未来发展至关重要。
除了在所有非淋巴组织中共同共享的TRM分子标记外，积累的证据表明，组织特异性特征是TRM 生物学9的核心成分。肾脏在感染后含有许多免疫细胞，包括TRM 细胞，为研究非粘膜组织中TRM 细胞生物学提供了绝佳的机会。急性LCMV（淋巴细胞性胆囊炎病毒）通过内皮内途径感染是研究小鼠抗原特异性T细胞反应的成熟系统感染模型。感染通常在野生型小鼠的7-10天内解决，并在各种组织中留下大量的LCMV特异性记忆T细胞，包括肾脏10。P14 TCR（T细胞受体）转基因小鼠携带CD8+T 细胞，可识别由MHC-I（I类主要组织相容性复合物）分子H2-D b在C57BL/6小鼠 中呈现的LCMV免疫显性表一。结合在小鼠中结合标记的P14 T细胞收养转移和LCMV感染，CD8+效应 和记忆T细胞被跟踪，包括TRM 分化和平衡。
在某些屏障组织中，如肠道内腹淋巴细胞（IEL）隔间和唾液腺，建立的淋巴细胞分离程序产生高百分比的TRM细胞 与最小的血性T细胞污染在小鼠LCMV模型11。然而，在非屏障组织中，如肾脏，密集的血管网络中含有大量的循环CD8+T 细胞。有据可查，即使成功灌注也不能有效去除所有循环的CD8+T 细胞。为了克服这一技术障碍，血管内抗体染色已确立为T RM实验室12中最常用的 技术之一。简言之，在安乐死前3-5分钟，静脉注射3微克/小鼠抗CD8抗体（给CD8+T 细胞贴标签）。完整的血管壁可防止抗体在如此短的时间内（即3-5分钟）快速扩散，并且只有血管内细胞被标记。按照标准的淋巴细胞分离方案，血管内细胞与血管外细胞可以很容易地区分使用流细胞学。
在这里，我们将描述一个标准协议，常用在TRM 实验室执行血管内标签，淋巴细胞分离和流动细胞分析肾脏CD8+ T细胞使用C57BL/6小鼠，已收到CD45.1+ P14 T细胞和LCMV感染30天前13。相同的协议可用于研究肾脏中的效应器和记忆T细胞。
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Protocol
所有按照本协议进行的动物实验都必须得到相关机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。此处描述的所有程序都已由 IACUC UT 健康圣安东尼奥批准。
1. P14 T细胞的采用性转移至C57BL/6接受者和LCMV感染
- 在6-12周大时使用P14小鼠。确保捐赠P14 TCR转基因小鼠的性别应与C57BL/6受接受小鼠的性别相匹配。否则，雄性T细胞等细胞转移到雌性小鼠中，将在12天14左右导致循环供体T细胞的免疫调节排斥。
- 按照制造商的协议，使用 小鼠CD8+T 细胞纯化套件，从P14 TCR转基因小鼠的脾脏和淋巴结中纯化天真的CD8 + T细胞。
- 简单地说，解剖脾脏和淋巴结，捣碎样品，产生单细胞悬浮液。
- 为了丰富天真的T细胞，在第一个抗体孵育步骤13中加入生物素-抗CD44抗体。
注：本步骤中使用的负选择商业试剂盒包含两个主要组件，用于两个步骤的孵育（即生物素-抗体混合物孵化和链球蛋白-磁珠孵育）。
- 使用血细胞计计算细胞数，通过尾静脉将 1，000 至 10，000 个纯化 P14 T 细胞注射到每个性别匹配的 C57BL/6 接受者中。
注：步骤2中描述了详细的尾静脉注射方案。 - 第二天，所有C57BL/6接收者将收到2 x 105 pfu LCMV阿姆斯特朗稀释在200μL的PBS通过内丙酮路线。
2. CD8 + T细胞的血管 内标记
注：根据研究兴趣，感染后可以选择不同的时间点。演示了感染后第 30 天（步骤 1.4 后第 30 天）的示例，这通常被视为 CD8 T 细胞反应的早期记忆时间点。
- 在PBS中稀释生物素抗CD8+抗体至15μg/mL。确保每只小鼠获得含有3μg抗体的200μLPBS。
注：这里使用生物素抗CD8抗体，以便更灵活地设计最终的FACS染色面板。荧光染料标记抗体可直接使用。然而，重要的是使用不同的克隆单克隆单克隆的静脉贴标与FACS染色。 - 用架空热灯适当加热小鼠的尾静脉 5-10 分钟，以扩张静脉。
