Summary
Na virale infectie, nier herbergt een relatief groot aantal CD8+ T cellen en biedt een kans om niet-mucosale TRM cellen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om muisnierlymfocyten te isoleren voor stromingscytometrieanalyse.
Abstract
Tissue-resident memory T cell (TRM)is een snel groeiend gebied van immunologie onderzoek. Het isoleren van T-cellen uit verschillende niet-lymfeweefsels is een van de belangrijkste stappen om TRMs te onderzoeken. Er zijn lichte variaties in lymfocyten isolatie protocollen voor verschillende organen. Nier is een essentieel niet-lymfoïde orgaan met tal van immuuncelinfiltratie vooral na blootstelling aan ziekteverwekkers of auto-immuunactivatie. In de afgelopen jaren zijn meerdere laboratoria, waaronder onze eigen, begonnen met het karakteriseren van nierbewoner CD8+ T-cellen in verschillende fysiologische en pathologische omgevingen in zowel muis als mens. Door de overvloed aan T-lymfocyten, nier vertegenwoordigt een aantrekkelijk model orgaan om TRMs studie in niet-mucosale of niet-barrièreweefsels. Hier zullen we een protocol beschrijven dat vaak wordt gebruikt in TRM-gerichtelaboratoria om CD8+ T-cellen te isoleren van muizennieren na systemische virale infectie. Kortom, met behulp van een acuut lymfatisch choriomeningitisvirus (LCMV) infectiemodel in C57BL/6 muizen, tonen we intravasculaire CD8+ T-cellabeling, enzymatische spijsvertering en dichtheidgradiëntcentrifugatie aan om lymfocyten te isoleren en te verrijken van muizennieren om monsters klaar te maken voor de daaropvolgende stromingscytometry-analyse.
Introduction
Weefsel-resident geheugen (TRM)T-cellen vertegenwoordigen een van de meest voorkomende T-cel populaties in volwassen menselijke en geïnfecteerde muizen. TRM cellen bieden de eerste lijn van immuunafweer en zijn kritisch betrokken bij verschillende fysiologische en pathologische processen1,2,3,4,5. Vergeleken met circulerende T-cellen, TRM cellen dragen verschillende oppervlakte markers met unieke transcriptie programma's6,7,8. Het uitbreiden van onze kennis van TRM biologie is de sleutel tot het begrijpen van T-celreacties die essentieel is voor de toekomstige ontwikkeling van T-celgebaseerde vaccins en immunotherapieën.
Naast de algemeen gedeelde moleculaire markers van TRMs in alle niet-lymfeweefsels, accumuleren bewijs suggereren dat weefsel-specifieke kenmerken zijn een centrale component van TRM biologie9. Nier herbergt veel immuuncellen, waaronder TRM cellen na infectie en biedt een geweldige kans om TRM celbiologie te bestuderen in een niet-mucosale weefsel. Acute LCMV (lymfatische choriomeningitis virus) infectie via intraperitoneale route is een gevestigde systemische infectie model om antigeen-specifieke T-cel reacties bij muizen te bestuderen. De infectie wordt meestal opgelost in 7-10 dagen in wilde type muizen en laat een groot aantal LCMV-specifieke geheugen T cellen in een verscheidenheid van weefsels, waaronder de nier10. P14 TCR (T cel receptor) transgene muizen dragen CD8+ T cellen herkennen een van de immuun-dominante epitopen van LCMV gepresenteerd door MHC-I (klasse I grote histocompatibiliteit complex) molecuul H2-Db in C57BL/6 muizen. Het combineren van congenisch gemarkeerde P14 T-cel adoptieve overdracht en LCMV-infectie bij muizen, CD8+ effector en geheugen T-cellen worden bijgehouden, inclusief TRM-differentiatie en homeostase.