注：必须格外小心，防止动物过热。如果鼠标停止移动，请减少热量或取出热灯。 - 将 200 μL 的预稀释抗 CD8® 抗体混合物抽入 100 U 胰岛素注射器 （28G），通过上下移动活塞去除任何气泡。弯曲针头，在针头和注射器之间形成150°角，斜向上，使针头平行于静脉。
- 用适当大小的啮齿动物抑制剂抑制小鼠，用70%乙醇喷洒尾巴，使静脉清晰可见。
注：限制的持续时间应保持在最低限度。 - 用非显性手的拇指和中指将尾巴握在端端。将食指放在插入针头的站点下方。
- 用主导手握住注射器，将针头平行插入静脉，向心脏方向连接。
注：正确放置时，针头应平稳地进入静脉。 - 通过尾静脉缓慢注射200μL的抗CD8+抗体。
注：如果在尾部的针头上方有阻力或有白色区域，则针头不在静脉内。在靠近尾部附近开始初始喷射。必要时，向尾底前进，进行后续注射。 - 取出针头并轻轻涂抹压缩，直到出血停止。
- 将鼠标返回到笼子，并在 3-5 分钟后对鼠标实施安乐死。
注：小鼠应通过同氟室安乐死，然后进行宫颈脱位。其他方法，如CO2 吸入将长达5分钟，并可能引入不必要的静脉抗体标记时间变化。 - 用剪刀解肾，将整个肾脏转移到1.5 mL的微离心管中，将样品留在冰上，直到进一步处理。
注：完整的肾脏可以安全地储存在冰上几个小时，然后进行后续处理和消化。
3. 肾脏酶消化
- 准备6个井板含有3mL的消化液（RPMI/2%FCS/1毫克/毫升胶原酶B），每只老鼠，储存在冰上。
注：可以较高浓度（例如20倍）准备并储存在-20°C或以下的库存胶原酶B溶液。 工作解决方案应准备新鲜。有关当前协议中使用的所有解决方案/缓冲区的配方，请参阅表1。 - 将 300 μL 的消化液加入 1.5 mL 微离心样品管中，用直弹簧剪刀将肾脏样品切碎。
注：肾脏组织应切成直径不超过1.5毫米的均匀碎片。无需斩首步骤。 - 将切碎的肾脏样本转移到含有消化液的 6 个井板
注：6个井板仅在需要处理多个样品时才用于方便。 - 在37°C下用轻轻的摇摆（约60转/分）孵育样品45分钟。
- 消化后，将组织与3 mL注射器的柱塞法兰直接捣碎，并转移到15 mL锥形管中。
注：通常不需要通过细胞过滤器过滤，因为密度梯度离心是在旁边进行，以净化活淋巴细胞。 - 在 4 °C 下，以 500 x g 旋转样品 5 分钟。
- 将颗粒在 3 mL 的 RPMI/10% FCS 中重新暂停。
4. 密度梯度离心，从消化的肾脏丰富淋巴细胞
- 在 4°C 下以 500 x g 旋转样品 5 分钟。
- 取出上一液，用 5 mL 的 44% Percoll/RPMI 混合物重新暂停细胞颗粒（44% Percoll = 56% RPMI，不带 FBS）。
- 将含有 67% Percoll/PBS（67% Percoll = 33% PBS） 的 3 mL 移液器的尖端直接放在每个管的底部，然后缓慢释放溶液，使重溶液（67% Percoll/PBS）在底部形成一个独特的层，并升起光溶液（44% Percoll/RPMI）。一起，鸡尾酒层将形成。
注：对于供应商新到达的密度梯度介质，向瓶子中加入 1/10 体积无菌 10 倍 PBS，混合均好，并将 PBS 平衡密度梯度介质视为 100% 溶液。 - 在室温下以 900 x g 旋转样品 20 分钟，并降低油门和制动器设置。
注：对于具有油门和制动器设置的离心机（刻度为 1-9（最小 1 表示最小和最大 9 表示最大），请使用 6 表示油门，使用 4 表示制动器。 - 小心地从离心机取出管子，而不干扰层;
注：在粉红色 RPMI 层和无色 PBS 层之间标识清晰的淋巴细胞层。 - 无需接触淋巴细胞层，即可用转移移液器去除顶层。
- 将淋巴细胞层转移到新的 15 mL 管中，用 PBS/5% FCS 填充管，然后缓慢地反转管 4-6 倍，以确保充分混合。
注意：此步骤对于洗掉任何残留的 Percoll 非常重要。 - 在 4 °C 下，以 500 x g 旋转样品 5 分钟。
- 拆下上一液，用 500 μL 的完整 RPMI 介质重新悬浮细胞颗粒。细胞已准备好流动细胞测量染色。
5. 流式细胞测量染色和分析
注：请遵循T淋巴细胞的标准流细胞测量染色方案。
- 每次 FACS 染色大约 1 x10 6 个细胞。
注：使用 U 底部 96 井板进行 FACS 染色。但是，如果只涉及有限数量的样品，也可以使用 5 mL FACS 管。 - 在 4 °C 下以 500 x g 旋转细胞 5 分钟。 丢弃上一杯。
- 将每个样品重新在含有 2.4G2 FcR 阻滞剂 10 μg/mL 的 FACS 缓冲液中重新发送每个样品（一种抗 CD16/32 单克隆抗体，以阻止添加的 FACS 抗体与 FcR 的相互作用）。在冰上孵育15分钟。
- 无需进一步离心，为每个样品添加 50 μL 的表面染色抗体混合物，使最终染色量为 100 μL/每个样品。在黑暗中在冰上孵育30分钟。
注：在抗体混合物中加入荧光标记的链球菌素（2 μg/mL或遵循制造商的建议），以标记CD8++血管 内CD8+T 细胞，并使用荧光标记的抗CD8+抗体标记所有CD8 T细胞。抗体混合物通过向FACS缓冲液中加入所需数量的有关抗体来制造。 - 用 PBS 清洗样品两次。每次洗涤时，用冷 PBS 填充 96 孔板的孔，在 4°C 下以 500 x g 旋转 5 分钟，然后丢弃上清液。
- 将细胞重新用100μL/井中稀释的活/死亡染料中重新暂停。在黑暗中在冰上孵育30分钟。
注：即使具有密度梯度介质自旋，酶消化步骤也经常由于 ARTC2.2/P2RX7 信号15而诱发组织驻留 T 细胞中显著的细胞死亡。在固定之前，强烈建议使用活/死染料染色。抗 ARTC2 纳米体可以在安乐死前进入小鼠体内，以防止细胞隔离引起的细胞死亡。 - 用 FACS 缓冲液清洗样品两次。每次洗涤时，用冷 FACS 缓冲液填充 96 孔板的孔，在 4 °C 下以 500 x g 旋转 5 分钟，然后丢弃上清液。
- 将细胞重新在100μL/井固定缓冲液中。在37°C下孵育10分钟。
注：固定缓冲液是通过将甲醛用PBS稀释到最终浓度为2%甲醛而新鲜制作的。 - 用 FACS 缓冲液清洗样品两次。每次洗涤时，用冷 FACS 缓冲液填充 96 孔板的孔，在 4 °C 下以 500 x g 旋转 5 分钟，然后丢弃上清液。
- 将细胞重新在250μL/井FACS缓冲液中。密封板，储存在4°C，防止光线，直到FACS分析。
注：在 FACS 分析之前，通过 70 μM 尼龙网过滤样品，以去除可能堵塞 FACS 机器的细胞簇。
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Representative Results
此处描述的协议在流程图中汇总（图1A）。在LCMV感染后的第30天，我们进行了CD8+T细胞的血管内标记。5分钟后，动物的两个肾脏被解剖，切碎，并受到胶原酶消化。淋巴细胞通过 Percoll 离心从消化的样品中进一步纯化，并通过流式细胞学进行分析。如图1B所示，即使在密度离心-中继淋巴细胞富集之后，在最终产品中看到大量非淋巴细胞也是很常见的。然而，在对活淋巴细胞进行浇注后，很容易识别CD8+T淋巴细胞。我们可以区分血管内与血管外CD8+ T细胞。由于CD8+和CD8+在CD8+T细胞上具有高度相关的表达模式，预计血管内CD8+T细胞在CD8+-CD8+FACS配置文件上表现出对角线模式。正如预期的那样，只有血管外CD8+T细胞有效获得TRM表型，如CD69的上调节和Ly6C的降低调节（图1B）。在我们的实验中，我们对具有致源标记CD45.1的供体P14T细胞感兴趣。使用相同的协议，内源主机派生CD8+ T细胞也可以检查。与受感染的小鼠相比，从SPF设施中幼鼠中分离出的绝大多数CD8+T细胞都标有 i.v. CD8+ 抗体，因此属于血管内隔间（图1C）。
图1：代表性结果。
（A） 协议的流程图。（B） 感染后第30天，通过流动细胞学分析肾脏淋巴细胞。显示了具有代表性的 FACS 配置文件和浇注策略。这些数字表示其父群体中封闭子集的百分比。（C） 从天真小鼠分离的肾脏CD8+T 细胞的代表性FACS配置文件。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 试剂 | 食谱 | 注意 |
| 100% 佩尔科尔 | 9 卷 Percoll = 1 卷 10xPBS | |
| 44% 佩尔科尔/RPMI | 44% Vol 100% Percoll = 56% Vol 血清无性 RPMI | 从 100% 佩尔科尔新鲜 |