In sommige barrièreweefsels, zoals darm intraepitheliale lymfocyten (IEL) compartiment en speekselklieren, gevestigde lymfocyte isolatie procedure levert een hoog percentage van TRM cellen met minimale door bloed overgedragen T-cel besmetting in de muis LCMV model11. Echter, in niet-barrièreweefsels, zoals de nier, dicht vasculaire netwerk bevat een groot aantal circulerende CD8+ T cellen. Het is goed gedocumenteerd dat zelfs succesvolle perfusie niet efficiënt alle circulerende CD8+ T cellen kan verwijderen. Om deze technische hindernis te overwinnen, intravasculaire antilichaam kleuring is vastgesteld als een van de meest gebruikte technieken in TRM labs12. Kortom, 3-5 minuten voor euthanasie wordt 3 μg/muis anti-CD8 antilichaam (label CD8+ T cellen) intraveneus geleverd. Intacte bloedvatwand voorkomt snelle verspreiding van het antilichaam binnen deze korte periode (d.w.z. 3-5 minuten) en alleen intravasculaire cellen worden gelabeld. Volgens het standaard protocol voor lymfocytenisolatie kunnen intravasculaire versus extravasculaire cellen gemakkelijk te onderscheiden worden met behulp van stroomcytometrie.
Hier zullen we een standaardprotocol beschrijven dat vaak wordt gebruikt in TRM-laboratoria om intravasculaire etikettering, lymfocytenisolatie en stroomcytometrieanalyse van nier-CD8+ T-cellen uit te voeren met behulp van een C57BL/6-muis die 30 dagen voor13cd45.1+ P14 T-cellen en LCMV-infectie heeft ontvangen. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om zowel effector als geheugen T-cellen in de nier te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven die volgens dit protocol worden uitgevoerd, moeten worden goedgekeurd door het desbetreffende Comité voor institutionele dierverzorging en -gebruik (IACUC). Alle hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door IACUC UT Health San Antonio.
1. Adoptieoverdracht van P14 T-cellen naar C57BL/6-ontvangers en LCMV-infectie
- Gebruik P14 muizen op 6-12 weken oud. Zorg ervoor dat het geslacht van donor P14 TCR transgene muis moet overeenkomen met het geslacht van C57BL/6 ontvanger muizen. Anders zullen cellen zoals mannelijke T-cellen die overgaan op vrouwelijke muizen resulteren in immuungemedieerde afstoting van circulerende donor T-cellen in ongeveer 12 dagen14.
- Zuiver naïeve CD8+ T-cellen uit de milt en lymfeklieren van een P14 TCR transgene muis met behulp van muis CD8+ T-celzuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant.
- Kort, ontleden milt en lymfeklieren, mash de monsters om eencellige suspensie te genereren.
- Om te verrijken voor naïeve T-cellen, voeg biotine-anti-CD44 antilichaam tijdens de eerste antilichaam incubatie stap13.
OPMERKING: Negatieve selectie commerciële kit gebruikt in deze stap bevat twee belangrijke componenten voor twee stappen van incubatie (dat wil zeggen, biotine-antilichaam mengsel incubatie en streptavidin-magnetische kraal incubatie).
- Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen en 1.000 tot 10.000 gezuiverde P14 T-cellen in 200 μL PBS te injecteren in elk geslacht dat overeenkomt met C57BL/6-ontvanger via de staartader.
OPMERKING: Gedetailleerd staartaderinjectieprotocol wordt beschreven in stap 2. - Op de volgende dag ontvangen alle C57BL/6 ontvangers 2 x 105 pfu LCMV Armstrong verdund in 200 μL PBS via een intraperitoneale route.
2. Intravasculaire etikettering van CD8+ T-cellen
LET OP: Afhankelijk van de onderzoeksinteresses kunnen na een infectie verschillende tijdstippen worden gekozen. Een voorbeeld van dag 30 na infectie (dag 30 na stap 1.4) wordt aangetoond, die vaak wordt beschouwd als een vroeg geheugen tijdpunt voor CD8 T celrespons.
- Verdun biotine anti-CD8α antilichaam tot 15 μg/mL in PBS. Zorg ervoor dat elke muis 200 μL PBS krijgt met 3 μg antilichaam.
OPMERKING: Biotine anti-CD8 antilichaam wordt hier gebruikt, zodat het flexibeler zal zijn om het uiteindelijke FACS-kleurplaat te ontwerpen. Fluorescerend kleurstof-gelabeld antilichaam kan direct worden gebruikt. Het is echter belangrijk om verschillende klonen van monoklonale antilichamen te gebruiken voor intraveneuze etikettering versus FACS-kleuring. - Verwarm de staartader van muizen goed met een bovengrondse warmtelamp gedurende 5-10 minuten om de aderen te verwijden.
LET OP: Er moet extra op worden gelet om oververhitting van de dieren te voorkomen. Verlaag het vuur of verwijder de warmtelamp als de muizen stopten om te bewegen. - Teken 200 μL voorverdund anti-CD8α antilichaam mix in een 100 U insulinespuit (28G) en verwijder eventuele luchtbellen door het bewegen van de zuiger op en neer. Buig de naald om een hoek van 150° tussen de naald en de spuit te creëren, schuine kant op, zodat de naald parallel aan de ader zal zijn.
- Beperk de muis met een knaagdier restrainer van de juiste grootte en spray de staart met 70% ethanol om de ader duidelijk zichtbaar te maken.
LET OP: De duur van de terughoudendheid moet tot een minimum worden beperkt. - Houd de staart aan het distale uiteinde met duim en middelvingers van de niet-dominante hand. Plaats de wijsvinger onder de plaats waar de naald zal worden ingevoegd.
- Houd de spuit met de dominante hand vast en steek de naald parallel in de ader naar de richting van het hart.
LET OP: Bij het correct plaatsen moet de naald soepel in de ader bewegen. - Injecteer langzaam 200 μL anti-CD8α antilichaam via de staartader.
OPMERKING: Als er een weerstand is of een wit gebied boven de naald op de staart wordt gezien, zit de naald niet in de ader. Start de eerste injectie dicht bij het puntje van de staart. Ga indien nodig naar de onderkant van de staart voor volgende injecties. - Verwijder de naald en breng compressie voorzichtig aan tot het bloeden stopt.
- Breng de muis terug naar de kooi en euthanaseer de muis na 3-5 min.
OPMERKING: De muizen moeten worden geëuthanaseerd via isoflurane kamer gevolgd door cervicale dislocatie. Andere methoden, zoals CO 2-inademing, duren maximaal 5 minuten en kunnen onnodige variatie van intraveneuze antilichaametiketteringstijd introduceren. - Ontleden de nier met een schaar, breng de hele nier over naar 1,5 mL microcentrifugebuizen en laat de monsters op ijs tot verdere verwerking.
OPMERKING: Intacte hele nier kan veilig worden opgeslagen op ijs voor een paar uur voor de daaropvolgende verwerking en spijsvertering.
3. Enzymatische vertering van de nier
- Bereid 6 putplaten met 3mL van de spijsverteringsoplossing (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Collagenase B) voor elke muis, op te slaan op ijs.
LET OP: Stock collagenase B-oplossing bij hogere concentratie (bijvoorbeeld 20x) kan worden bereid en opgeslagen bij of onder -20°C. De werkoplossing moet vers worden bereid. Zie tabel 1 voor de recepten voor alle oplossing/buffer die in het huidige protocol wordt gebruikt. - Voeg 300 μL vergistingsoplossing toe aan de 1,5 mL microcentrifugemonsterbuizen en maak de niermonsters gehakt met een rechte veerschaar.
OPMERKING: Het nierweefsel moet worden gehakt in zelfs stukken met een grootte van niet groter dan 1,5 mm in diameters. Er is geen decapsulatiestap vereist. - Breng de gehakte niermonsters over op 6 putplaten met de spijsverteringsoplossing
LET OP: 6 goed platen worden gebruikt voor het gemak alleen wanneer er meerdere monsters worden verwerkt. - Broed de monsters op 37 °C met zacht schommelen (ongeveer 60 rpm) gedurende 45 min.
- Pureer na de spijsvertering het weefsel met de zuigerflens van een spuit van 3 mL direct in de schotel en breng het over in 15 mL conische buizen.
OPMERKING: Meestal is filtratie door een celzeef niet nodig bij deze stap, omdat dichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt uitgevoerd naast het zuiveren van levende lymfocyten. - Draai de monsters 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C naar beneden.
- Resuspend de pellet in 3 mL rpmi/10% FCS.
4. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie om lymfocyten te verrijken van de verteerde nier
- Draai het monster 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C naar beneden.
- Verwijder de supernatant en resuspend de celpellet met 5 mL van 44% Percoll/RPMI mix (44% Percoll + 56% RPMI zonder FBS).