| 67% 佩尔科尔/PBS | 67% Vol 100% Percoll = 33% Vol PBS | 从 100% 佩尔科尔新鲜 |
| 消化缓冲液 | RPMI = 2% FCS = 1mg/ml 胶原酶 B | 新鲜从胶原酶股票 |
| PBS/5% FCS 洗涤缓冲液 | PBS = 5% FCS | |
| FACS 缓冲区 | PBS = 2% FCS = 0.02% Nan3 | 储存在4°C |
| 修复缓冲区 | PBS = 2% 甲醛 | 储存在RT，防止光线 |
表 1：当前协议中使用的所有解决方案和缓冲区的配方列表。
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Discussion
由于组织特异性免疫是一个快速扩展的研究领域，积累证据表明，免疫细胞，特别是淋巴细胞种群可以在成人人类或受感染或免疫小鼠的几乎所有器官中识别。LCMV小鼠感染模型是研究抗原特异性T细胞反应、效应和记忆T细胞分化（包括TRM生物学在内的多个组织） 的成熟模型。在这里，我们描述了一个分析肾中的CD8+T 细胞的协议。该协议在很大程度上改编自以TRM12为重点的出版物。据推测，由于高水平的P2RX7表达和酶消化诱导细胞死亡15，淋巴细胞从目前的方案产生最适合立即表型分析。然而，通过建立抑制P2RX7诱导细胞死亡的协议16，可以设想，目前的协议可以很容易地修改（例如，添加抑制剂，以阻止P2RX7信号），以增加细胞存活率，并适合其他长期功能测定。应包括适当的对照组，以确保P2RX7抑制剂不干扰感兴趣的功能测定。
肾脏 CD8+ T RM细胞主要产生于感染或环境抗原。我们使用血管内标签协议直接分析从5-6周大的天真C57BL/6小鼠分离的肾脏CD8+T细胞。与公布的结果17一致，这些"干净"小鼠中几乎没有血管外CD8+T细胞（图1C）。一项高雅的研究表明，在非淋巴组织中识别的大多数记忆CD8+T细胞是TRM10。相比之下，使用类似的感染系统，我们经常检测大量的CD69 - 细胞（最有可能代表TEM细胞或CD69-T RM细胞），即使在血管外隔间。这种差异可能是由于使用不同的技术，即显微镜与流式细胞仪;2） 早期与后期内存时间点是聚焦的，3） CD69 不是识别 T RM 的完美标记。酶消化和流动细胞学将明显低于T RM细胞的总数。然而，作为一种方便和非劳动密集型的协议，它仍然被大多数TRM研究普遍接受。
明确识别TRM细胞的黄金 标准是进行寄生虫实验。虽然此处描述的协议提供了识别肾脏驻留T细胞的便捷方法，但该协议的结果只能证明，在小鼠安乐死时，T细胞位于肾脏的血管外。该协议本身没有提供有关T细胞的迁移历史的任何信息。
除了感染，任何肾脏瞄准免疫反应，包括自身免疫反应可能诱导肾居民T细胞的一部分分化可以使用类似的协议研究。此外，如12号前所述，该协议可以很容易地修改，以使用抗CD45抗体（标记所有造血细胞）来研究其他肾居民免疫细胞。我们一起演示了一种相对方便的方法，从肾脏分离和分析CD8+T 细胞，它可以适应各种模型，包括感染和自身免疫。
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Disclosures
提交人没有相关的财务披露。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH赠款AI125701和AI139721，癌症研究所剪辑计划和美国癌症协会赠款RSG-18-222-01-LIB到N.Z的支持。我们感谢来自流细胞测量设施的卡拉·戈雷纳和塞巴斯蒂安·蒙塔尼诺。在流量细胞学共享资源设施中生成的数据得到位于圣安东尼奥的德克萨斯大学健康科学中心（UTHSCSA）、NIH/NCI赠款P30 CA054174-20（UTHSCSA的临床和转化研究中心[CTRC]）和UL1 TR001120（临床和转化科学奖）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
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