- Plaats de punt van een 3 mL pipet met 3 mL van 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) direct aan de onderkant van elke buis, en laat de oplossing langzaam los, zodat de zware oplossing (67% Percoll/PBS) een aparte laag aan de onderkant vormt en de lichtoplossing (44% Percoll/RPMI) wordt verhoogd. Samen zullen cocktaillagen vormen.
OPMERKING: Voor nieuw aangekomen dichtheidsgradiënt medium van de leverancier, voeg 1/10 volume steriele 10x PBS toe aan de fles, meng goed en overweeg het PBS-gebalanceerde dichtheidsgradiëntmedium als 100% oplossing. - Draai de monsters 20 minuten op kamertemperatuur met minder gas en remstand op 900 x g.
LET OP: Voor centrifuges met gas- en reminstellingen (op een schaal van 1-9 (1 betekent minimum en 9 betekent maximaal)), gebruik 6 voor gaspedaal en 4 voor rem. - Verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge zonder de lagen te storen;
OPMERKING: Een duidelijke lymfocytenlaag wordt geïdentificeerd tussen de RPMI-laag met roze kleur en de kleurloze PBS-laag. - Verwijder de bovenste laag met een transferpipet zonder de lymfocytenlaag aan te raken.
- Breng de lymfocytenlaag over op een nieuwe 15 mL buis, vul de buis met PBS/5% FCS en meng door de buis 4-6x langzaam om te keren om voldoende te mengen.
LET OP: Deze stap is belangrijk om eventuele resten percoll uit te wassen. - Draai de monsters 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C naar beneden.
- Verwijder de supernatant en schort de celpellet opnieuw op met 500 μL volledig RPMI-medium. De cellen zijn klaar voor flow cytometrie vlekken.
5. Flow cytometrie kleuring en analyse
LET OP: Volg het standaard cytometrie-kleuringsprotocol voor T-lymfocyten.
- Neem ongeveer 1 x 106 cellen voor elke FACS kleuring.
LET OP: Gebruik een U-bottom 96 putplaat voor FACS-vlekken. Als het echter slechts om een beperkt aantal monsters gaat, kunnen er ook 5 mL FACS-buizen worden gebruikt. - Draai de cellen 500 x g 5 min naar beneden bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
- Resuspend elk monster in 50 μL FACS buffer met 10 μg/mL van 2.4G2 FcR blocker (een anti-CD16/32 monoklonale antilichaam om de interactie tussen toegevoegde FACS-antilichamen met FcR te blokkeren). Incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
- Voeg zonder verdere centrifugatie voor elk monster 50 μL oppervlaktevlekkende antilichaammengsels toe, zodat het uiteindelijke kleurvolume 100 μL/elk monster bedraagt. Incubeer op ijs voor 30 minuten in het donker.
OPMERKING: Neem fluorescerend gelabelde streptavidin (2 μg/mL of volg de aanbeveling van de fabrikant) op in het antilichaammengsel om CD8α+ intravasculaire CD8+ T-cellen te etiketteren en gebruik fluorescerende anti-CD8β-antilichaam om alle CD8 T-cellen te labelen. Antilichaam mengsel wordt gemaakt door het toevoegen van de gewenste hoeveelheden van geïnteresseerde antilichamen in de FACS buffer. - Was de monsters twee keer met PBS. Vul voor elke wasbeurt de putten van 96 putplaat met koude PBS, draai 5 min g op 5 min bij 4 °C en gooi de supernatant weg.
- Resuspend de cellen in 100 μL/well van verdunde levende/doodsverf. Incubeer op ijs voor 30 minuten in het donker.
OPMERKING: Zelfs met dichtheid gradiënt medium spin, enzymatische spijsvertering stap induceert vaak aanzienlijke celdood in weefsel-ingezeten T-cellen als gevolg van ARTC2.2/P2RX7 signalering15. Live / dood kleurstof vlekken wordt sterk aanbevolen voor fixatie. Anti-ARTC2 nanobody kan worden beheerd in de muizen voor euthanasie om celisolatie-geïnduceerde cel dood te voorkomen. - Was de monsters twee keer met FACS buffer. Vul voor elke wasbeurt de putten van de 96-putplaat met koude FACS-buffer, draai 5 minuten op 500 x g bij 4 °C en gooi de supernatant weg.
- Resuspend de cellen in 100 μL/well fixing buffer. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten.
OPMERKING: De bevestigingsbuffer wordt vers gemaakt door formaldehyde met PBS te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 2% formaldehyde. - Was de monsters twee keer met FACS buffer. Vul voor elke wasbeurt de putten van 96 putplaat met koude FACS-buffer, draai 5 min g op 5 min bij 4 °C en gooi de supernatant weg.
- Resuspend de cellen in 250 μL/well FACS buffer. Verzegel de plaat, bewaar op 4 °C en bescherm tegen licht tot facs-analyse.
OPMERKING: Voordat FACS-analyse wordt geanalyseerd, filtert u de monsters door een nylon gaas van 70 μM om mogelijke celclusters te verwijderen die de FACS-machine kunnen verstoppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol wordt samengevat in een stroomdiagram(figuur 1A). Op dag 30 na LCMV infectie, voerden we intravasculaire etikettering van CD8+ T cellen. 5 minuten later werden beide nieren van het dier ontleed, gehakt en onderworpen aan collagenase spijsvertering. Lymfocyten werden verder gezuiverd uit de verteerde monsters via Percoll centrifugatie en geanalyseerd door stroomcytometrie. Zoals blijkt uit figuur 1B, zelfs na dichtheid centrifugatie-gemedieerde lymfocyten verrijking, was het heel gebruikelijk om een groot deel van de niet-lymfocyten in het eindproduct te zien. Echter, na gating op levende lymfocyten, was het gemakkelijk om CD8+ T lymfocyten te identificeren. We kunnen onderscheid maken tussen intravasculaire vs extravasculaire CD8+ T cellen. Vanwege het sterk gecorreleerverfde expressiepatroon van CD8α en CD8β op CD8+ T-cellen, wordt verwacht dat intravasculaire CD8+ T-cellen een diagonaal patroon vertonen op cd8α-CD8β FACS-profiel. Zoals verwacht, alleen extravasculaire CD8+ T-cel efficiënt verworven TRM fenotypes, zoals upregulatie van CD69 en downregulatie van Ly6C (Figuur 1B). In onze experimenten waren we geïnteresseerd in donor P14 T-cellen met congene marker CD45.1. Met behulp van hetzelfde protocol, endogene host afgeleid CD8+ T cellen kunnen ook worden onderzocht. In tegenstelling tot geïnfecteerde muizen, de overgrote meerderheid van cd8+ T cellen geïsoleerd van jonge naïeve muizen gehuisvest in SPF faciliteit werden gelabeld met i.v. CD8α antilichaam en, daarom, behoorde tot de intravasculaire compartiment (Figuur 1C).
Figuur 1: Representatieve resultaten.
(A) Stroomdiagram van het protocol. (B) Op dag 30 na infectie, nierlymfocyten werden geanalyseerd door de stroom cytometrie. Representatieve FACS-profielen en gatingstrategie worden getoond. De getallen geven het percentage gated subsets in hun ouderlijke bevolking aan. (C) Representatief FACS-profiel van nier-CD8+ T-cellen geïsoleerd van een naïeve muis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Reagens | Recept | Opmerking |
| 100% Percoll | 9 volumes Percoll + 1 volume van 10xPBS | |
| 44% Percoll/RPMI | 44% Vol van 100% Percoll + 56% Vol serumvrije RPMI | Vers gemaakt van 100% Percoll |
| 67% Percoll/PBS | 67% Vol van 100% Percoll + 33% Vol PBS | Vers gemaakt van 100% Percoll |
| Spijsverteringsbuffer | RPMI + 2% FCS + 1mg/ml collagenase B | Vers gemaakt van collagenase voorraad |
| PBS/5% FCS wasbuffer | PBS + 5% FCS | |
| FACS-buffer | PBS + 2% FCS + 0,02% NaN3 | Opgeslagen bij 4°C |
| Buffer herstellen | PBS + 2% formaldehyde | Opgeslagen bij RT en beschermd tegen licht |
Tabel 1: Lijst van recepten voor alle oplossingen en buffer die in het huidige protocol worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als weefsel specifieke immuniteit is een snelle groeiende gebied van onderzoek, accumuleren bewijs suggereren dat immuuncellen, vooral lymfocyten populatie kan worden geïdentificeerd in bijna alle organen in volwassen menselijke of geïnfecteerde of geïmmuniseerde muizen. LCMV muis infectie model is een gevestigde model om antigeen-specifieke T-cel respons, effector en geheugen T cel differentiatie met inbegrip van TRM biologie over meerdere weefsels te bestuderen. Hier beschreven we een protocol om CD8+ T-cellen in de nier te analyseren. Dit protocol is grotendeels aangepast van publicaties gericht op TRM12. Vermoedelijk als gevolg van hoog niveau P2RX7 expressie en enzymatische spijsvertering geïnduceerde celdood15, lymfocyten opbrengst van het huidige protocol is het meest geschikt voor onmiddellijke fenotypische analyse. Echter, met vastgesteld protocol om P2RX7 geïnduceerde celdood16te remmen, is het denkbaar dat het huidige protocol gemakkelijk kan worden gewijzigd (bijvoorbeeld met de toevoeging van remmers om P2RX7-signalering te blokkeren) om de celoverleving te verhogen en geschikt te zijn voor andere functionele testen op lange termijn. Er moeten goede controlegroepen worden opgenomen om ervoor te zorgen dat P2RX7-remmers niet interfereren met geïnteresseerde functionele tests.
Nier CD8+ TRM cellen worden grotendeels gegenereerd in reactie op infectie of milieu-antigenen. We hebben gebruik maken van intravasculaire etikettering protocol om direct te analyseren nier CD8+ T cellen geïsoleerd van 5-6-week-oude naïeve C57BL/6 muizen. In overeenstemming met gepubliceerde resultaten17, is er bijna geen extravasculaire CD8+ T cellen in deze "schone" muizen (Figuur 1C). Een elegante studie heeft aangetoond dat de meerderheid van het geheugen CD8+ T cellen geïdentificeerd in niet-lymfeweefsels zijn TRM10. In tegenstelling, met behulp van een soortgelijk infectiesysteem, detecteren we vaak een aanzienlijke populatie van CD69- cellen (waarschijnlijk vertegenwoordigen TEM cellen of CD69- TRM cellen) zelfs in het extravasculaire compartiment. De discrepantie kan te wijten zijn aan de feiten dat 1) verschillende technieken worden gebruikt, dat wil zeggen, microscoop vs flow cytometrie; 2) vroege vs late geheugen tijdpunten zijn gericht en 3) CD69 is niet een perfecte marker te identificeren TRM. Enzymatische spijsvertering en stroomcytometrie zal het totale aantal TRM-cellen aanzienlijk onderschatten. Echter, als een handige en niet-arbeidsintensieve protocol, het is nog steeds algemeen aanvaard in de meeste TRM studies.
De gouden standaard om TRM-cellen definitief te identificeren, is het uitvoeren van parabiose-experimenten. Hoewel het hier beschreven protocol een handige manier biedt om nier-ingezetenE T-cellen te identificeren, bewijzen de resultaten van dit protocol alleen dat op het moment dat de muizen worden geëuthanaseerd, de T-cellen buiten de bloedvaten in de nier wonen. Dit protocol alleen geeft geen informatie over de migratiegeschiedenis van T-cellen.
Naast infecties kunnen elke nier die zich richt op immuunreacties, inclusief auto-immuunreacties, de differentiatie van een significante subset van nier-ingezeten T-cellen veroorzaken met behulp van een vergelijkbaar protocol. Verder, zoals beschreven vóór12, kan dit protocol gemakkelijk worden gewijzigd om anti-CD45-antilichaam te gebruiken (om alle hematopoietische cellen te etiketteren) om andere nier-ingezetene immuuncellen te bestuderen. Samen demonstreerden we een relatief handige manier om CD8+ T-cellen te isoleren en te analyseren van de nier, die kan worden aangepast aan verschillende modellen, waaronder infectie en auto-immuniteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen relevante financiële informatie.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidies AI125701 en AI139721, Cancer Research Institute CLIP programma en American Cancer Society subsidie RSG-18-222-01-LIB aan N.Z. Wij danken Karla Gorena en Sebastian Montagnino van Flow Cytometry Facility. Gegevens gegenereerd in de Flow Cytometry Shared Resource Facility werden ondersteund door de University of Texas Health Science Center in San Antonio (UTHSCSA), NIH / NCI subsidie P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] op UTHSCSA), en UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
